From Polymorph Screening to Dissolution Testing - Solid Phase Analysis during Pharmaceutical Development and Manufacturing

Solid materials can exist in different physical structures without a change in chemical composition. This phenomenon, known as polymorphism, has several implications on pharmaceutical development and manufacturing. Various solid forms of a drug can possess different physical and chemical properties, which may affect processing characteristics and stability, as well as the performance of a drug in the human body. Therefore, knowledge and control of the solid forms is fundamental to maintain safety and high quality of pharmaceuticals. During manufacture, harsh conditions can give rise to unexpected solid phase transformations and therefore change the behavior of the drug. Traditionally, pharmaceutical production has relied on time-consuming off-line analysis of production batches and finished products. This has led to poor understanding of processes and drug products. Therefore, new powerful methods that enable real time monitoring of pharmaceuticals during manufacturing processes are greatly needed. The aim of this thesis was to apply spectroscopic techniques to solid phase analysis within different stages of drug development and manufacturing, and thus, provide a molecular level insight into the behavior of active pharmaceutical ingredients (APIs) during processing. Applications to polymorph screening and different unit operations were developed and studied. A new approach to dissolution testing, which involves simultaneous measurement of drug concentration in the dissolution medium and in-situ solid phase analysis of the dissolving sample, was introduced and studied. Solid phase analysis was successfully performed during different stages, enabling a molecular level insight into the occurring phenomena. Near-infrared (NIR) spectroscopy was utilized in screening of polymorphs and processing-induced transformations (PITs). Polymorph screening was also studied with NIR and Raman spectroscopy in tandem. Quantitative solid phase analysis during fluidized bed drying was performed with in-line NIR and Raman spectroscopy and partial least squares (PLS) regression, and different dehydration mechanisms were studied using in-situ spectroscopy and partial least squares discriminant analysis (PLS-DA). In-situ solid phase analysis with Raman spectroscopy during dissolution testing enabled analysis of dissolution as a whole, and provided a scientific explanation for changes in the dissolution rate. It was concluded that the methods applied and studied provide better process understanding and knowledge of the drug products, and therefore, a way to achieve better quality.

Temporal acuity in developmental dyslexia across the life span : Tactile, auditory, visual, and crossmodal estimations

