Identificação de peptídeos de Escherichia coli capazes de inibir a própria fagocitose em sepse

Introdução: Sepse é uma síndrome complexa definida por resposta inflamatória sistêmica, de origem infecciosa e caracterizada por manifestações múltiplas que podem determinar disfunção ou falência de um ou mais órgãos ou sistemas. É a principal causa de morte em unidades de terapia intensiva em pacientes críticos e tem representado uma fonte constante de preocupação para os sistemas de saúde em todo o mundo, devido, principalmente, às taxas elevadas de morbimortalidade. O tratamento da sepse é um desafio e continua a ser uma tarefa difícil devido a inúmeros fatores interferentes. Um estudo do nosso grupo demonstrou que a Escherichia coli (E. coli) é capaz de se ligar CD16 de um modo independente de opsonina, levando a um aumento na resposta inflamatória e a inibição da sua própria fagocitose, por conseguinte, procurou-se identificar os peptídeos no proteoma da E. coli envolvidos neste cenário. Metodologia: Utilizando a metodologia de Phage Display, que consiste numa técnica de clonagem, que permite a expressão de diversas sequências de peptídeos na superfície de bacteriófagos, nós identificamos 2 peptídeos que obtiveram interação com CD16. Após a seleção dos peptídeos identificamos uma proteína de membrana de E.coli que possui alta similaridade com um de nossos peptídeos selecionados. Nós acreditamos que esta proteína de membrana possa estar envolvida no processo de evasão imune desenvolvida pela E.coli e parece ser um forte candidato como uma nova opção terapêutica para controlar infecções por E. coli. Conclusão: A identificação de proteínas capazes de induzir inibição de fagocitose, através do receptor CD16, pode ser usada como uma nova forma de tratamento da sepse, assim como explorada no tratamento de doenças autoimunes

Interações moleculares no mecanismo de ação da galectina-4 humana

A galectina-4 humana (HGal-4), pertencente à família das galectinas, possui dois domínios de reconhecimento de carboidratos (CRDs) com alta afinidade para β-galactosídeos e se encontra amplamente distribuída em células normais e neoplásicas de diferentes organismos. Suas funções snglobam uma grande variedade de eventos celulares, tais como processos inflamatórios, neoplásicos, progressão tumoral e metástase. Entretanto, muitas perguntas sobre suas interações com diferentes carboidratos, a especificidade destas interações e o papel específico das galectinas permanecem ainda sem resposta. No presente trabalho, propomos a investigação das interações galectina-glicano da galectina-4 humana e de seus domínios CRDs independentes (CRD-I e CRD-II) através de um conjunto de métodos biofísicos. Através do método de dicroísmo circular (CD), usando várias regiões espectrais, e fluorescência fomos capazes de entender mudanças ocorrentes na estrutura secundária e terciária das protéinas quando da interação com lactose/sacarose. Estes dados, juntamente com testes de hemaglutinação, mostraram que a glectina-4 e os CRDs respondem de forma distinta à ligação com açúcar. Por diferentes técnicas (fluorescência, ITC e MST) determinamos as constantes de dissociação para os domínios CRDs (Kd ~0,5 mM) e para HGal-4 e, de forma qualitativa, os valores obtidos indicaram possíveis estados oligoméricos dessas proteínas. A investigação da interação proteína-membrana da HGal-4 foi feita, primeiramente, com miméticos de membranas e monitorada pela técnica de RPE em crescente complexidade de composição de tais miméticos, indo desde composições mais simples, passando por lipid rafts na presença de diferentes glicolipídeos (GM1, LPS) e chegando-se à interação com células tumorais (U87MG, T98G e HT-29). Tais experimentos mostraram que galectina-4 reconhece e se liga naqueles modelos onde existem glicanos complexos na superfície. Investigamos também a participação de HGal-4 endógena e exógena no tratamento quimioterápico de células tumorais e verificamos um papel importante de HGal-4 para células HT-29. Finalizando esta tese, apresentamos o trabalho realizado em um ano de estágio na University of Oxford, durante o qual, investigamos a estrutura da região C-terminal de um receptor da família GPCR, qual seja o receptor de neurotensina NTS1. Aqui, mais uma vez, foi empregada a técnica de RPE que aliada à produção/marcação de mutantes do receptor, permitiu determinar que a hélice H8 se estabiliza quando em proteolipossomos.

Cristalização assistida por destilação por membranas aplicada ao reuso de água: comparação com outros métodos de reuso, análise do processo e projeto hierárquico de processo.

