Efeito da desnutrição proteica sobre aspectos da mobilização, migração e sinalização celular. Papel da glutamina na modulação desses processos

A desnutrição é uma condição nutricional que pode afetar muitos aspectos da resposta imunológica, como alterações na migração celular, na fagocitose, na resposta bactericida, mudanças na produção de radicais livres e espécies de nitrogênio e na produção de citocinas pró-inflamatórias. Logo, indivíduos desnutridos apresentam maior susceptibilidade a infecções. Visto que a glutamina é um aminoácido de extrema importância para a funcionalidade de diversas células do sistema imune e que as mesmas apresentam aumento da utilização desse aminoácido durante processos infecciosos, investigou-se, neste trabalho, quais os efeitos da glutamina sobre alguns aspectos da mobilização, migração e sinalização celular em um modelo experimental de desnutrição proteica. Para tanto, utilizou-se camundongos da linhagem BALB/c machos, os quais foram divididos em dois grupos, Controle e Desnutrido, que passaram a receber dietas isocalóricas contendo 12% (normoproteica) e 2% de caseína (hipoproteica), respectivamente, durante 5 semanas. Para as avaliações in vivo, animais de ambos os grupos receberam por via endovenosa 100µL de solução contendo 1,25µg de LPS e após 1 hora 0,75mg/Kg de L-glutamina (GLUT). Após o período de desnutrição ou de indução ao processo inflamatório, os animais foram eutanasiados e as amostras biológicas coletas. Foram avaliados nos animais estimulados in vivo hemograma, mielograma, as citocinas IL-10 e TNF-α circulantes e a expressão de CD11b/CD18 nos granulócitos do sangue periférico. Foi avaliado, in vitro, a capacidade migratória, a expressão de CD11b/CD18 de polimorfonucleados da medula óssea e do sangue periférico, bem como a síntese de citocinas IL-1α, IL-6, IL-10, IL-12 e TNF-α e a expressão de NF-κB e IκBα em células cultivadas em meio com 0; 0,6; 2 e 10 mM de GLUT. Os animais desnutridos apresentaram anemia, leucopenia, hipoplasia medular e diminuição na concentração sérica de proteínas, albumina e pré-albumina. A GLUT, in vitro, apresentou capacidade de reduzir a produção de IL-1α e IL-6, bem como a ativação da via do NF-κB. No modelo in vivo a GLUT, em animais estimulados com LPS, alterou a cinética de migração neutrofílica e reduziu a expressão de CD18, bem como diminuiu os níveis de TNFα circulantes.

Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para o monitoramento dos produtos das vias metabólicas do triptofano em linhagem celular de glioma humano

O metabolismo do triptofano (Trp) se dá pela via das quinureninas (QUIN), pela via serotoninérgica (SER) e pela via das aminas traço. A primeira gera QUIN e uma variedade de outros metabólitos secundários. Quando conduzida pela enzima indolamina 2,3 dioxigenase (IDO) contribui para os fenômenos de tolerância e imune escape de células tumorais; e quando conduzida pela triptofano 2,3 dioxigenase (TDO) no fígado, participa na síntese da niacina e NAD. A via SER leva à formação do neurotransmissor serotonina (SER), que pode gerar o hormônio melatonina (MEL), respectivamente e outros metabólitos biologicamente ativos. Outra via menos estudada, a via das aminas traço, produz produtos neuroativos. Dada a abrangência e importância das rotas metabólicas do Trp, nós desenvolvemos e validamos uma metodologia bioanalítica robusta, seletiva e sensível por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), acoplado espectrometria de massas (MS) para a determinação simultânea do Trp e seus 15 metabólitos. Para tanto, escolhemos para a avaliação das três vias, linhagens de glioma humano. A escolha por este tipo celular deveu-se ao grande interesse de estudos de metabolismo de Trp em células tumorais, no qual células de glioma tem sido modelo. Nos ensaios com as células de glioma acompanhamos os efeitos de um indutor e inibidores da primeira etapa de metabolização do Trp pela via das quinureninas, ou seja, IFN-γ (indutor da IDO), 1-metiltriptofano (1-MT; inibidor competitivo da IDO) e 680C91 (inibidor seletivo da TDO). Pudemos observar o impacto que a indução ou a inibição do primeiro passo teve sobre os metabólitos subsequentes e as diferenças no metabolismo das duas linhagens estudadas, A172 e T98G. A linhagem T98G só tem atividade de IDO, enquanto que a A172 tem tanto atividade IDO quanto TDO. A indução por IFN-γ mostrou que essa citocina não só atua na formação da via QUIN, mas possui um impacto modesto nas demais rotas. Observamos também que a inibição do 1-MT mostrou seu impacto nos metabólitos invdividualmente, do que a simples relação Trp-QUIN. Contudo, nosso resultados nos permitiu mostrar pela primeira vez a descrição completa dessas vias, em especial nessas linhagens celulares, podendo supor estratégias terapêuticas nessas rotas que estão relacionadas a progressão ou não tumoral.