Taustaa Kehityksellinen dysleksia (lukivaikeus) on erityinen lukemaan oppimisen vaikeus, johon liittyy usein myös vaikeuksia kirjoittamaan oppimisessa. Lukivaikeuden oletetaan useissa tapauksissa johtuvan vaikeudesta käsitellä kielen äännerakenteita (fonologinen prosessointi). Tämä poikkeavuus voi olla joko lukivaikeuden perimmäinen syy tai vaihtoehtoisesti ongelmat äänteiden käsittelyssä voivat heijastaa jotain vielä perustavamman tason vaikeutta. Eräs tällainen ehdotettu perustavan tasoin syy on poikkeavuus aistien toiminnoissa, erityisesti aistien aikatarkkuudessa. Aikatarkkuudella tarkoitetaan kykyä ja rajoja siinä, kuinka nopeasti esitettyä aistitiedon virtaa henkilö kykenee vastaanottamaan ja käsittelemään. Monet arjen toiminnot lukemisen rinnalla edellyttävät aistien erittäin tarkkaa ajallista erottelukykyä (esimerkiksi kuulo puheen ymmärtämisessä, tunto pintamateriaalin tunnistamisessa). Aikatarkkuusvaikeuksien esiintyvyyttä lukivaikeudessa on tutkittu aiemminkin, mutta yksimielisyyteen ei ole päästy siitä, onko kaikilla lukivaikeuksisilla näitä ongelmia tai mihin aisteihin vaikeudet mahdollisesti rajoittuvat. Myöskään ei tiedetä, havaitaanko aikatarkkuuden ongelmia kaiken ikäisillä lukivaikeuksisilla vai vaihteleeko mahdollinen ongelmien kuva iän mukana. Lisäksi on epäselvää, kuinka aikatarkkuuden ongelmat itseasiassa ovat yhteydessä kielen käsittelyn ja varsinaisen lukemisen vaikeuksiin. Tutkimussarjan aihe Tässä tutkimussarjassa aikatarkkuutta tutkittiin kolmessa yksittäisessä aistissa, joita olivat tunto, näkö ja kuulo, sekä kolmessa aistien välisessä yhdistelmässä, joita olivat audiotaktiilinen (kuulo-tunto), visuotaktiilinen (näkö-tunto) ja audiovisuaalinen (näkö-kuulo). Aikatarkkuutta arvioitiin kahdella eri menetelmällä, jotta saataisiin lisää tietoa siitä, missä tietyssä aikatarkkuuden osa-alueessa lukivaikeuksisilla mahdollisesti on vaikeuksia. Ensimmäisessä tehtävässä tutkittavan tuli arvioida, ovatko esitetyt ei-kielelliset ärsykkeet samanaikaisia vai eriaikaisia. Toisessa tehtävässä koehenkilön tuli arvioida esitettyjen ei-kielellisten ärsykkeiden esitysjärjestys. Molemmissa tehtävissä määriteltiin millisekuntitasolla (sekunnin tuhannesosa) se esitysnopeus, jolla koehenkilö kykeni arvioimaan ärsykkeiden ajalliset suhteet oikein. Englanninkielinen demonstraatio aikatarkkuustehtävistä löytyy internetistä (http://www.helsinki.fi/hum/ylpsy/neuropsy). Itse aikatarkkuustehtävien lisäksi tutkimussarjassa arvioitiin tutkimushenkilöiden päättelykykyä, kielellisiä toimintoja ja lukemista. Tutkimushenkilöt Tutkimuksiin osallistui 53 lukivaikeuksista ja 66 sujuvaa lukijaa, jotka oli jaettu kolmeen pääikäryhmään: lapset (8-12 vuotta), nuoret aikuiset (20-36 vuotta) ja ikääntyneemmät aikuiset (20-59 vuotta). Ikääntyneempien aikuisten ryhmä oli edelleen jaettu ikävuosikymmenluokkiin, mikä mahdollisti sen tutkimisen, vaikuttaako lisääntyvä aikuisikä lukivaikeuksisten aikatarkkuuteen (20-29, 30-39, 40-49 ja 50-59 -vuotiaat). Tutkimussarjan tulokset Aikatarkkuuden ongelmat lukivaikeuksisilla olivat yleistyneitä yli iän, aistien ja tehtävien Lukivaikeuksiset kaikissa pääikäryhmissä (lapset, nuoret aikuiset, ikääntyneemmän aikuiset) tarvitsivat samanikäisiä sujuvia lukijoita hitaamman esitystahdin, jotta he kykenivät arvioimaan ei-kielellisten ärsykkeiden ajallisen esitystavan oikein. Tämä aikatarkkuuden ongelma havaittiin lukivaikeuksisilla kaikissa aisteissa (tunto, kuulo, näkö) ja niiden yhdistelmissä (audiotaktiilinen, visuotaktiilinen, audiovisuaalinen). Lukivaikeuksisten aikatarkkuusongelmat ilmenivät edelleen molemmissa tehtävätyypeissä (samanaikaisuuden ja järjestyksen arvioinnissa). Aikatarkkuus ja sen ongelmat olivat yhteydessä äänteiden käsittelyyn Aikatarkkuus oli yhteydessä äänteiden käsittelykykyyn (fonologiseen prosessointiin), niin lapsilla kuin aikuisillakin, kaikissa aisteissa, niiden yhdistelmissä ja tehtävätyypeissä. Yhteys ei-kielellisen aikatarkkuuden ja kielellisten toimintojen välillä oli kuitenkin selkeämpi lukivaikeuksisilla kuin sujuvilla lukijoilla. Tämä tarkoittaa, että etenkin lukivaikeuksisilla ryhmätason huono aikatarkkuus oli yhteydessä huonoon äänteiden käsittelyyn (fonologiseen prosessointiin) ja päinvastoin. Suoraa yhteyttä lukemisen ja aikatarkkuuden välillä ei