Avaliação da inervação entérica e análise proteômica do intestino delgado de ratos expostos à dose aguda ou crônica de fluoreto

O trato gastrointestinal (TGI) é a principal rota de exposição ao fluoreto (F) e o seu mais importante sítio de absorção. Acredita-se que a toxicidade do F comprometa a fisiologia do intestino, devido à relevante sintomatologia gastrointestinal relatada em consequência da exposição excessiva ao F. A função intestinal é controlada por uma complexa rede neuronal interligada e incorporada à parede deste órgão, denominada Sistema Nervoso Entérico (SNE). Embora os efeitos tóxicos do F sobre o Sistema Nervoso Central sejam descritos na literatura, não há estudos relacionados à sua toxicidade sobre o SNE. Neste estudo realizado em ratos, foi avaliado o efeito da exposição aguda ou crônica ao F, sobre a população geral de neurônios entéricos e sobre as subpopulações que expressam os principais neurotransmissores entéricos: Acetilcolina (ACh), Óxido Nítrico (NO), Peptídeo Vasoativo Intestinal (VIP), Peptídeo Relacionado ao Gene da Calcitonina (CGRP) e Substância P (SP). Os animais foram divididos em 5 grupos: 3 destinados à exposição crônica (0 ppm, 10 ppm ou 50 ppm de F na água de beber) e 2 à exposição aguda (0 ou 25 mgF/Kg por gavagem gástrica). Foram coletados os 3 segmentos do intestino delgado (duodeno, jejuno e íleo) e processados para a detecção da HuC/D, ChAT, nNOS, VIP, CGRP e SP, através de técnicas de imunofluorescência, no plexo mioentérico. Foram obtidas imagens para a realização da análise quantitativa dos neurônios da população geral (HuC/D) e nitrérgicos (imunorreativos à nNOS); e morfométrica dos neurônios imunorreativos à HuC/D ou nNOS; e das varicosidades imunorreativas à ChAT, VIP, CGRP ou SP. Amostras dos 3 segmentos intestinais foram preparadas e coradas em Hematoxilina e Eosina para análise histológica da morfologia básica. O segmento intestinal considerado mais afetado na análise morfométrica da população geral de neurônios, o duodeno, foi selecionado para a realização da análise proteômica, com o objetivo de oferecer o seu perfil proteico e determinar diferenças na expressão proteica em decorrência da exposição crônica ou aguda ao F. A análise da concentração de F no plasma sanguíneo foi realizada para a confirmação da exposição. Na análise quantitativa, o grupo de 50 ppm F, apresentou uma diminuição significativa na densidade da população geral de neurônios do jejuno e do íleo e na densidade dos neurônios imunorreativos à nNOS no duodeno e no jejuno. Quanto à análise morfométrica, a população geral e as subpopulações neuronais entéricas avaliadas apresentaram alterações morfológicas significativas, tanto após a exposição crônica quanto a aguda. Para a análise proteômica do duodeno, verificou-se que da associação de seus genes a um termo, e assim classificadas de acordo com diferentes processos biológicos. No caso do grupo da dose aguda, o processo biológico com a maior porcentagem de genes associados foi a geração de metabólitos precursores e energia (27% das proteínas); enquanto para os grupos de 10 e 50 ppm F foram o processo metabólico da piridina (41%) e a polimerização proteica (33%), respectivamente.

Células-tronco localizadas na cinta placentária de carnívoros domésticos (Canis familiaris e Felis domesticus)