Método simples e rápido para seleção de fungos filamentosos produtores de compostos absorvedores de radiação UV para aplicação em protetores solares

Foram estudadas trinta e uma cepas fúngicas não identificadas, as quais foram denominadasX1 a X31. O potencial fotoprotetor foi avaliado pela medida espectrofotométrica da absorçãodos extratos na região do UV (280-400 nm). Os extratos com os melhores perfis de absorção em cultura estacionária foram X1, X2, X6, X12, X13, X18, X19, X22, X24 e X31 e, em cultura agitada X4 e X17. A reprodutibilidade do processo foi avaliada e as cepas fúngicas que apresentaram coeficiente de variação menor que 15% foram selecionadas para o estudo de fotoestabilidade. A fotoestabilidade dos extratos foi avaliada pela medida da viabilidade celular de fibroblastos L929 tratados com extratos previamente irradiados sob radiação UVA (11,2 J/cm2) e UVB (3,43 J/cm2) e extratos não irradiados, bem como, pela comparação das áreas sob as curvas de absorção na região do UV dos extratos irradiados e não irradiados. Os extratos selecionados para o estudo de fotoestabilidade foram X4, X12, X19, X22, X24 e X31. Os extratos não irradiados apresentaram os seguintes valores deIC50 para viabilidade celular (citotoxidade): X4-130µg/ml, X19-20µg/ml, X22-10 µg/ml e X24-60µg/ml. Após a radiação UVA e UVB, os extratos apresentaram redução significativa da viabilidade celular em relação ao IC50 dos extratos não irradiados. Sob luz UVB, os extratos X12 (IC50 35µg/ml) e X31 (IC50 70µg/ml) mantiveram a mesma porcentagem de redução da viabilidade celular quando comparado ao IC50 dos extratos não irradiados. No entanto após exposição à luz UVA, o extrato X12 aumentou a viabilidade celular de 50% (quando não irradiado) para 75% (irradiado). Enquanto que o extrato X31, mesmo após a radiação UVA, manteve a mesma redução de 50% da viabilidade celular. Nessa etapa os extratos selecionados foram os X12 e X31. O espectro de absorção na região do UV obtido para o extrato X12 mostrou uma redução da absorbância de 28,3% sob radiação UVB e de 60% sob radiação UVA em relação ao extrato não irradiado. O extrato X31 apresentou uma redução da absorbância de 17,6% e30% sob radiação UVB e UVA respectivamente, em relação ao extrato não irradiado. Os fungos selecionados foram identificados por PCR, sugerindo que o fungo X12 seja o Aspergillus terreus e o X31 seja o Talaromyces pinophilus. Por fim, foi feita a identificação da substância ativa do extrato X12 empregando a técnica de desreplicação, a qual fez o uso da instrumentação analítica acoplada UHPLC-DAD-(ESI)-HRMS associada ao banco de dados Chapman& Hall\'s Dictionary of Natural Products (DNP). No extrato X12 o composto majoritário foi identificado como sendo a citreoviridina. Assim, os resultados do presente trabalho permitiu estabelecer um procedimento para a seleção de fungos produtores de compostos absorvedores de radiação UV, que poderia ser aplicado na obtenção de novos filtros orgânicos naturais para protetores solares.

Caracterização morfológica e imunofenotípica dos linfomas caninos através de citologia de meio líquido e imunocitoquímica em emblocado celular

O linfoma canino é uma das neoplasias mais prevalentes em cães, diagnosticado frequentemente através de exame citológico de aspirados. A imunofenotipagem para diferenciação entre linfomas de células B e T é importante para definição prognóstica e tratamento, entretanto, dificilmente é realizada em materiais provenientes de aspirados citológicos. A citologia em meio líquido (CML) é uma metodologia automatizada de produção de esfregaços citológicos, que permite a conservação de todo o material da aspiração, e utilização do material residual para, por exemplo, produção de emblocado celular (EC) e imunocitoquímica. Este trabalho teve como objetivo aplicar a CML e EC com imunocitoquímica em amostras de linfonodos caninos suspeitos para linfoma. Além disso, pretendeu caracterizar morfologicamente as células linfoides neste tipo de preparado, comparando ao esfregaço convencional. Para isto, foram selecionados 54 cães com linfadenomegalia, 10 deles sorologicamente positivos para leishmaniose canina. Comparou-se a CML com a citologia convencional, quanto às características técnicas e testou-se dois métodos diferentes de EC: Bouin e agarose com formalina. Aplicou-se painel imunocitoquímico de anticorpos anti-CD3, anti-CD79a, anti-Pax-5 e anti-Ki67, para imunofenotipagem e determinação da proliferação celular. Adicionalmente, realizaram-se análises estatísticas para avaliação do desempenho e concordância interobservador comparada entre citologia convencional, CML e o uso conjunto de CML e imunocitoquímica do emblocado celular. Como resultado, as células linfoides apresentaram-se preservadas, com melhor definição de cromatina e nucléolos, porém com tamanho reduzido e pior definição citoplasmática, na CML. O EC de Bouin revelou grupos densos e bem definidos, que permitiram a aplicação da imunocitoquímica. Por outro lado, os emblocados de agarose, apresentaram-se frouxos, com células marcadamente dispersas, revelando-se inadequados para preparados de células linfoides. O anticorpo anti-Pax-5 mostrou-se mais adequado do que o anti-CD79a para marcação de células B em emblocados, por produzir menos fundo e pela marcação nuclear ser mais distinguível do que a citoplasmática. A concordância interobservadores da CML foi moderada (k= 0,434), enquanto a da citologia convencional foi boa (k=0,762). Ambas as técnicas exibiram a mesma acurácia e, com aplicação da CML, houve redução do percentual de amostras insatisfatórias. A CML em conjunto com EC e imunocitoquímica apresentou maior sensibilidade (75%), especificidade (99%) e acurácia (89,47%). Como conclusão, a CML em conjunto com EC e imunocitoquímica pode ser aplicada para diagnóstico de linfoma canino, com maior sensibilidade, especificidade e acurácia