kuitenkaan havaittu. Lisääntyvä aikuisikä heikensi lukivaikeuksisten aikatarkkuutta suhteettoman paljon Tiedonkäsittelyn nopeuden on toistuvasti osoitettu hidastuvan normaalissa ikääntymisessä. Lisääntyvä aikuisikä (20-59 -vuotiailla) heikensikin sekä sujuvien että lukivaikeuksisten aikatarkkuutta. Toisin sanoen, mitä iäkkäämmästä aikuisesta oli kysymys, sitä hitaammin hänelle tuli esittää ärsykkeet, jotta hän kykeni arvioimaan niiden ajalliset suhteet oikein. Tämä ikään liittyvä tavanomainen hidastuminen oli kuitenkin yllättäen suhteettoman nopeaa lukivaikeuksisilla. Toisin sanoen, jo nuorilla lukivaikeuksisilla havaittu aikatarkkuuden vaikeus (ryhmäero verrattuna sujuviin lukijoihin) ei pysynyt saman suuruisena, vaan ryhmien ero kasvoi aikuisiän lisääntyessä. Tulosten merkitys Lukivaikeuden osoitettiin tässä tutkimussarjassa olevan yhteydessä yleistyneeseen vaikeuteen käsitellä ajassa nopeasti muuttuvaa ei-kielellistä aistitietoa (yli aistien ja niiden yhdistelmien, tehtävätyyppien, tutkittavien iän). Tämä osoittaa, että lukivaikeus ei ole ongelma, joka rajoittuu vain kielellisen materiaalin käsittelyn vaikeuksiin (äänteiden käsittely, lukeminen, kirjoittaminen). Nyt havaitut vaikeudet eivät myöskään rajoittuneet vain niihin aisteihin, jotka selkeimmin liittyvät lukemiseen (näkö) ja puhuttuun kieleen (kuulo); Ongelmia esiintyi myös muissa aisteissa (tunto). Lukivaikeuksisten lukijoiden ryhmätasolla havaittu aikatarkkuuden ongelma ei kuitenkaan heijastunut yksilötasolle; Jokainen lukivaikeuksinen ei ollut huono aikatarkkuustehtävissä. Näin ollen ei siis voida väittää, että kaikkien lukivaikeuksisten äänteiden käsittelyn tai lukemaan oppimisen vaikeudet voisivat selittyä aistien toimintojen poikkeavuudella. Aikatarkkuuden ongelmat eivät olleet yhteydessä varsinaiseen lukemiseen. Sekä lukivaikeuksisilla lapsilla että aikuisilla todettiin kuitenkin selkeä yhteys aikatarkkuuden ongelmien ja lukemaan oppimisen keskeisen ennakkoehdon, fonologisen prosessoinnin, välillä. Saattaa siis olla, että synnynnäinen aistien toimintojen poikkeavuus vaikuttaa yksilön suoriutumiseen jo ennen varsinaista lukemaan oppimista, kun ne taidot kehittyvät (fonologinen prosessointi), joille myöhempi lukemaan oppiminen perustuu. Ikäännyttäessä havaittu lukivaikeuksisten suhteettoman nopea aikatarkkuuden heikkeneminen osoittaa, että lukivaikeus ei voi olla ongelma, joka koskee vain lapsuusikää, tai vaikeus, joka johtuu vain kehityksen viivästymästä joka kurottaisiin iän myötä umpeen. Tulosten ymmärtämiseksi onkin muistettava kaksi seikkaa. Lukivaikeus on ensinnäkin yhdistetty synnynnäisiin, pieniin, poikkeavuuksiin aivojen rakenteissa ja toiminnoissa. Toisaalta tavanomaiseen ikääntymiseen liittyy se, että aivot kykenevät yhä huonommin korjaamaan ja kiertämään (kompensoimaan) pieniä vaurioita. Tämän perusteella tutkimussarjan tuloksista voidaan päätellä, että lukivaikeuksisten jo synnynnäisesti heikentyneet aivojen kompensointimahdollisuudet eivät ole yhtä tehokkaita puskuroimaan ikääntymisen tavanomaisia vaikutuksia kuin sujuvilla lukijoilla. Yllättävää kuitenkin on, että tämä korostunut heikkeneminen havaittiin jo suhteellisen nuorilla, työikäisillä, lukivaikeuksisilla, ennen 60 ikävuotta. Samanlaista ikäännyttäessä korostuvaa vaikeutta ei lukivaikeuksilla kuitenkaan havaittu päättelyssä, kielellisissä toiminnoissa tai itse lukemisessa. Vaikuttaakin siis siltä, että ne toiminnot, joita on harjaannutettu aktiivisesti, eivät heikkene kasvavan aikuisiän myötä yhtä suhteettomasti. Alkuperäiset artikkelit Laasonen M, Tomma-Halme J, Lahti-Nuuttila P, Service E, and Virsu V (2000) Rate of information segregation in developmentally dyslexic children, Brain and Language, 75(1), 66-81. Laasonen M, Service E, and Virsu V (2001) Temporal order and processing acuity of visual, auditory, and tactile perception in developmentally dyslexic young adults, Cognitive, Affective, and Behavioral Neuroscience, 1(4), 394-410. Laasonen M, Service E, and Virsu V (2002) Crossmodal temporal order and processing acuity in developmentally dyslexic young adults, Brain and Language, 80(3), 340-354. Laasonen M, Lahti-Nuuttila P, and Virsu V (2002) Developmentally impaired processing speed decreases more than normally with age, NeuroReport, 13(9), 1111-1113.

