Otimização do método lignina brometo de acetila na determinação do teor de lignina em plantas forrageiras e comparação com os métodos lignina detergente ácido e lignina Klason

Técnicas analíticas empregadas para a quantificação do teor de lignina em plantas forrageiras, atualmente em uso, são questionáveis quanto às suas acurácias. O método lignina detergente ácido (LDA), que é um dos métodos mais utilizado em Ciência Animal e Agronomia, apresenta algumas falhas, particularmente devido à parcial solubilização da lignina durante a preparação da fibra em detergente ácido (FDA). A lignina Klason (LK), outro método muito usado, apresenta o inconveniente de mensurar a proteína da parede celular como sendo lignina. Em ambos os procedimentos recomenda-se também mensurar cinzas nos resíduos de lignina. A quantificação da concentração de lignina pelo método espectrofotométrico lignina brometo de acetila (LBA) vem ganhando interesse de pesquisadores no Brasil e no exterior. Nesta metodologia, a lignina da planta contida na preparação parede celular (PC) é solubilizada numa solução a 25% de brometo de acetila em ácido acético e a absorbância mensurada é com luz UV a 280 nm. O valor da absorbância é inserido numa equação de regressão e a concentração de lignina é obtida. Para que esta técnica analítica seja mais aceita pelos pesquisadores, ela deve ser, obviamente, convincente e atrativa. O presente trabalho analisou alguns parâmetros relacionados à LBA em 7 gramíneas e 6 leguminosas, em dois estádios de maturidade. Dentre as diferentes temperaturas de pré-secagem, os resultados indicaram que os procedimentos de 55°C com ventilação e liofilização podem ser utilizados com a mesma eficácia. As temperaturas de 55°C sem ventilação e 80°C sem ventilação não são recomendadas, pois aumentaram os valores de FDA e LDA, possivelmente devido ao surgimento de artefatos de técnica como os compostos de Maillard. No método LBA os valores menores das amostras de leguminosas chamaram a atenção e colocaram em questão se a lignina destas plantas seria menos solúvel no reagente brometo de acetila. Dentre algumas alterações na metodologia da técnica LBA, a utilização do moinho de bolas (para diminuir o tamanho particular) nas amostras de PC não mostrou efeito; a hipótese era melhorar a solubilização da lignina usando partículas menores. O uso de um ultrasonicador, que aumenta a vibração das moléculas e assim, facilitaria a solubilização da lignina no reagente brometo de acetila, melhorou a solubilização da lignina em cerca de 10%, tanto nas gramíneas como nas leguminosas. Foi acoplado um ensaio biológico como referência, a degradabilidade in vitro da matéria seca (DIVMS); e como a lignina está intimamente associada à estrutura fibrosa da parede celular, também foi feito um ensaio de degradabilidade in vitro da fibra em detergente neutro (DIVFDN). Os resultados confirmaram o efeito da maturidade, reduzindo a degradabilidade nas plantas mais maduras, e que o teor de lignina de leguminosas é realmente inferior ao de gramíneas. Os resultados de degradabilidade apresentaram coeficientes de correlação mais elevados com o método LBA, quando foi empregada a técnica do ultrasom; o método LK mostrou os menores coeficientes. Também testou-se, com sucesso, a utilização da FDN, como preparação fibrosa, ao invés de PC. A razão é simples: enquanto que a FDN é amplamente conhecida, a preparação PC não o é. Inquestionável que esta manobra facilitará substancialmente a divulgação desse método, tornando-a mais aceitável pela comunidade científica

Estudo morfológico e eletrofisiológico dos efeitos da injeção intravítrea de ácido micofenólico em coelhos utilizando um modelo de uveíte crônica experimental