Caracterização do envolvimento do gene RECKna proliferação celular e progressão tumoral: inversa correlação com a expressão do oncogene c-myc

Este trabalho mostra o envolvimento do gene RECK no processo de progressão do ciclo celular. Foi verificado que a expressão endógena de RECK é modulada durante a progressão do ciclo celular. A superexpressão de RECK em fibroblastos normais de camundongo promove uma diminuição da capacidade proliferativa das células e um retardo da transição das fases G0/G1-S do ciclo celular. Além disso, os resultados sugerem que um dos possíveis mecanismos de ação de RECK, que promovem este processo, envolve a indução da expressão de um inibidor de CDK, especificamente de p21, e retardo da fosforilação de pRb. Os resultados indicam, ainda, que durante a progressão do ciclo celular a expressão do gene RECK apresenta uma correlação inversa com a expressão do proto-oncogene c-myc. Estes dados corroboram os dados da literatura que mostram RECK como um alvo para o produto de diversos oncogenes, como ras e c-myc. A caracterização da repressão de RECK por c-Myc mostrou que a mesma ocorre ao nível transcricional e que sítios Sp1, presentes no promotor de RECK, são essenciais para a ação de Myc. Dados adicionais sugerem que a repressão de RECK por c-Myc parece envolver mecanismos de desacetilação de histonas. A modulação da expressão de RECK também foi avaliada durante a progressão maligna de tumores do sistema nervoso central (especificamente, gliomas). Foi verificado que a expressão de RECK não é alterada com a progressão deste tipo de tumor. Porém, foi verificado que os pacientes que manifestaram um maior tempo de sobrevida apresentaram tumores com uma significativa maior expressão do gene RECK. Estes dados sugerem que RECK possa ser um possível marcador prognóstico. A caracterização da regulação da expressão de RECK, tanto em células normais como em diferentes tipos de tumores, assim como os alvos moleculares da sua ação, são pontos muito importantes para o entendimento dos mecanismos que controlam a proliferação celular e podem contribuir para o desenvolvimento de novas formas de terapia anti-tumoral.

Relação entre adiposidade materna e do recém-nascido com concentrações de vitamina D materna e do cordão umbilical

Introdução - A vitamina D desempenha funções na regulação da homeostase do cálcio e fósforo, diferenciação celular, metabolismo de hormônios e regulação do sistema imune. Sua deficiência em crianças pode ocasionar raquitismo, convulsões e insuficiência respiratória. Objetivo - Determinar a relação entre adiposidade materna e do recém-nascido com as concentrações de vitamina D materna e do cordão umbilical. Metodologia - Foram envolvidas 101 mães e seus respectivos recém-nascidos selecionados no Hospital Maternidade Vila Nova Cachoeirinha, São Paulo. A concentração de vitamina D foi determinada por cromatografia líquida. A composição corporal materna foi determinada por bioimpedância segmentada (InBody®, Coréia do Sul) e a dos recém-nascidos obtida por pletismografia por deslocamento de ar (PEA POD®, USA). Para análise estatística, utilizou-se análise de regressão linear múltipla e coeficiente de correlação de Spearman. Valores de p <0,05 foram considerados significantes. Resultados - As médias das concentrações de vitamina D da mãe e do cordão umbilical foram de 30,16 (DP=21,16) ng/mL e 9,56 (DP=7,25) ng/mL, respectivamente. As médias das porcentagens de massa gorda das mães e dos recém-nascidos foram de 32,32 (DP=7,74) por cento e 8,55 (DP=4,37) por cento , respectivamente. Foi observada relação positiva entre concentração de vitamina D materna e do cordão umbilical (r=0,210; p<0,04). Não foi observada associação entre adiposidade do recém-nascido e concentração de vitamina D do cordão umbilical, nem entre adiposidade materna e concentrações de vitamina D materna e do cordão umbilical. Conclusão Neste estudo, original na literatura internacional, foi utilizado método de referência, validado, de alta precisão e imparcial na estimativa do percentual de gordura neonatal, nem sempre utilizado em outros estudos. Foi observada relação positiva entre concentração de vitamina D materna e do cordão umbilical. A ausência de associação entre as variáveis analisadas pode ser devido à alta prevalência de sobrepeso e obesidade entre as gestantes, baixas concentrações de vitamina D nas gestantes e recém-nascidos, alteração do metabolismo da vitamina D e da composição corporal no período da gestação e imaturidade do processo de sequestro da vitamina D pelo tecido adiposo 1 neonatal. Torna-se relevante o desenvolvimento de estudos prospectivos do tipo coorte para avaliar desde o início da gestação a influência da adiposidaidade materna nas concentrações de vitamina D materna e do cordão umbilical.