Developmental origins of psychological vulnerability factors for mental disorders

Premature birth and associated small body size are known to affect health over the life course. Moreover, compelling evidence suggests that birth size throughout its whole range of variation is inversely associated with risk for cardiovascular disease and type 2 diabetes in subsequent life. To explain these findings, the Developmental Origins of Health and Disease (DOHaD) model has been introduced. Within this framework, restricted physical growth is, to a large extent, considered either a product of harmful environmental influences, such as suboptimal nutrition and alterations in the foetal hormonal milieu, or an adaptive reaction to the environment. Whether inverse associations exist between body size at birth and psychological vulnerability factors for mental disorders is poorly known. Thus, the aim of this thesis was to study in three large prospective cohorts whether prenatal and postnatal physical growth, across the whole range of variation, is associated with subsequent temperament/personality traits and psychological symptoms that are considered vulnerability factors for mental disorders. Weight and length at birth in full term infants showed quadratic associations with the temperamental trait of harm avoidance (Study I). The highest scores were characteristic of the smallest individuals, followed by the heaviest/longest. Linear associations between birth size and psychological outcomes were found such that lower weight and thinness at birth predicted more pronounced trait anxiety in late adulthood (Study II); lower birth weight, placental size, and head circumference at 12 months predicted a more pronounced positive schitzotypal trait in women (Study III); and thinness and smaller head circumference at birth associated with symptoms of attention-deficit hyperactivity disorder (ADHD) in children who were born at term (Study IV). These associations occured across the whole variation in birth size and after adjusting for several confounders. With respect to growth after birth, individuals with high trait anxiety scores in late adulthood were lighter in weight and thinner in infancy, and gained weight more rapidly between 7 and 11 years of age, but weighed less and were shorter in late adulthood in relation to weight and height measured at 11 years of age (Study II). These results suggest that a suboptimal prenatal environment reflected in smaller birth size may affect a variety of psychological vulnerability factors for mental disorders, such as the temperamental trait of harm avoidance, trait anxiety, schizotypal traits, and symptoms of ADHD. The smaller the birth size across the whole range of variation, the more pronounced were these psychological vulnerability factors. Moreover, some of these outcomes, such as trait anxiety, were also predicted by patterns of growth after birth. The findings are concordant with the DOHaD model, and emphasise the importance of prenatal factors in the aetiology of not only mental disorders but also their psychological vulnerability factors.

Developmental, functional brain imaging and electrophysiological evidence of visual and auditory working memory

Intact function of working memory (WM) is essential for children and adults to cope with every day life. Children with deficits in WM mechanisms have learning difficulties that are often accompanied by behavioral problems. The neural processes subserving WM, and brain structures underlying this system, continue to develop during childhood till adolescence and young adulthood. With functional magnetic resonance imaging (fMRI) it is possible to investigate the organization and development of WM. The present thesis aimed to investigate, using behavioral and neuroimaging methods, whether mnemonic processing of spatial and nonspatial visual information is segregated in the developing and mature human brain. A further aim in this research was to investigate the organization and development of audiospatial and visuospatial information processing in WM. The behavioral results showed that spatial and nonspatial visual WM processing is segregated in the adult brain. The fMRI result in children suggested that memory load related processing of spatial and nonspatial visual information engages common cortical networks, whereas selective attention to either type of stimuli recruits partially segregated areas in the frontal, parietal and occipital cortices. Deactivation mechanisms that are important in the performance of WM tasks in adults are already operational in healthy school-aged children. Electrophysiological evidence suggested segregated mnemonic processing of visual and auditory location information. The results of the development of audiospatial and visuospatial WM demonstrate that WM performance improves with age, suggesting functional maturation of underlying cognitive processes and brain areas. The development of the performance of spatial WM tasks follows a different time course in boys and girls indicating a larger degree of immaturity in the male than female WM systems. Furthermore, the differences in mastering auditory and visual WM tasks may indicate that visual WM reaches functional maturity earlier than the corresponding auditory system. Spatial WM deficits may underlie some learning difficulties and behavioral problems related to impulsivity, difficulties in concentration, and hyperactivity. Alternatively, anxiety or depressive symptoms may affect WM function and the ability to concentrate, being thus the primary cause of poor academic achievement in children.

