Investigação de mecanismos genéticos e epigenéticos em distúrbios do crescimento humano

Parcela considerável de pacientes com distúrbios de crescimento não têm a causa de seus quadros clínicos estabelecida, incluindo aproximadamente 50% dos pacientes com diagnóstico clínico de síndrome de Silver−Russell (SRS) e 10-20% dos pacientes com síndrome de Beckwith-Wiedemann (BWS). O objetivo deste estudo foi investigar as causas genéticas e epigenéticas de distúrbios de crescimento, de etiologia desconhecida, numa contribuição para o entendimento de mecanismos que regulam o crescimento. O estudo compreendeu: (1) a investigação de microdesequilíbrios cromossômicos, por aCGH; (2) a análise do perfil de expressão alelo-específica de genes sujeitos a imprinting (IG), por pirossequenciamento (PSQ) ou sequenciamento de Sanger; (3) a investigação do padrão de metilação global em pacientes com restrição de crescimento, utilizando microarray de metilação. A casuística constituiu-se de 41 pacientes não aparentados, com distúrbios de crescimento, de etiologia desconhecida: (1) 25, com hipótese diagnóstica de SRS; (2) seis, com restrição de crescimento intrauterino e peso ao nascimento abaixo do 10º percentil, associados a outros sinais clínicos; (3) sete, com hipótese diagnóstica de BWS; e (4) três, com macrossomia pré-natal ou pós-natal, associada a outros sinais. A investigação de microdesequilíbrios cromossômicos foi realizada em 40 pacientes. Foram detectadas 58 variantes raras em 30/40 pacientes (75%): 40 foram consideradas provavelmente benignas (18 pacientes, 45%), 12, com efeito patogênico desconhecido (11 pacientes, 27,5%), duas, provavelmente patogênicas (um paciente, 2,5%) e quatro, patogênicas (três pacientes, 7,5%). Essas frequências são comparáveis àquelas descritas em estudos que investigaram CNV em grupos de pacientes com distúrbios de crescimento e outras alterações congênitas, incluindo SRS, e mostram a importância da investigação de microdesequilíbrios cromossômicos nesses pacientes. A diversidade dos microdesequilíbrios cromossômicos identificados é reflexo da heterogeneidade clínica das casuísticas. Neste estudo, muitos dos pacientes com hipótese diagnóstica de SRS e BWS apresentavam sinais clínicos atípicos, explicando a ausência neles das alterações (epi)genéticas que causam essas síndromes. A identificação de CNV características de outras síndromes reflete a sobreposição de sinais clínicos com BWS e SRS. A análise do perfil de expressão alelo-específica de IG foi realizada em um subgrupo de 18 pacientes com restrição de crescimento. Trinta IG com função em proliferação celular, crescimento fetal ou neurodesenvolvimento foram inicialmente selecionados. Após seleção de SNP transcritos com alta frequência na população, genotipagem de pacientes, genitores e indivíduos controle, determinação da expressão dos IG em sangue periférico e seu padrão de expressão (mono ou bialélico), 13 IG, expressos no sangue, tiveram a expressão alelo-específica avaliada, sete deles por PSQ e seis por sequenciamento de Sanger. Alterações no perfil de expressão de dois genes, de expressão normalmente paterna, foram detectadas em 4/18 pacientes (22%). Este estudo é o primeiro a utilizar pirossequenciamento e sequenciamento de Sanger na avaliação do perfil de expressão alelo-específica de IG, em pacientes com restrição de crescimento. Apesar de terem limitações, ambas as técnicas mostraram-se robustas e revelaram alterações de expressão alélica interessantes; entretanto, a relação dessas alterações com o quadro clínico dos pacientes permanece por esclarecer. A investigação da metilação global do DNA foi realizada em subgrupo de 21 pacientes com restrição de crescimento e em 24 indivíduos controle. Dois tipos de análise foram realizados: (1) análise diferencial de grupo e (2) análise diferencial individual. Na primeira análise, em que foi comparado o padrão de metilação do grupo de pacientes com quadro clínico sugestivo de SRS (n=16) com o do grupo controle (n=24), não houve indicação de hipo ou hipermetilação global no grupo SRS. Na segunda análise, foi comparado o padrão de metilação de cada um dos 21 pacientes com restrição de crescimento e dos 24 indivíduos controle, com o padrão de metilação do grupo controle. O número médio de CpG hipermetilados e de segmentos diferencialmente metilados (SDM) foi significativamente maior nos pacientes. Foram identificados 82 SDM hipermetilados, estando 57 associados a gene(s) (69,5%), em 16 pacientes, e 51 SDM hipometilados, 41 deles associados a gene(s) (80,4%), em 10 pacientes. A análise de ontologia genética dos 61 genes associados aos SDM hipo ou hipermetilados nos pacientes destacou genes que atuam no desenvolvimento e na morfogênese do sistema esquelético e de órgãos fetais, e na regulação da transcrição gênica e de processos metabólicos. Alterações de metilação em genes que atuam em processos de proliferação e diferenciação celulares e crescimento foram identificadas em 9/20 dos pacientes (45%), sugerindo implicação clínica. Não foi detectada alteração epigenética comum aos pacientes com diagnóstico clínico de SRS, explicável provavelmente pela heterogeneidade clínica. A investigação de metilação global, utilizando microarray, produziu novos dados que podem contribuir para a compreensão de mecanismos moleculares que influenciam o crescimento pré- e pós-natal. Na translocação aparentemente equilibrada - t(5;6)(q35.2;p22.3)dn, detectada em paciente com suspeita clínica de SRS, a interrupção de um gene, pela quebra no cromossomo 6, pode ser a causa do quadro clínico; alternativamente, a translocação pode ter impactado a regulação de genes de desenvolvimento localizados próximos aos pontos de quebra. A análise de expressão em sangue periférico mostrou que os níveis de cDNA do gene, interrompido pelo ponto de quebra da translocação, estavam reduzidos à metade. Além de sinais típicos da SRS, a paciente apresentava algumas características clínicas sugestivas de displasia cleidocraniana. Assim, a translocação t(5;6) pode ter alterado a interação de genes de desenvolvimento e seus elementos reguladores, levando à desregulação de sua expressão espaço-temporal, e resultando num fenótipo atípico, com características sobrepostas de mais de uma síndrome genética