Estratégias para operacionalização da logística reversa de medicamentos

O descarte de medicamentos envolve dois fluxos: o fluxo institucional, dos resíduos de fármacos, classificados como resíduos de serviços de saúde, utilizados na indústria e nas instituições de saúde; e o fluxo domiciliar, dos medicamentos vencidos/em desuso em poder da população. O descarte dos resíduos de medicamentos de origem domiciliar pode ser promovido pela logística reversa, onde este tipo de resíduo é devolvido ao setor empresarial para destinação final ambientalmente segura. O objetivo deste estudo foi identificar as estratégias mais viáveis para operacionalização da logística reversa de medicamentos. Trata-se de uma pesquisa exploratória, descritiva, com abordagem quantitativa. As estratégias foram avaliadas junto a atores da cadeia de valor farmacêutica: representantes do poder público, da indústria e distribuição farmacêutica, e consumidores/potenciais consumidores de medicamentos. Foram elaborados três questionários de avaliação de estratégias segundo seis critérios: mediação (articulação entre atores da cadeia produtiva farmacêutica por meio de políticas públicas); fiscalização (das ações); complexidade (de implantação e operacionalização); custos (de implantação e manutenção); adesão (potencialidade de ser inserida no cotidiano da população) e abrangência (potencialidade de alcançar a população). As estratégias foram hierarquizadas em ordem decrescente de viabilidade: rientações à população por profissionais de saúde, farmácias e internet, sinalização de informações nas embalagens e bulas de medicamentos, campanhas publicitárias e de educação ambiental e a disponibilização de postos de entrega voluntária. Os resultados poderão contribuir para a operacionalização de um sistema de logística reversa de medicamentos, considerando todos os atores envolvidos e buscando conciliar suas necessidades, possibilidades, limitações e interesses

Diabetes mellitus e câncer de cabeça e pescoço

O diabetes mellitus (DM) está associado com alguns tipos de câncer. No entanto, estudos realizados sobre a associação entre DM e câncer de cabeça e pescoço (CCP) apresentaram resultados controversos. Na avaliação da associação entre DM e câncer, destaque deve ser dado à metformina, medicamento utilizado no DM tipo 2, que se mostra inversamente associado a alguns tumores. O objetivo deste estudo foi avaliar a associação entre DM e CCP, bem como o impacto do uso de metformina no risco de CCP. Este estudo caso-controle incluiu 1021 casos de CCP com confirmação histológica de carcinoma espino celular selecionados em cinco hospitais de grande porte no estado de São Paulo entre 2011 e 2014. Os 1063 controles foram recrutados nos mesmos hospitais, pareados por frequência com os casos por sexo e idade (em grupos de 5 anos). Para avaliar o risco de CCP associado ao DM, odds ratios (OR) e intervalos com 95 por cento de confiança (IC 95 por cento ) foram estimados por meio de regressão logística não condicional. Os participantes diabéticos tiveram associação inversa com o CCP (OR = 0,68; IC 95 por cento : 0,49-0,95), e a proteção foi maior entre diabéticos usuários metformina (OR = 0,54; IC 95 por cento : 0,29-0,99). Diabéticos usuários de metformina que eram fumantes (OR = 0,13; IC 95 por cento : 0,04-0,44), ou consumidores de álcool acima de 40 g/ dia (OR = 0,31; IC 95 por cento : 0,11-0,88) apresentaram proteção ainda maior com relação ao CCP, comparado aos não diabéticos. Em conclusão, os indivíduos diabéticos apresentaram risco inverso de CCP e o uso de metformina pode explicar, ao menos parcialmente, esta associação.

Perfil da expressão gênica de larvas de Tetrapedia diversipes (Hymenoptera: Apidae) em diapausa

A diapausa é um fenômeno amplamente presente nos artrópodes e é considerada como primordial para o sucesso evolutivo da Classe Insecta, pois possibilita a sobrevivência em condições adversas, como estações frias e secas. Sabe-se que durante a diapausa ocorre o silenciamento de muitos genes e que outros são unicamente expressos nesta fase. Embora existam evidências de que o processo da diapausa tenha se mantido conservado durante a evolução das espécies, ainda há lacunas no conhecimento sobre o nível de conservação dos padrões metabólicos. Um bom modelo para se estudar a diapausa é Tetrapedia diversipes, uma espécie bivoltina de abelha solitária. Os indivíduos que nascem na primeira geração seguem o desenvolvimento desde ovo até adulto em tempo bem menor do que aqueles que nascem na segunda geração; estes retardam o desenvolvimento na fase larval. Além disso, essa espécie é de fácil obtenção no seu ambiente natural, pois apresenta alta taxa de nidificação em ninhos-armadilha. O objetivo deste trabalho foi comparar o perfil de expressão de genes entre as larvas da 1ª geração (que não entram em diapausa), larvas da 2ª geração (que entrariam em diapausa) e das larvas em diapausa. Foram identificados 196 genes diferencialmente expressos, destes 87 foram anotados. Muitos destes genes já foram descritos na literatura como relacionados à diapausa em outras espécies, no entanto, o padrão de expressão não é conservado. Os genes aqui identificados foram divididos em cinco grupos: relacionados à desintoxicação celular, cutícula e citoesqueleto, metabolismo de lipídeos e esteróis, ciclo celular e outros genes relacionados à diapausa

Investigação do papel de SIGIRR/IL-1R8 no crosstalk entre células tumorais e o infiltrado leucocitário

