Avaliação de microtécnicas de extração para análise de lamotrigina em plasma de pacientes epilépticos por eletroforese capilar

A lamotrigina (LTG) é um fármaco pertencente à classe das feniltriazinas utilizado no tratamento de crises epilépticas generalizadas e focais e no tratamento adjunto da epilepsia refratária. Devido à alta variabilidade interindividual, às interações medicamentosas e aos efeitos adversos apresentados durante a administração da LTG, a monitorização terapêutica nos pacientes que fazem uso deste fármaco é necessária para ajuste de dose individual e evitar os efeitos adversos. Assim, o objetivo deste trabalho foi a avaliação de duas técnicas de microextração: a microextração em fase líquida com fibras ocas (HF-LPME) e a microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME) para análise da lamotrigina em amostras de plasma de pacientes epilépticos. Primeiramente foram definidas as condições eletroforéticas: foi utilizado um capilar de sílica fundida de 75 ?m de diâmetro interno e 50 cm de comprimento efetivo. O eletrólito de corrida (BGE) foi composto por ácido 2-morfolinoetanosulfônico (MES), na concentração de 130 mmol L-1 e pH 5,0. As análises foram realizadas à temperatura de 20°C e tensão de 15 kV. A amostra foi injetada hidrodinamicamente (0,5 psi por 10 s) e a detecção foi feita em 214 nm. Nestas condições a LTG e o padrão interno (PI), lidocaína, puderam ser analisados em menos de 7 minutos. A HF-LPME foi avaliada no modo de 3 fases, usando 500 ?L de plasma e 3,5 mL de solução fosfato de sódio 50 mmol L-1 pH 9,0 como fase doadora. O solvente utilizado para impregnar a fibra foi o 1-octanol. Como fase aceptora foram utilizados 60 ?L de solução de ácido clorídrico pH 4,0. Para avaliação da DLLME, foi necessária uma etapa de pré-tratamento da amostra (500 ?L de plasma) com 1 mL de acetonitrila. Após isto, 1,3 mL do sobrenadante foram adicionados a 4 mL de solução fosfato de sódio 50 mmol L-1 pH 9,0 e 120 ?L de clorofórmio (solvente extrator) foram injetados nesta amostra aquosa e 165 ?L de fase sedimentada foram recuperados. As características de desempenho analítico para ambos os métodos foram avaliadas, sendo obtida linearidade na faixa de concentração plasmática de 1-20 ?g/mL e limite inferior de quantificação (LIQ) de 1 ?g mL-1. Os ensaios de precisão e exatidão apresentaram valores de acordo com os guias oficiais. Além disso, os métodos foram seletivos, não apresentaram efeito residual e as amostras foram estáveis. Os valores de recuperação foram de 54,3 e 23% para HF-LPME e DLLME, respectivamente. Os métodos validados foram aplicados com sucesso em amostras de plasma de pacientes epilépticos em tratamento com a LTG. Além disso, as duas técnicas foram comparadas e a HF-LPME apresentou vantagens em relação à DLLME, mostrando ser uma técnica promissora para análise de matrizes complexas, com reduzido consumo de solvente orgânico e possibilidade de automação.

Detecção de DNA de HPV no plasma para potencial identificação precoce de recidiva de câncer do colo de útero

O câncer do colo do útero constitui a terceira neoplasia maligna mais comum na população feminina, com aproximadamente 520 mil novos casos e 260 mil óbitos por ano e origina-se a partir da infecção genital persistente pelo Papiloma Vírus Humano (HPV) oncogênico. Os principais HPVs considerados de alto risco oncogênico são os tipos HPV-16 e 18, responsáveis por cerca de 70% de todos os casos de cânceres cervicais (CC) no mundo. Pacientes com CC apresentam taxa de recidiva variando de 8% a 49%. Dentro de dois anos de seguimento, 62% a 89% das recidivas são detectadas. Atualmente, os testes usados para detecção de recidiva são a citopatologia da cúpula vaginal e exames de imagem, porém ainda não estão disponíveis testes específicos. O DNA livre-circulante (cf-DNA) representa um biomarcador não-invasivo facilmente obtido no plasma e soro. Vários estudos mostram ser possível detectar e quantificar ácidos nucléicos no plasma de pacientes com câncer e que as alterações no cfDNA potencialmente refletem mudanças que ocorrem durante a tumorigênese. Essa ferramenta diagnóstica não-invasiva pode ser útil no rastreio, prognóstico e monitoramento da resposta ao tratamento do câncer. Portanto, o desenvolvimento e a padronização de testes laboratoriais não invasivos capazes de identificar marcadores tumorais e diagnosticar precocemente a recidiva da doença aumentam a chance de cura através da utilização dos tratamentos preconizados. Sendo assim, este estudo tem o objetivo de detectar o DNA de HPV no plasma de pacientes com CC para avaliar sua potencial utilidade como marcador precoce de recidiva. Um fragmento de tumor e sangue de pacientes com CC, atendidas no ICESP e HC de Barretos, foram coletados antes do tratamento. Entraram no estudo 137 pacientes nas quais o tumor foi positivo para HPV-16 ou 18, sendo 120 amostras positivas para HPV-16 (87,6%), 12 positivas para HPV-18 (8,8%) e cinco positivas para HPV-16 e 18 (3,6%). A média de idade das pacientes deste estudo foi de 52,5 anos. Plasma de 131 pacientes com CC da data do diagnóstico e de 110 pacientes do seguimento foram submetidas ao PCR em Tempo Real HPV tipo específico. A presença do DNA de HPV no plasma pré-tratamento foi observada em 58,8% (77/131) com carga viral variando de 204 cópias/mL a 2.500.000 cópias/mL. A positividade de DNA no plasma pré-tratamento aumentou com o estadio clínico do tumor: I - 45,2%, II - 52,5%, III - 80,0% e IV - 76,9%, (p=0,0189). A presença do DNA de HPV no plasma pós-tratamento foi observada em 27,3% (30/110). A média de tempo das recidivas foi de 3,1 anos (2,7 - 3,5 anos). O DNA de HPV foi positivo até 460 dias antes do diagnóstico clínico da recidiva. As pacientes com DNA de HPV no plasma apresentaram pior prognóstico, tanto sobrevida como o tempo livre de doença, em relação às que foram negativas. Nas pacientes com CC a presença de HPV no plasma de seguimento pode ser um marcador precoce útil para o monitoramento da resposta terapêutica e detecção de pacientes com risco aumentado de recidiva e progressão da doença.