No presente trabalho foram avaliados processos alternativos de dessalinização visando a recuperação e reuso da água contida em salmouras concentradas, sendo o processo de cristalização assistida por destilação por membranas (MDC) investigado com profundidade. Foi desenvolvido um modelo diferencial para o processo de destilação por membranas por contato direto (DCMD), contemplando métodos termodinâmicos rigorosos para sistemas aquosos de eletrólitos fortes, bem como mecanismos de transferência de calor e massa e efeitos de polarização de temperatura e concentração característicos deste processo de separação. Com base em simulações realizadas a partir do modelo matemático assim desenvolvido, foram investigados os principais parâmetros que influenciam o projeto de um módulo de membranas para DCMD. O modelo foi posteriormente estendido com equações de balanço de massa e energia adicionais para incluir a operação de cristalização e desta forma representar o processo de MDC. De posse dos resultados das simulações e do modelo estendido, foi desenvolvido um método hierárquico para o projeto de processos de MDC, com o objetivo de conferir características de rastreabilidade e repetibilidade a esta atividade. Ainda a partir do modelo MDC foram discutidos aspectos importantes em MDC como a possibilidade de nucleação e crescimento de cristais sobre a superfície das membranas, bem como o comportamento do processo com sais com diferentes características de solubilidade e largura da zona metaestável. Verificou-se que para sais cuja solubilidade varia muito pouco com a temperatura e que possuem zona metaestável com pequena largura, caso do NaCl, a operação com resfriamento no cristalizador não é viável pois aumenta excessivamente o consumo energético do processo, sendo nesses casos preferível a operação \"isotérmica\" - sem resfriamento no cristalizador - e o convívio com a possibilidade de nucleação no interior do módulo. No extremo oposto, observou-se que para sais com grande variabilidade da solubilidade com a temperatura, um pequeno resfriamento no cristalizador é suficiente para garantir condições de subsaturação no interior do módulo, sem grande ônus energético para o processo. No caso de sais com pequena variabilidade da solubilidade com a temperatura, mas com largura da zona metaestável elevada, existe certo ônus energético para a operação com resfriamento do cristalizador, porém não tão acentuado como no caso de sais com zona metaestável estreita. Foi proposto um fluxograma alternativo para o processo de MDC, onde foi introduzido um circuito de pré-concentração da alimentação antes do circuito de cristalização, para o caso de alimentação com soluções muito diluídas. Este esquema proporcionou um aumento do fluxo permeado global do processo e consequentemente uma redução na área total de membrana requerida. Verificou-se que através do processo com préconcentração da alimentação de 5% até 10% em massa - no caso de dessalinização de uma solução de NaCl - foi possível reduzir-se a área total da membrana em 27,1% e o consumo energético específico do processo em 10,6%, quando comparado ao processo sem pré-concentração. Foram desenvolvidas ferramentas úteis para o projeto de processos de dessalinização por MDC em escala industrial.

Ligantes de miócitos cardíacos para a glicoproteína de 85kda. (tc-85) de Trypanosoma cruzi

O Trypanosoma cruzi expressa um grupo de glicoprotcinas de superfície, denominadas Tc-85, que pertencem à superfumília gêmca das gp85/traus-sialidases. Nosso laboratório clonou e caracterizou um membro da fumília Tc85 (Tc85-11), cuja região carboxila tenninal (clone Tc85-1) adere em laminina e em células de mamífero. Usando peptídeos sintéticos, correspondendo em seqüência à Tc85-1, caracterizou-se o motivo mais conservado da superfamilia gênica das gp85/trans-sialidases (VTVxNVFLYNR), o qual não adere em laminina. Esse motivo foi chamado peptídeo J. Por cromatografia de extratos de membrana de cardiomiócitos em coluna de afmidade contendo peptídeo J, foi isolada uma molécula de 30kDa identificada como sendo a subunidade β3 da Na+, K+ ATPase. A porção extracelular da subunidade β3 da Na+, K+ ATPase foi clonada e a interação in vitro desta proteína com peptídeo J foi observada. Deste modo, é sugerido aqui que a subunidade β3 da Na+, K+ ATPase pode ter um papel importante na interação do parasita com a célula hospedeira.

Preparação, caracterização e propriedades de lipossomas contendo o ácido -ciano-4-hidroxicinâmico e o agente fotossenbilizador AICIPc: um novo sistema carreador específico com ação sinérgica aplicado a terapia fotodinâmica

Ftalocianina de alumínio-cloro (AlClPc) é um fotossensibilizador de segunda geração em terapia fotodinâmica (TFD) caracterizado por seu caráter anfifílico e tendência de auto-agregação em meio aquoso, o que prejudica seu potencial de aplicação. O aCHC é um substrato de transportadores de monocarboxilato (MCT) superexpresso em células de MCF-7. Objetivando a solubilização da AlClPc e aumento de internalização em tecidos neoplásicos nos propomos aqui o uso de DSPC e DOPC em diferentes proporções para formar vesículas lipidicas mistas (LV) na presença de aCHC como sistemas veiculadores de fármaco. Lv foi preparado pelo método de injeção etanólica e formou vesículas de dimensões nanométricas (aproximadamente 100 nm) com bom índice de polidispersão, valores negativos de potencial zeta e estáveis em meio aquoso por mais de 50 dias. AlClPc se complexou com o fosfato das LV o que conferiu uma localização interfacial às moléculas de AlClPc como demonstrado pelos resultados de supressão de fluorescência. Medidas de anisotropia, fluorescência estática e resolvida no tempo corroboram com estes resultados e demonstram que a auto-agregação da AlClPc ocorre mesmo em lipossomas. Entretanto, a veiculação da AlClPc por LV em carcinoma de células escamosas oral (OSCC) levou a um processo de desagregação demonstrado por (FLIM). Este incrível comportamento é novo e aumenta o conhecimento científico sobre o mecanismo intracelular de ação de fotossensibilizadores em TFD. Em TFD, ambos os sistemas LVIII+AlClPc e LVIII+AlClPc+aCHC não apresentaram toxicidade no escuro no período de incubação de 3 h com as concentrações de lipídios, AlClPc e aCHC iguais a 0,15 mmol/L, 0,5 umol/L e 10,0 umol/L, respectivamente. De maneira inesperada, o sistema LVIII+AlClPc foi mais eficiente em TFD que o sistema LVIII+AlClPc+aCHC, devido ao caráter antioxidante do aCHC. Estes resultados abrem uma nova perspectiva do potencial uso de LV-AlClPc para o tratamento fotodinâmico.