Células tumorais desenvolvem diversas estratégias para escapar da identificação e eliminação pelo sistema imune. Dessa forma, a investigação dos mecanismos envolvidos na comunicação celular no microambiente tumoral e na desregulação local do sistema imune é crítica para uma melhor compreensão da progressão da doença e para o desenvolvimento de alternativas terapêuticas mais eficazes. Nós aqui demonstramos que SIGIRR/IL-1R8, um importante regulador negativo de receptores de Interleucina-1 (ILRs) e receptores do tipo Toll (TLRs), apresenta expressão aumentada em uma linhagem celular epitelial mamária transformada pela superexpressão do oncogene HER2 e em tumores primários de mama, e promove o crescimento tumoral e metástase através da modulação da inflamação associada ao câncer e da atenuação da resposta imune antitumoral. Observamos que IL-1R8 tem sua expressão correlacionada com HER2 em tecidos mamários e sua alta expressão é fator de pior prognóstico em câncer de mama de baixo grau. Notavelmente, níveis aumentados de IL-1R8 foram observados especialmente nos subtipos HER2+ e Luminais de tumores de mama, e sua expressão aumentada em células epiteliais de mama transformadas por HER2 diminui a ativação da via de NF-&#954;B e a expressão de diferentes citocinas pro-inflamatórias (IL-6, IL-8, TNF, CSF2, CSF3 e IFN-&#946;1). Meio condicionado de células transformadas por HER2, mas não de variantes celulares com o gene IL-1R8 silenciado, induz a polarização de macrófagos para o fenótipo M2 e inibe a ativação de células NK. Em um modelo murino transgênico de tumorigênese espontânea mediada por HER2, MMTV-neu, verificamos que a deficiência de IL-1R8 (IL-1R8-/-neu) retardou o aparecimento de tumores e reduziu a incidência, a carga tumoral e a disseminação metastática. Contudo, não foram observadas diferenças significativas no crescimento tumoral quando animais IL-1R8-/-neu receberam medula óssea de animais IL-1R8+/+, confirmando um papel importante da expressão de IL-1R8 em células não hematopoiéticas na tumorigênese da mama. Tumores IL-1R8+/+neu apresentaram maiores níveis de citocinas pró-inflamatórias como IL-1&#946; e VEGF, e menores níveis da citocina imunomodulatória IFN-&#947;. Além disso, tumores que expressavam IL-1R8 apresentaram menor infiltrado de células NK maduras, células dendríticas (DCs) e linfócitos T-CD8+ e um maior infiltrado de macrófagos M2 e linfócitos T-CD4+. Coletivamente, esses resultados indicam que a expressão de IL-1R8 em tumores de mama pode representar um novo mecanismo de escape da resposta imune e suportam IL-1R8 como potencial alvo terapêutico.

Investigação de mecanismos genéticos e epigenéticos em distúrbios do crescimento humano

Parcela considerável de pacientes com distúrbios de crescimento não têm a causa de seus quadros clínicos estabelecida, incluindo aproximadamente 50% dos pacientes com diagnóstico clínico de síndrome de Silver&minus;Russell (SRS) e 10-20% dos pacientes com síndrome de Beckwith-Wiedemann (BWS). O objetivo deste estudo foi investigar as causas genéticas e epigenéticas de distúrbios de crescimento, de etiologia desconhecida, numa contribuição para o entendimento de mecanismos que regulam o crescimento. O estudo compreendeu: (1) a investigação de microdesequilíbrios cromossômicos, por aCGH; (2) a análise do perfil de expressão alelo-específica de genes sujeitos a imprinting (IG), por pirossequenciamento (PSQ) ou sequenciamento de Sanger; (3) a investigação do padrão de metilação global em pacientes com restrição de crescimento, utilizando microarray de metilação. A casuística constituiu-se de 41 pacientes não aparentados, com distúrbios de crescimento, de etiologia desconhecida: (1) 25, com hipótese diagnóstica de SRS; (2) seis, com restrição de crescimento intrauterino e peso ao nascimento abaixo do 10º percentil, associados a outros sinais clínicos; (3) sete, com hipótese diagnóstica de BWS; e (4) três, com macrossomia pré-natal ou pós-natal, associada a outros sinais. A investigação de microdesequilíbrios cromossômicos foi realizada em 40 pacientes. Foram detectadas 58 variantes raras em 30/40 pacientes (75%): 40 foram consideradas provavelmente benignas (18 pacientes, 45%), 12, com efeito patogênico desconhecido (11 pacientes, 27,5%), duas, provavelmente patogênicas (um paciente, 2,5%) e quatro, patogênicas (três pacientes, 7,5%). Essas frequências são comparáveis àquelas descritas em estudos que investigaram CNV em grupos de pacientes com distúrbios de crescimento e outras alterações congênitas, incluindo SRS, e mostram a importância da investigação de microdesequilíbrios cromossômicos nesses pacientes. A diversidade dos microdesequilíbrios cromossômicos identificados é reflexo da heterogeneidade clínica das casuísticas. Neste estudo, muitos dos pacientes com hipótese diagnóstica de SRS e BWS apresentavam sinais clínicos atípicos, explicando a ausência neles das alterações (epi)genéticas que causam essas síndromes. A identificação de CNV características de outras síndromes reflete a sobreposição de sinais clínicos com BWS e SRS. A análise do perfil de expressão alelo-específica de IG foi realizada em um subgrupo de 18 pacientes com restrição de crescimento. Trinta IG com função em proliferação celular, crescimento fetal ou neurodesenvolvimento foram inicialmente selecionados. Após seleção de SNP transcritos com alta frequência na população, genotipagem de pacientes, genitores e indivíduos controle, determinação da expressão dos IG em sangue periférico e seu padrão de expressão (mono ou bialélico), 13 IG, expressos no sangue, tiveram a expressão alelo-específica avaliada, sete deles por PSQ e seis por sequenciamento de Sanger. Alterações no perfil de expressão de dois genes, de expressão normalmente paterna, foram detectadas em 4/18 pacientes (22%). Este estudo é o primeiro a utilizar pirossequenciamento e sequenciamento de Sanger na avaliação do perfil de expressão alelo-específica de IG, em pacientes com restrição de crescimento. Apesar de terem limitações, ambas as técnicas mostraram-se robustas e revelaram alterações de expressão alélica interessantes; entretanto, a relação dessas alterações com o quadro clínico dos pacientes permanece por esclarecer. A investigação da metilação global do DNA foi realizada em subgrupo de 21 pacientes com restrição de crescimento e em 24 indivíduos controle. Dois tipos de análise foram realizados: (1) análise diferencial de grupo e (2) análise diferencial individual. Na primeira análise, em que foi comparado o padrão de metilação do grupo de pacientes com quadro clínico sugestivo de SRS (n=16) com o do grupo controle (n=24), não houve indicação de hipo ou hipermetilação global no grupo SRS. Na segunda análise, foi comparado o padrão de metilação de cada um dos 21 pacientes com restrição de crescimento e dos 24 indivíduos controle, com o padrão de metilação do grupo controle. O número médio de CpG hipermetilados e de segmentos diferencialmente metilados (SDM) foi significativamente maior nos pacientes. Foram identificados 82 SDM hipermetilados, estando 57 associados a gene(s) (69,5%), em 16 pacientes, e 51 SDM hipometilados, 41 deles associados a gene(s) (80,4%), em 10 pacientes. A análise de ontologia genética dos 61 genes associados aos SDM hipo ou hipermetilados nos pacientes destacou genes que atuam no desenvolvimento e na morfogênese do sistema esquelético e de órgãos fetais, e na regulação da transcrição gênica e de processos metabólicos. Alterações de metilação em genes que atuam em processos de proliferação e diferenciação celulares e crescimento foram identificadas em 9/20 dos pacientes (45%), sugerindo implicação clínica. Não foi detectada alteração epigenética comum aos pacientes com diagnóstico clínico de SRS, explicável provavelmente pela heterogeneidade clínica. A investigação de metilação global, utilizando microarray, produziu novos dados que podem contribuir para a compreensão de mecanismos moleculares que influenciam o crescimento pré- e pós-natal. Na translocação aparentemente equilibrada - t(5;6)(q35.2;p22.3)dn, detectada em paciente com suspeita clínica de SRS, a interrupção de um gene, pela quebra no cromossomo 6, pode ser a causa do quadro clínico; alternativamente, a translocação pode ter impactado a regulação de genes de desenvolvimento localizados próximos aos pontos de quebra. A análise de expressão em sangue periférico mostrou que os níveis de cDNA do gene, interrompido pelo ponto de quebra da translocação, estavam reduzidos à metade. Além de sinais típicos da SRS, a paciente apresentava algumas características clínicas sugestivas de displasia cleidocraniana. Assim, a translocação t(5;6) pode ter alterado a interação de genes de desenvolvimento e seus elementos reguladores, levando à desregulação de sua expressão espaço-temporal, e resultando num fenótipo atípico, com características sobrepostas de mais de uma síndrome genética