Uveítes são inflamações intra-oculares geralmente crônicas e constituem uma das principais causas de cegueira no mundo. Os corticosteroides são a droga de primeira escolha para o tratamento das uveítes não infecciosas, mas muitas vezes há necessidade do uso de outras drogas imunossupressoras. O micofenolato de mofetila (MMF) é um potente imunossupressor administrado por via oral que vem sendo utilizado com sucesso no tratamento das uveítes, mas cujos efeitos colaterais muitas vezes tornam necessária sua suspensão. O MMF é uma pró-droga, que é transformada no fígado em ácido micofenólico (MPA), o imunossupressor ativo. Para minimizar os efeitos colaterais do uso do MPA e permitir que o olho receba uma dose maior da droga, testamos os efeitos da injeção intravítrea do MPA em um modelo de uveíte crônica experimental (UCE) em olhos de coelhos. Os objetivos deste estudo foram: 1) reproduzir um modelo de UCE em coelhos através da injeção intravítrea de M. tuberculosis; 2) estabelecer uma dose segura de MPA a ser injetada no vítreo; e 3) analisar os efeitos morfológicos, clínicos e eletrofisiológicos da injeção intravítrea de MPA em coelhos utilizados como modelo de UCE. O modelo de UCE reproduzido apresentou uma inflamação autolimitada, possuindo um pico de inflamação no 17° dia após a indução da uveíte. As doses de MPA testadas (0,1 e 1mg) não foram toxicas para a retina do coelho. O modelo de UCE recebeu uma injeção intravítrea de 0,1mg de MPA e as análises clinicas demonstraram uma redução na inflamação. As análises realizadas com o eletrorretinograma (ERG) também apontaram uma melhora na inflamação através da recuperação da latência das ondas-a e b (fotópicas e escotópica) e recuperação da amplitude da onda-a (fotópica). As análises morfológicas com HE não apresentaram alterações na estrutura retinia, porem a imunohistoquimica para proteína GFAP evidenciou gliose das células de Müller, sinalizando um processo inflamatório. Concluímos que o modelo de UCE reproduziu uma uveíte anterior semelhante à uveíte causada em humanos e a dose de MPA utilizada apresentou efeitos terapêuticos durante o pico de inflamação, mostrando uma diminuição da inflamação e promovendo a recuperação de fotorreceptores e células bipolares-ON. Este resultado faz das injeções intravítreas de MPA um recurso promissor no tratamento de uveítes. Porém, novos experimentos são necessários para padronizar os resultados encontrados

Resistência de células de carcinoma epidermóide bucal à terapia fotodinâmica mediada pelo ácido 5-aminolevulínico

