Estudo da função de keaA no controle do crescimento, desenvolvimento e resposta a estresses em Dictyostelium discoideum

O ciclo de vida de Dictyostelium discoideum é composto de duas fases independentes. Durante o crescimento vegetativo, as amebas crescem isoladas até que a fonte de nutrientes seja esgotada. A carência nutricional induz sua entrada num processo de desenvolvimento, que inclui a parada do crescimento, a agregação das células e a formação de um organismo multicelular onde as células se diferenciam em esporos que sobrevivem as condições desfavoráveis. A proteína quinase YakA é requerida para a transição entre o crescimento e o desenvolvimento. YakA regula os níveis da PKA. Mutantes yakA- apresentam o crescimento acelerado, são deficientes no processo de agregação e são hiper-sensíveis a estresse oxidativo e nitrosoativo. Uma mutação em um segundo sítio em keaA, suprime a morte induzida por SNP (um gerador de óxido nítrico) no mutante yakA-. O papel de keaA foi determinado em resposta a estresse oxidativo, nitrosoativo e carênica nutricional. O gene keaA é necessário para o crescimento e desenvolvimento. Uma mutação em keaA confere resistência a estresse nitrosoativoloxidativo confirmando que uma mutação em keaA confere resistência a estresse. Um segundo supressor da morte induzida por SNP no mutante yakA- foi isolado pela mesma técnica de REMI e identificado como pkaC um regulador da resposta a estresse. YakA e PKA integradam a resposta a vários estresse em Dictyostelium. Os resultados indicam que a yakA regula a parada do ciclo celular em resposta a estresses através da modulação de keaA. keaA regula, por sua vez, a expressão da pkaC, um regulador chave da produção de cAMP e do processo de desenvolvimento. A interação gênica entre estes elementos é complexa e deve ser ajustada para permitir que as células sobrevivam a mudanças ambientais encontradas durante o seu ciclo de vida.

Análise funcional das proteínas HrcA, GroES/GroEL e DnaK/DnaJ em Caulobacter crescentus

O operon groESL de C. crescentus apresenta dupla regulação. A indução deste operon por choque térmico é dependente do fator sigma de choque térmico σ32. A temperaturas fisiológicas, a expressão de groESL apresenta regulação temporal durante o ciclo celular da bactéria e o controle envolve a proteína repressora HrcA e o elemento CIRCE (controlling inverted repeat of chaperonin expression). Para estudar a atividade da proteína repressora in vitro, produzimos e purificamos de E. coli a HrcA de C. creseentus contendo uma cauda de histidinas e a ligação especifica ao elemento CIRCE foi analisada em ensaios de migração retardada em gel de poliacrilamida (EMRGP). A quantidade de DNA retardada pela ligação a HrcA aumentou significativamente na presença de GroES/GroEL, sugerindo que estas proteínas modulam a atividade de HrcA. Corroboração desta modulação foi obtida analisando fusões de transcrição da região regulatória de groESL com o gene lacZ, em células de C. crescentus produzindo diferentes quantidades de GroES/EL. HrcA contendo as substituições Pro81 AJa e Arg87Ala, aminoácidos que se localizam no domínio putativo de ligação ao DNA da proteína, mostraram ser deficientes na ligação a CIRCE, tanto in vitro como in vivo. Em adição, HrcA Ser56Ala expressa na mesma célula juntamente com a proteína selvagem produziu um fenótipo dominante-negativo, indicando que a HrcA de C. crescentus liga-se a CIRCE como um oligômero, provavelmente um dímero. As tentativas de obtenção de mutantes nulos para os genes groESL ou dnaKJ falharam, indicando que as proteínas GroES/GroEL e DnaK/DnaJ são essenciais em C. crescentus, mesmo a temperaturas normais. Foram então construídas no laboratório as linhagens mutantes condicionais SG300 e SG400 de C. crescentus, onde a expressão de groESL e de dnaKJ, respectivamente, está sob controle de um promotor induzido por xilose (PxyIX). Estas linhagens foram caracterizadas quanto á sua morfologia em condições permissivas ou restritivas, assim como quanto à capacidade de sobrevivência frente a vários tipos de estresse. As células da linhagem SG300, exauridas de GroES/GroEL, são resistentes ao choque térmico a 42°C e são capazes de adquirir alguma termotolerância. Entretanto, estas células são sensíveis aos estresses oxidativo, salino e osmótico. As células da linhagem SG400, exauridas de DnaKlJ, são sensíveis ao choque térmico, à exposição a etanol e ao congelamento, e são incapazes de adquirir termotolerância. Além disso, tanto as células exauridas de GroES/GroEL quanto as exauridas de DnaK/DnaJ apresentam problemas na sua morfologia. As células de SG300 exauridas de GroES/GroEL formam filamentos longos que possuem constrições fundas e irregulares. As células de SG400 exauridas de DnaK/DnaJ são apenas um pouco mais alongadas que as células pré-divisionais selvagens e a maioria das células não possuem septo. Estas observações indicam bloqueio da divisão celular, que deve ocorrer em diferentes estágios em cada linhagem.