As células-tronco podem ser isoladas tanto de tecidos embrionários quanto de tecidos provenientes de um organismo adulto. Este projeto teve por objetivo caracterizar, descrever as células derivadas da região uterina e da cinta placentária junção materno/fetal da placenta de carnívoros domésticos (cães e gatos), e verificar a sua capacidade de pluripotência. Os úteros gestantes e não gestantes foram obtidos em campanhas de castrações e de controle populacional de cães e gatos, na cidade de Pirassununga/SP. Foram coletados 24 úteros gravídicos de animais hígidos, em diferentes idades gestacionais. O material foi dividido em três fases distintas da gestação, ou seja inicio que compreende de 8 a 20 dias de gestação; meio de 21 a 30 dias de gestação e final de 31 a 60 dias de gestação. O material foi coletado de fêmeas caninas e felinas, quatro úteros de cada fase, totalizando 12 úteros de cães e 12 de felinos. Coletamos também 8 úteros de fêmeas nulíparas (4 de cadelas e 4 de gatas) e 8 úteros com um mês pós parto (4 de cadelas e 4 de gatas). As amostras foram fixadas em paraformoldeido tamponado a 4% para a análise histológica e de imunohistoquimica. Para a padronização da imunohistoquimica inúmeros testes de marcação e diluição dos anticorpos utilizados nesta pesquisa foram realizados, todo protocolo aqui descrito foi padronizado pela primeira vez. Nas análises de imunohistoquimica avaliamos a expressão de marcadores associados a células-tronco pluripotentes Nanog, Oct4 e Sox2. Nas cadelas, as marcações foram positivas em todas as fases, gestacionais e não gestacionais. A detecção dessas proteínas nesta espécie ficaram padronizadas, destacando algumas diferenças quantitativas durante alguns períodos da gestação. Foi observado que o Oct4 na cadela, mostra uma diferença significativa (p=0,0064), entre as fases de início e meio da gestação e entra o início e a fase de termo. Quando comparados os resultados das análises imunohistoquimicas utilizando os três anticorpos entre si, nos três períodos gestacionais ficou evidente uma diferença (p=0,0005) somente relativa a proteína Nanog com Oct4. Nas gatas apenas foi possível padronizar o protocolo do Nanog e do Sox2, sendo a marcação feita com Oct4 negativa. Nesta espécie foi possível observar uma diferença da proteína Nanog (p=0,0006) quando comparada na fase inicial para a fase do meio e início da gestação para a fase termo. No que se refere as fêmeas nulíparas e fêmeas pós-parto destaca-se a ausência de diferenças quando comparados os anticorpos na fase pós parto tanto em cadelas quanto em gatas. Na fase nulípara foram observadas diferenças somente na cadela (p=0,0018) para os três anticorpos. Desta forma, a caracterização de células de origem placentária com característica de células tronco pode abrir um leque de possibilidades para obtenção destas células de forma mais ética, uma vez que este material é descartado na castrações. Foi possível a identificação das células que expressão proteínas pluripotentes em diferentes idades gestacionais, tanto na região de cinta placentária como no útero. Apesar de semelhantes, as espécies aqui estudadas apresentaram diferenças na realização do protocolo da imunihistoquímica. Pesquisas relacionadas com as células-tronco do endométrio vêm crescendo, principalmente porque estas células podem ser facilmente obtidas, a partir de fontes descartadas, sem entraves éticos. Desta forma tem o potencial de serem uma nova fonte para o desenvolvimento na terapêutica como terapia celular

Efeitos do treinamento de força no músculo esquelético em ratos com caquexia induzida pelo câncer

A ausência de terapias eficazes para a caquexia permanece como um problema central para o tratamento do câncer no mundo. Em contrapartida, o treinamento de força (i.e. também conhecido como treinamento resistido) tem sido amplamente utilizado como uma estratégia não farmacológica anticatabólica, prevenindo a perda da massa e da função da musculatura esquelética. Entretanto, o papel terapêutico do treinamento de força na caquexia do câncer permanece apenas especulativo. Portanto, nesse estudo avaliamos se o treinamento de força poderia atenuar a perda da massa e da função da musculatura esquelética em um severo modelo de caquexia do câncer em ratos. Para isso, ratos machos da linhagem Wistar foram randomizados em quatro grupos experimentais: 1) ratos sedentários injetados com solução salina na medula óssea (Controle); 2) ratos injetados com solução salina na medula óssea e submetidos ao treinamento de força (Controle + T); 3) ratos sedentários injetados com células do tumor Walker 256 na medula óssea (Tumor); e 4) ratos injetados com células do tumor Walker 256 na medula óssea e submetidos ao treinamento de força (Tumor + T). Foram avaliados a massa e a área de secção transversa da musculatura esquelética, marcadores de disfunção metabólica e do turnover proteico, a função da musculatura esquelética in vivo e ex vivo, o consumo alimentar, o crescimento tumoral e a sobrevida dos grupos experimentais com tumor. O grupo Tumor apresentou atrofia muscular após quinze dias da injeção das células tumorais como pode ser observado pela redução na massa dos músculos Plantaris (- 20,5%) e EDL (-20%). A atrofia no músculo EDL foi confirmada por análises histológicas, demonstrando uma redução de 43,8% na área de secção transversa. Embora o treinamento de força tenha aumentado o conteúdo proteico da lactato desidrogenase e revertido totalmente o conteúdo da forma fosforilada de 4EBP-1 (i.e. repressor da transcrição de mRNA), ele não atuou na morfologia da musculatura esquelética nos animais com tumor. Além disso, o treinamento de força não atenuou a perda de função da musculatura esquelética, a anorexia, o crescimento tumoral ou a taxa de mortalidade. Contudo, a força muscular, avaliada pelo teste de 1RM, apresentou uma correlação negativa com a sobrevida dos animais (p = 0,02), sugerindo que a perda de força prediz a mortalidade nesse modelo experimental de caquexia do câncer. Em suma, a injeção de células do tumor Walker 256 na medula óssea induz caquexia do câncer em ratos. O treinamento de força não foi eficaz em atenuar a perda de massa e função da musculatura esquelética nesse modelo. Entretanto, a força muscular prediz a sobrevida dos animais, sugerindo que novos estudos são necessários para elucidar o possível efeito terapêutico do treinamento de força para atenuar a caquexia do câncer e a progressão tumoral