O carcinoma epidermóide bucal (CEC) é uma neoplasia maligna com alta morbidade e mortalidade e de difícil tratamento. O tratamento convencional para o CEC inclui cirurgia e radioterapia, seguida ou não de quimioterapia. Apesar de serem amplamente difundidos, esses tratamentos podem ser ineficazes para alguns CECs resistentes. A terapia fotodinâmica (PDT) oncológica tem sido utilizada para o tratamento adjuvante do CEC bucal, principalmente nos casos menos invasivos e que necessitam de redução do tumor para a ressecção cirúrgica. Contudo, semelhantemente aos tratamentos convencionais, a PDT pode também induzir o aparecimento de populações celulares resistentes, fato já descrito para carcinoma cutâneo, adenocarcinoma de cólon e adenocarcinoma mamário. A hipótese de que células de CEC bucal possam desenvolver resistência à PDT ainda não foi testada. Portanto, o objetivo deste trabalho foi verificar se células de CEC bucal (SCC9) desenvolvem resistência a ciclos repetidos de PDT mediada pelo ácido 5- aminolevulínico (5-ALA-PDT) e avaliar se nesse processo ocorre modificação da expressão de marcadores relacionados a sobrevivência celular (NF?B, Bcl-2, iNOS, mTOR e Akt). Foi utilizada linhagem de células de CEC bucal (SCC9), submetida às seguintes condições: 1) Controle - células cultivadas sem nenhum tratamento; 2) ALA - células incubadas com 5-ALA (1mM durante 4 horas); 3) LED - tratadas com iluminação LED (630nm, 5,86J/cm2, 22,5J, 150mW, 150s); 4) PDT - tratadas com 5- ALA-PDT, com os protocolos do grupo ALA e LED combinados, gerando dose letal de 90%. Inicialmente foi realizado somente um ciclo de PDT, sendo avaliada a viabilidade celular em todos os grupos após 24, 48, 72 e 120h da irradiação. Também foi realizado ensaio de detecção da fragmentação de DNA (TUNEL) e análise por imunofluorescência da expressão das proteínas NF?B, Bcl-2, iNOS, pmTOR e pAkt nas células viáveis. Como resultado desse primeiro tratamento com 5-ALA-PDT, observou-se que as células sobreviventes ao tratamento apresentaram intensa marcação para pmTOR e exibiram potencial de crescimento durante o período analisado. Após esses ensaios, as células que sobreviveram a essa primeira sessão foram coletadas, replaqueadas e novamente cultivadas, sendo então submetidas a novo ciclo de 5-ALA-PDT. Esse processo foi realizado 5 vezes, variando-se a intensidade de irradiação à medida que se observava aumento na viabilidade celular. As populações celulares que exibiram viabilidade 1,5 vezes maior do que a detectada no primeiro ciclo PDT foram consideradas resistentes ao tratamento. Os mesmos marcadores analisados no primeiro ciclo de PDT foram novamente avaliados nas populações resistentes. Foram obtidas quatro populações celulares resistentes, com viabilidade de até 4,6 vezes maior do que a do primeiro ciclo de PDT e irradiação com LED que variou de 5,86 a 9,38J/cm2. A população mais resistente apresentou ainda menor intensidade de protoporfirina IX, maior capacidade de migração e modificação na morfologia nuclear. As populações resistentes testadas exibiram aumento na expressão de pNF?B, iNOS, pmTOR e pAkt, mas não da proteína anti-apoptótica Bcl- 2. Ensaio in vivo foi também conduzido em ratos, nos quais CEC bucal foi quimicamente induzido e tratado ou não com 5-ALA-PDT. Houve intensa expressão imuno-histoquímica das proteínas pNF?B, Bcl-2, iNOS, pmTOR e pAkt em relação ao controle não tratado, nas células adjacentes à área de necrose provocada pela PDT. Concluiu-se que as células de CEC bucal tratadas com 5-ALA-PDT a uma dose de 90% de letalidade desenvolveram viabilidade crescente após ciclos repetidos do tratamento, bem como exibiram superexpressão de proteínas relacionadas à sobrevivência celular, tanto in vitro quanto in vivo. Esses fatos, aliados à maior capacidade de migração, sugerem a aquisição de fenótipo de resistência à 5-ALAPDT. Esse aspecto deve ser cuidadosamente considerado no momento da instituição dessa terapia para os CECs bucais.

Desenvolvimento de matrizes poliméricas como veículo de ácido ascórbico: caracterização e avaliação da estabilidade