Modulação da diferenciação neural de células troco embrionárias por transientes de cálcio intracelulares: papéis dos receptores purinérgicos e de canais de cálcio voltagem-dependentes

Receptores purinérgicos e canais de cálcio voltagem-dependentes estão envolvidos em diversos processos biológicos como na gastrulação, durante o desenvolvimento embrionário, e na diferenciação neural. Quando ativados, canais de cálcio voltagem-dependentes e receptores purinérgicos do tipo P2, ativados por nucleotídeos, desencadeiam transientes de cálcio intracelulares controlando diversos processos biológicos. Neste trabalho, nós estudamos a participação de canais de cálcio voltagem-dependentes e receptores do tipo P2 na geração de transientes de cálcio espontâneos e sua regulação na expressão de fatores de transcrição relacionados com a neurogênese utilizando como modelo células tronco (CTE) induzidas à diferenciação em células tronco neurais (NSC) com ácido retinóico. Descrevemos que CTE indiferenciadas podem ter a proliferação acelerada pela ativação de receptores P2X7, enquanto que a expressão e a atividade desse receptor precisam ser inibidas para o progresso da diferenciação em neuroblasto. Além disso, ao longo da diferenciação neural, por análise em tempo real dos níveis de cálcio intracelular livre identificamos 3 padrões de oscilações espontâneas de cálcio (onda, pico e unique), e mostramos que ondas e picos tiveram a frequência e amplitude aumentadas conforme o andamento da diferenciação. Células tratadas com o inibidor do receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R), Xestospongin C, apresentaram picos mas não ondas, indicando que ondas dependem exclusivamente de cálcio oriundo do retículo endoplasmático pela ativação de IP3R. NSC de telencéfalo de embrião de camundongos transgênicos ou pré-diferenciadas de CTE tratadas com Bz-ATP, o agonista do receptor P2X7, e com 2SUTP, agonista de P2Y2 e P2Y4, aumentaram a frequência e a amplitude das oscilações espontâneas de cálcio do tipo pico. Dados, obtidos por microscopia de luminescência, da expressão em tempo real de gene repórter luciferase fusionado à Mash1 e Ngn2 revelou que a ativação dos receptores P2Y2/P2Y4 aumentou a expressão estável de Mash1 enquanto que ativação do receptor P2X7 levou ao aumento de Ngn2. Além disso, células na presença do quelante de cálcio extracelular (EGTA) ou do depletor dos estoques intracelulares de cálcio do retículo endoplasmático (thapsigargin) apresentaram redução na expressão de Mash1 e Ngn2, indicando que ambos são regulados pela sinalização de cálcio. A investigação dos canais de cálcio voltagem-dependentes demonstrou que o influxo de cálcio gerado por despolarização da membrana de NSC diferenciadas de CTE é decorrente da ativação de canais de cálcio voltagem-dependentes do tipo L. Além disso, esse influxo pode controlar o destino celular por estabilizar expressão de Mash1 e induzir a diferenciação neuronal por fosforilação e translocação do fator de transcrição CREB. Esses dados sugerem que os receptores P2X7, P2Y2, P2Y4 e canais de cálcio voltagem-dependentes do tipo L podem modular as oscilações espontâneas de cálcio durante a diferenciação neural e consequentemente alteram o padrão de expressão de Mash1 e Ngn2 favorecendo a decisão do destino celular neuronal.