Ensino da avaliação perceptivoauditiva da voz por meio de um ambiente virtual de aprendizagem

A avaliação vocal é realizada predominantemente por meio da avaliação perceptivoauditiva, sendo dependente de conhecimentos teóricos prévios e de treinamento prático e dinâmico. Entretanto, ainda são escassas as iniciativas educacionais que se utilizam das novas tecnologias para o ensino da avaliação perceptivoauditiva da voz. A utilização de estratégias com novas tecnologias de informação e comunicação, hoje tão presentes e familiarizadas no meio universitário, apresentam o intuito de facilitar e otimizar o processo de ensino e aprendizagem. Desta forma, este estudo teve o propósito de elaborar e avaliar um curso a distância em um ambiente virtual de aprendizagem sobre essa temática. Elaborou-se um curso a distância sobre a avaliação perceptivoauditiva da voz organizado em quatro módulos principais: 1. Noções básicas de anatomia e fisiologia da fonação; 2. Ouvindo vozes; 3. Avaliação perceptivoauditiva da voz e 4. Aplicabilidade da avaliação perceptivoauditiva da voz, além de um adicional com vídeos sobre curiosidades e sugestão de material complementar para estudo. O ambiente virtual de aprendizagem (AVA) também apresentou diversas ferramentas educacionais como textos, imagens ilustrativas, videoaulas, vídeos, arquivos de áudio, atividades práticas individuais, fóruns, além de recursos de interatividade entre alunos e tutora. Este material foi antecipadamente avaliado por três especialistas que avaliaram o material positivamente como uma inovadora e importante ferramenta educacional que poderá ser utilizada na formação de estudantes na área de voz. Foram convidados a participar do curso a distância, 133 alunos do 1o ao 4o ano de um curso de graduação em Fonoaudiologia de uma Universidade do interior paulista. Concordaram em participar 33 estudantes e desses, nove concluíram o curso. Os alunos responderam a avaliações de conteúdo nos momentos pré e pós-curso, de forma presencial e a avaliações de cada módulo, realizadas por meio de questões específicas e atividades práticas, no próprio site. Ao término do curso os alunos também responderam a uma avaliação motivacional do AVA. Observou-se diferença estatisticamente significante na média de acertos nas provas pré e pós-curso dos alunos, nas questões teóricas (p= 0,031), nas práticas (p=0,000) e no total (p=0,002), demonstrando que o material elaborado foi capaz de aumentar o conhecimento dos estudantes a respeito de seu tema. O AVA apresentou alto índice de satisfação motivacional e foi avaliado por todos os participantes como um curso impressionante, de acordo com o instrumento de avaliação motivacional utilizado. Conclui-se que foi possível elaborar um ambiente virtual de aprendizagem (AVA), em formato de curso a distância, sobre a temática da avaliação perceptivoauditiva da voz e que o material elaborado apresenta um importante potencial de ensino e aprendizagem sobre esse tema.