A administração de princípios ativos pela mucosa oral é uma forma eficiente para a distribuição de fármacos e nutrientes, oferecendo diversas vantagens como uma fácil aplicação, evitando o metabolismo de primeira passagem hepática e potencialmente melhorando a biodisponibilidade dessas substâncias. A acerola e o camu-camu apresentam uma alta concentração de vitamina C e são consideradas fontes de diferentes compostos ativos, porém a vitamina C presente nas frutas é facilmente oxidada pelos fatores ambientais, e essas frutas são pouco acessíveis ao consumo populacional. Filmes de desintegração oral (FDO) podem apresentar rápido tempo de desintegração e fácil administração, o que os torna um material interessante para a veiculação de compostos com atividades farmacêuticas ou nutricionais. Assim, este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento e caracterização de filmes de desintegração oral à base de amido e gelatina com adição de extrato seco de acerola e camu-camu produzidos por \"spray dryer\" como uma alternativa para a administração de vitamina C. Os FDOs foram produzidos pela técnica de casting, variando-se a proporção de amido e gelatina. Como plastificante foi utilizado o sorbitol (20 g / 100 g de polímero), mantendo-se constante a concentração de polímeros (2 g /100 g de solução filmogênica) e de extrato seco de acerola (4 g /100 g de solução filmogênica) e camu-camu (4 g / 100 g de solução filmogênica). Os extratos secos de acerola e camu-camu foram caracterizados com relação à concentração da vitamina C e da estabilidade desses extratos nessas condições (30 °C, UR 75 % e 40 °C, UR 75%). Os FDOs foram caracterizados em relação a espessura, propriedades mecânicas, ângulo de contato, FT-IR, microscopia electrônica de varredura, concentração de vitamina C, atividade antioxidante, atividade antimicrobiana, estabilidade da vitamina C, tempo de desintegração, estabilidade da atividade de eliminação de radicais de DPPH•, avaliação sensorial. Os extratos secos apresentaram uma boa estabilidade em relação à vitamina C e aos compostos antioxidantes (sequestro do radical DPPH•). Os FDOs sem adição de extrato, independente da formulação, mostraram-se homogêneos, com ausência de partículas insolúveis e alta capacidade de formação de filme. Para os FDOs com maior concentração de amido foi observado reduzido tempo de desintegração e pH próximo ao bucal. Após a adição dos extratos, os FDOs apresentaram redução do tempo de desintegração, boa aceitação sensorial, propriedades antioxidantes e estabilidade pelo sequestro do radical DPPH•. O pH de superfície dos filmes com adição de extrato seco de acerola foi mais próximo ao bucal quando comparado com os filmes com camu-camu. No entanto, os FDOs com acerola apresentaram reduzida estabilidade da vitamina C em relação ao tempo de armazenamento, enquanto que os filmes com camu-camu apresentaram melhor estabilidade. De modo geral, na formulação produzida apenas com amido (100 g de amido / 100 g de polímeros) observou-se uma maior concentração da vitamina C no final da estabilidade realizada à 30 °C e umidade relativa de 75 %, elevada estabilidade dos compostos ativos (DPPH) e alta taxa de uniformidade na distribuição da vitamina C no filme de desintegração oral. Dessa forma, os FDOs podem ser considerados uma boa alternativa para a suplementação de vitamina C.

Complexos de dirutênio com os fármacos ibuprofeno, ácido acetilsalicílico, naproxeno, indometacina, e com ácido y-linolêncio: Síntese, caracterização, avaliação da ação antiproliferativa sobre células tumorais e estudo da interação da unidade dimetálica com adenina e adenosina

Este trabalho tem como principal objetivo contribuir para o desenvolvimento de novos potenciais metalofármacos de rutênio. Nele são descritas a síntese, a caracterização e a avaliação da ação antiproliferativa de alguns complexos de dirutênio (II,III) com os fármacos antiinflamatórios não-esteróides (AINEs): ibuprofeno (ibp), ácido acetilsalicílico (aas), naproxeno (npx) e indometacina (ind) e também com o ácido γ-linolênico (lin), sobre células cancerígenas. Os compostos obtidos foram caracterizados por análise elementar, espectroscopia de absorção eletrônica, medidas de susceptibilidade magnética, espectroscopia vibracional FTIR e Raman, difratometria de raios X de pó, medidas de condutividade molar e análise térmica (TG, OTAe OSC). Todos os complexos sintetizados apresentam estrutura em gaiola, com os carboxilatos derivados dos fármacos AINEs coordenados à unidade dimetálica Ru2( (II,III), em ponte equatorial, estabilizando assim a ligação direta rutênio-rutênio. As posições axiais são ocupadas por íons cloreto, no caso dos complexos [Ru2(O2(CR)4(Cl] (O2(CR = ibp, aas, npx ou ind), ou por moléculas de água, nas espécies do tipo [Ru2(O2(CR)4(H2O)2]PF6(O2CR =npx e ind). Ensaios biológicos demonstraram que os compostos [Ru2(ibp) 4Cl]•½H2O e [Ru2(npx)4(H2O)2]PF6 apresentam ação antiproliferativa sobre células de glioma de rato C6 in vitro, dependendo do tempo de exposição do meio celular ao complexo. O complexo [Ru2 (lin)4Cl] também apresenta efeito sobre a proliferação de células C6; entretanto, nesse caso, efeitos significativos são observaçlos já nas primeiras 24 h de exposição. Estudos mostraram que as bases adenina e adenosina reagem com o complexo [Ru2(OAc)4(H2O)2]PF6 sem que ocorra quebra da estrutura em gaiola. As bases nitrogenadas substituem axialmente as moléculas de água, formando pontes axiais entre duas unidades de dirutênio (II,III) no estado sólido.