Imobilização do fungo Penicillium citrinum CBMAI 1186 e lipase de Pseudomonas fluorescens em biopolímeros para aplicações em biocatálise

Diversos biomateriais podem ser aplicados como suportes na imobiliza&ccedil;&atilde;o de c&eacute;lulas totais de fungos filamentosos ou enzimas isoladas, visando a manuten&ccedil;&atilde;o e o prolongamento da atividade enzim&aacute;tica em processos biocatal&iacute;ticos. Exemplos promissores de biomateriais s&atilde;o a fibro&iacute;na da seda e o alginato de s&oacute;dio. A fibro&iacute;na &eacute; um material prot&eacute;ico com alta estabilidade t&eacute;rmica, elasticidade, resist&ecirc;ncia &agrave; tens&atilde;o, n&atilde;o sofre ataque microbiano, baixo custo de purifica&ccedil;&atilde;o e alta tenacidade, o alginato &eacute; um biopol&iacute;mero vers&aacute;til, devido a suas propriedades gelificantes em solu&ccedil;&otilde;es aquosas. Assim, neste trabalho empregou-se mic&eacute;lios do fungo derivado de ambiente marinho, Penicillium citrinum CBMAI 1186, livres e imobilizados em biopol&iacute;meros (fibra de algod&atilde;o, fibra de fibro&iacute;na da seda e fibra de paina) na biorredu&ccedil;&atilde;o quimiosseletiva, regiosseletiva e enantiosseletiva da liga&ccedil;&atilde;o &#945;,&#946;-C=C de enonas &#945;,&#946;-, &#945;,&#946;,&#947;,&#948;- e di-&#945;,&#946;-insaturadas previamente sintetizados pela a rea&ccedil;&atilde;o de condensa&ccedil;&atilde;o ald&oacute;lica. Foi poss&iacute;vel a utiliza&ccedil;&atilde;o do fungo P. citrinum CBMAI 1186 na redu&ccedil;&atilde;o quimiosseletiva, regiosseletiva e enantiosseletiva da liga&ccedil;&atilde;o dupla carbono-carbono de sistemas &#945;,&#946;-insaturados. A imobiliza&ccedil;&atilde;o do fungo P. citrinum CBMAI 1186 em biopol&iacute;meros (algod&atilde;o, fibro&iacute;na da seda, paina e quitosana) permitiu a prolongamento da atividade celular do fungo. O protocolo desenvolvido foi capaz de obter compostos at&eacute; ent&atilde;o descritos apenas por s&iacute;ntese cl&aacute;ssica. Tamb&eacute;m foi realizado rea&ccedil;&otilde;es de resolu&ccedil;&atilde;o enzim&aacute;tica de derivados de haloidrinas por diferentes lipases microbianas de: Pseudomonas fluorescens, Candida cylindracea, Rhizopus niveus e Aspergillus niger. A lipase de P. fluorescens foi imobilizada em esferas de fibro&iacute;na do bicho da seda (m&eacute;todo 1, via adsor&ccedil;&atilde;o) e em blenda com alginato de c&aacute;lcio (m&eacute;todo 2, via encapsula&ccedil;&atilde;o) em diferentes condi&ccedil;&otilde;es, tais como, varia&ccedil;&atilde;o de solvente, varia&ccedil;&atilde;o da quantidade de enzima imobilizada e tempo de rea&ccedil;&atilde;o. As condi&ccedil;&otilde;es otimizadas foram empregadas em diferentes haloidrinas, rendendo elevados excessos enantiom&eacute;ricos (ee > 99%) e alta raz&atilde;o enanantiom&eacute;rica (E > 200) para os produtos acetilados. Foi poss&iacute;vel desenvolver um protocolo simples, barato e pr&aacute;tico para a s&iacute;ntese enantiosseletiva de haloidrina refor&ccedil;ando a versatilidade da fibro&iacute;na e do alginato como suportes de imobiliza&ccedil;&atilde;o para catalisadores heterog&ecirc;neos. Tamb&eacute;m foi poss&iacute;vel utilizar a lipase imobilizada (m&eacute;todo 2) na rea&ccedil;&atilde;o de transesterifica&ccedil;&atilde;o para obten&ccedil;&atilde;o do biodiesel et&iacute;lico. As melhores condi&ccedil;&otilde;es para o bom funcionamento do biocatalisador foram: 30% do biocatalisador, 20% de n-hexano, rela&ccedil;&atilde;o &oacute;leo e etanol de 1:4 a 32 &ordm;C por 48 h em agita&ccedil;&atilde;o magn&eacute;tica (400 rpm). Essas condi&ccedil;&otilde;es permitiram a forma&ccedil;&atilde;o de 42% de rendimento do biodiesel et&iacute;lico. O biocatalisador apresentou algumas limita&ccedil;&otilde;es reacionais, tais como, fragilidade frente a elevadas temperaturas (> 32 &ordm;C) e prolongado tempo de agita&ccedil;&atilde;o magn&eacute;tica. Por&eacute;m, permaneceu apto no meio por 4 ciclos consecutivas. Conclui-se que os biomateriais (fibro&iacute;na, alginato e quitosana) podem ser utilizados como alternativas vers&aacute;teis na imobiliza&ccedil;&atilde;o de mic&eacute;lios de fungos filamentoso e de enzimas isoladas para aplica&ccedil;&otilde;es em biocatal&iacute;ticas.