Preparação, caracterização e propriedades de lipossomas contendo o ácido -ciano-4-hidroxicinâmico e o agente fotossenbilizador AICIPc: um novo sistema carreador específico com ação sinérgica aplicado a terapia fotodinâmica

Ftalocianina de alumínio-cloro (AlClPc) é um fotossensibilizador de segunda geração em terapia fotodinâmica (TFD) caracterizado por seu caráter anfifílico e tendência de auto-agregação em meio aquoso, o que prejudica seu potencial de aplicação. O aCHC é um substrato de transportadores de monocarboxilato (MCT) superexpresso em células de MCF-7. Objetivando a solubilização da AlClPc e aumento de internalização em tecidos neoplásicos nos propomos aqui o uso de DSPC e DOPC em diferentes proporções para formar vesículas lipidicas mistas (LV) na presença de aCHC como sistemas veiculadores de fármaco. Lv foi preparado pelo método de injeção etanólica e formou vesículas de dimensões nanométricas (aproximadamente 100 nm) com bom índice de polidispersão, valores negativos de potencial zeta e estáveis em meio aquoso por mais de 50 dias. AlClPc se complexou com o fosfato das LV o que conferiu uma localização interfacial às moléculas de AlClPc como demonstrado pelos resultados de supressão de fluorescência. Medidas de anisotropia, fluorescência estática e resolvida no tempo corroboram com estes resultados e demonstram que a auto-agregação da AlClPc ocorre mesmo em lipossomas. Entretanto, a veiculação da AlClPc por LV em carcinoma de células escamosas oral (OSCC) levou a um processo de desagregação demonstrado por (FLIM). Este incrível comportamento é novo e aumenta o conhecimento científico sobre o mecanismo intracelular de ação de fotossensibilizadores em TFD. Em TFD, ambos os sistemas LVIII+AlClPc e LVIII+AlClPc+aCHC não apresentaram toxicidade no escuro no período de incubação de 3 h com as concentrações de lipídios, AlClPc e aCHC iguais a 0,15 mmol/L, 0,5 umol/L e 10,0 umol/L, respectivamente. De maneira inesperada, o sistema LVIII+AlClPc foi mais eficiente em TFD que o sistema LVIII+AlClPc+aCHC, devido ao caráter antioxidante do aCHC. Estes resultados abrem uma nova perspectiva do potencial uso de LV-AlClPc para o tratamento fotodinâmico.

Estudo do comportamento eletroquímico da liga UNS N07090 em diferentes concentrações de ácido sulfúrico.

Ligas de níquel têm atualmente uma vasta gama de aplicações, sendo a agressividade do meio e as elevadas temperaturas que estas ligas suportam, um diferencial excepcional. A liga UNS N07090, objeto deste trabalho, encontra aplicações muito diversas, entre elas turbocompressores, sistemas de exaustão e de pós-tratamento de motores a diesel. Nestas aplicações a liga está exposta a gases, que ao condensarem formam ácido sulfúrico (H2SO4). Torna-se, assim, importante, o conhecimento da resistência à corrosão da liga nesse meio. O presente trabalho tem como objetivo caracterizar o comportamento eletroquímico da liga através de curvas de polarização potenciodinâmica em diferentes concentrações de ácido sulfúrico. Observou-se que quanto maior a concentração de ácido, maior é a corrosão da liga. Este fato pode ser discutido pela adsorção do íon sulfato (SO42-), que prejudica tanto a formação quanto a cinética de crescimento da película passiva do níquel. Em contrapartida, a presença de Cr na liga UNS N07090 apresentou um benefício sobre a resistência à corrosão desta muito acima do esperado, influenciando de forma direta as curvas de polarização da liga e mantendo-a em condição de elevada resistência à corrosão em detrimento do pior desempenho observado em outros elementos pertecentes à liga, como Co, Al e Ti. Tempos de imersão de 24h em ácido sulfúrico elevam discretamente os parâmetros de corrosão da liga, mantendo-os, no entanto em patamares bastante baixos, permitindo finalmente concluir que a liga UNS N07090, quando exposta a concentrações que variam de 1M a 4M H2SO4, a 25°C, apresenta boa resistência à corrosão e que esta não se altera com o tempo de exposição. A análise dos resultados mostrou que o processo corrosivo é controlado por reações catódicas de sulfato e hidrogênio, as quais podem ter diferentes contribuições dependendo da concentração do ácido e do tempo de imersão da liga UNS N07090 no meio corrosivo.

Estresse oxidativo em porfiria hepática experimental disparada por succinilacetona - um inibidor da ácido 5-aminolevulínico desidratase

Para otimizar um modelo experimental para o estudo do desbalanço redox em porfirias relacionadas ao acúmulo de ácido 5-aminolevulínico-(ALA), via inibição da ALA desidratase-(ALA-D), ratos foram tratados com o éster metílico de succinilacetona-(SAME), um catabólito da tirosina que inibe fortemente a ALA-O, mimetízando o estado metabólico observado nos portadores de portirias e tirosinemias. Estabeleceram-se modelos de tratamento agudo por 36 e 18 h. No primeiro, os animais receberam 3 injeções de SAME (10, 40 ou 80 mg/kg, grupos Ali-IV). No segundo, os animais receberam 3 injeções de 40 mg/kg de SAME, ALA ou éster metílico de ALA (grupos BII-IV), ALA:SAME (30: 10 mg/kg, grupo BV), ou 10 mg/kg SAME (grupo BVI). Paralelamente, avaliou-se se os sintomas neurológicos característicos das portirias decorriam de danos oxidativos mitocondriais. Para isso, aplicou-se uma tecnologia óptica para medidas da difusão da depressão cortical que determinou a oxigenação e o estado redox do cit c em mitocôndrias do córtex cerebral de ratos submetidos ao tratamento crônico com ALA (40 mg/kg), SAME (10 e 40 mg/kg) e ALA:SAME (30: 1O mg/kg), a cada 48 h, durante 30 dias. Tratamento agudo/36 h: Os níveis de ALA no plasma, fígado, cérebro e urina e o clearance renal do ALA aumentaram nos grupos tratados. A atividade de ALA-D e a coproporfirina urinária reduziram. A marcação para proteínas carboniladas, ferro e ferritina aumentou no fígado e cérebro dos grupos tratados, especialmente no All. Os níveis de malondialdeído hepático aumentaram no grupo AIV. A razão GSH/GSH+GSSG e a atividade de GPx cerebrais aumentaram nos grupos AIV e AIII, respectivamente. Consistentemente com estes dados indicando um desbalanço oxidativo induzido pelo SAME, alterações mitocondriais e citosólicas ultraestruturais foram reveladas, especialmente no fígado. Tratamento agudo/18 h: Os níveis de ALA plasmáticos aumentaram nos grupos tratados, exceto em BIV. O grupo BII mostrou aumento dos níveis hepáticos de ALA. Interessantemente, a inibição da atividade de ALA-D não foi evidenciada. O conteúdo de ferro plasmático aumentou no grupo BII. Para os grupos tratados com 10 e 40 mg SAME/kg, a atividade de SOD hepática reduziu ~50% com a extensão do tratamento de 18 para 36 h, sugerindo que este último é mais efetivo em promover danos oxidativos induzidos pelo ALA. Tratamento crônico/30 dias: Embora nenhuma alteração tenha sido evidenciada no estado redox dos animais tratados, o tratamento com ALA reduziu o fluxo sanguíneo cerebral (CBF) e o consumo de oxigênio-(CMRO2), sugerindo uma vasoconstrição mediada pelo ALA, efeito este confirmado por ensaios de reatividade vascular conduzidos em anéis de aorta de ratos incubados com ALA. O tratamento com ALA:SAME restaurou os níveis de CBF e CMRO2. Interessantemente, a disponibilidade do radical superóxido-(O2•-) estava reduzida nos anéis de aorta incubados com ALA. Juntos, estes dados: a)validam o modelo de tratamento agudo/36 h para o estudo bioquímico e dos possíveis efeitos fisiológicos induzidos pelo ALA, e b)sugerem que as alterações mediadas pelo ALA exógeno levam à vasoconstrição.