Alterações em adrenais de cães relacionadas à morte súbita ou agônica: análise morfométrica, histopatológica, imunoistoquímica e correlação com os níveis de adrenalina e noradrenalina na medula adrenal

A necropsia é essencial para a identificação da causa de morte e dos processos que culminaram no óbito do animal. O presente estudo visou à pesquisa da real ocorrência de morte súbita e inesperada em cães submetidos à necropsia, e à determinação da discrepância entre as suspeitas dos proprietários em relação ao estado de saúde prévio e à causa de morte de seus cães, quando comparadas às conclusões necroscópicas. Este trabalho também focou nas alterações morfológicas e funcionais nas glândulas adrenais de cães necropsiados, a fim de se estudar a aplicação de possíveis marcadores da resposta adrenal ao estresse sofrido pelo animal na iminência do óbito. Foram utilizados os dados de 82 cães necropsiados na FMVZ-USP para análise da ocorrência real de morte súbita nestes animais. As alterações morfológicas nas adrenais de 46 cães necropsiados foram avaliadas através de análises morfométricas e histopatológicas. Também foram avaliados os índices de proliferação e apoptose nas células do córtex adrenal em relação à causa de morte do animal, através da marcação imunoistoquímica para o antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) e para BAX e Bcl-2, proteínas envolvidas na regulação da apoptose. A análise das alterações funcionais sofridas pelas adrenais focou na quantificação das concentrações das catecolaminas adrenalina e noradrenalina na medula adrenal dos cães por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção eletroquímica (CLAE-DE). Dentre os resultados encontrados, a suspeita do proprietário de que seu cão sofreu uma morte súbita e inesperada é muito maior do que a real ocorrência deste tipo de morte em cães, sendo o óbito por decorrência de complicações de doenças muito mais frequente. As características morfométricas das adrenais dos cães apresentaram maior influência pelo peso corpóreo do animal e pela presença ou ausência de hiperplasia cortical do que pela associação com doenças crônicas ou condições agudas. Cães que vieram a óbito em decorrência de complicações de doenças crônicas exibiram fibrose em região corticomedular e focos de infiltrado inflamatório, ausentes nos animais com morte súbita ou doenças agudas, além de maior ocorrência de hiperplasia adrenocortical. Cães que sofriam de alterações cardíacas crônicas apresentaram alterações histopatológicas significativas mais marcantes em suas adrenais, como necrose, fibrose e depleção vacuolar cortical. Por outro lado, a congestão severa nas adrenais foi um achado mais frequente nos animais previamente saudáveis que sofreram morte súbita ou que vieram a óbito por doenças agudas. A avaliação dos índices de proliferação celular e apoptose no córtex das adrenais através da marcação imunoistoquímica para PCNA e BAX e Bcl-2, respectivamente, não apresentou potencial relevante para o estudo dos efeitos do estresse por doenças crônicas sobre as adrenais de cães. As concentrações de adrenalina e noradrenalina na medula adrenal se mostraram muito maiores em cães machos quando comparados às fêmeas. Os achados deste estudo podem auxiliar nas conclusões da necropsia, sendo especialmente relevantes em casos médico-legais, nos quais todos os achados possíveis devem ser relatados e analisados a fim de se prover um diagnóstico preciso, seguro e incontroverso

Relações entre comportamento vocal, imunidade e níveis plasmáticos de corticosterona e testosterona em sapos (Rhinella granulosa)

A exibição do comportamento vocal em muitas espécies de anfíbios anuros é relacionada aos níveis de hormônios esteroides gonadais e interrenais. Esses hormônios poderiam mediar a relação entre intensidade de sinais e imunidade, pois estão envolvidos no desenvolvimento das características sexuais secundárias, comportamento de corte e mobilização de reservas energéticas durante a atividade reprodutiva, enquanto apresentam também efeitos imunomoduladores. Nesse sentido, o objetivo deste trabalho foi explorar as relações entre comportamento reprodutivo, imunidade e níveis plasmáticos de testosterona e corticosterona em machos do sapo do semiárido brasileiro, Rhinella granulosa, em atividade reprodutiva e após manipulação hormonal. A precipitação foi o principal determinante ambiental para o aumento dos níveis de testosterona e corticosterona circulantes em machos de R. granulosa, estimulando o comportamento de vocalização. As relações fisiológicas encontradas indicam que os altos níveis plasmáticos de testosterona nos primeiros dias após a chuva devem promover o início do turno vocal, porém a corticosterona deve modular o esforço de vocalização. De forma geral, a exacerbação do comportamento vocal de R. granulosa tem efeitos negativos sobre a imunocompetência, porém alguns indivíduos que apresentam maiores concentrações plasmáticas de corticosterona apresentam concomitantemente alto esforço vocal e alta imunidade. De acordo, a aplicação transdérmica de corticosterona promoveu elevação aguda dos níveis plasmáticos deste glicocorticoide, bem como um aumento da função imune. Assim, apesar de a atenção principal ser comumente colocada no papel da testosterona na mediação de sinais honestos, nossos resultados corroboram a importância da corticosterona na mediação da expressão do comportamento de corte e imunocompetência em machos R. granulosa