Mammographic mass-screening and future breast cancer burden in Finland

A population-based early detection program for breast cancer has been in progress in Finland since 1987. According to regulations during the study period 1987-2001, free of charge mammography screening was offered every second year to women aged 50-59 years. Recently, the screening service was decided to be extended to age group 50-69. However, the scope of the program is still frequently discussed in public and information about potential impacts of mass-screening practice changes on future breast cancer burden is required. The aim of this doctoral thesis is to present methodologies for taking into account the mass-screening invitation information in breast cancer burden predictions, and to present alternative breast cancer incidence and mortality predictions up to 2012 based on scenarios of the future screening policy. The focus of this work is not on assessing the absolute efficacy but the effectiveness of mass-screening, and, by utilizing the data on invitations, on showing the estimated impacts of changes in an existing screening program on the short-term predictions. The breast cancer mortality predictions are calculated using a model that combines incidence, cause-specific and other cause survival on individual level. The screening invitation data are incorporated into modeling of breast cancer incidence and survival by dividing the program into separate components (first and subsequent rounds and years within them, breaks, and post screening period) and defining a variable that gives the component of the screening program. The incidence is modeled using a Poisson regression approach and the breast cancer survival by applying a parametric mixture cure model, where the patient population is allowed to be a combination of cured and uncured patients. The patients risk to die from other causes than breast cancer is allowed to differ from that of a corresponding general population group and to depend on age and follow-up time. As a result, the effects of separate components of the screening program on incidence, proportion of cured and the survival of the uncured are quantified. According to the predictions, the impacts of policy changes, like extending the program from age group 50-59 to 50-69, are clearly visible on incidence while the effects on mortality in age group 40-74 are minor. Extending the screening service would increase the incidence of localized breast cancers but decrease the rates of non-localized breast cancer. There were no major differences between mortality predictions yielded by alternative future scenarios of the screening policy: Any policy change would have at the most a 3.0% reduction on overall breast cancer mortality compared to continuing the current practice in the near future.

Fumarate Hydratase and Succinate Dehydrogenase in Neoplasia

Germline mutations in fumarate hydratase (FH) cause hereditary leiomyomatosis and renal cell cancer (HLRCC). FH is a nuclear encoded enzyme which functions in the Krebs tricarboxylic acid cycle, and homozygous mutation in FH lead to severe developmental defects. Both uterine and cutaneous leiomyomas are components of the HLRCC phenotype. Most of these tumours show loss of the wild-type allele and, also, the mutations reduce FH enzyme activity, which indicate that FH is a tumour suppressor gene. The renal cell cancers associated with HLRCC are of rare papillary type 2 histology. Other genes involved in the Krebs cycle, which are also implicated in neoplasia are 3 of the 4 subunits encoding succinate dehydrogenase (SDH); mutations in SHDB, SDHC, and SDHD predispose to paraganglioma and phaeochromocytoma. Although uterine leiomyomas (or fibroids) are very common, the estimations of affected women ranging from 25% to 77%, not much is known about their genetic background. Cytogenetic studies have revealed that rearrangements involving chromosomes 6, 7, 12 and 14 are most commonly seen in fibroids. Deletions on the long arm of chromosome 7 have been reported to be involved in about 17 to 34 % of leiomyomas and the small commonly deleted region on 7q22 suggests that there might be an underlying tumour suppressor gene in that region. The purpose of this study was to investigate the genetic mechanisms behind the development of tumours associated with HLRCC, both renal cell cancer and uterine fibroids. Firstly, a database search at the Finnish cancer registry was conducted in order to identify new families with early-onset RCC and to test if the family history was compatible with HLRCC. Secondly, sporadic uterine fibroids were tested for deletions on 7q in order to define the minimal deleted 7q-region, followed by mutation analysis of the candidate genes. Thirdly, oligonucleotide chips were utilised to study the global gene expression profiles of uterine fibroids in order to test whether 7q-deletions and FH mutations significantly affected fibroid biology. In the screen for early-onset RCC, 214 families were identified. Subsequently, the pedigrees were constructed and clinical data obtained. One of the index cases (RCC at the age of 28) had a mother who had been diagnosed with a heart tumour, which in further investigation turned out to be a paraganglioma. This lead to an alternative hypothesis that SDH, instead of FH, could be involved. SDHA, SDHB, SDHC and SDHD were sequenced from these individuals; a germline SDHB R27X mutation was detected with loss of the wild-type allele in both tumours. These results suggest that germline mutations in the SDHB gene predispose to early-onset RCC establishing a novel form of hereditary RCC. This has immediate clinical implications in the surveillance of patients suffering from early-onset RCC and phaeochromocytoma/paraganglioma. For the studies on sporadic uterine fibroids, a set of 166 fibroids from 51 individuals were collected. The 7q LOH mapping defined a commonly deleted region of about 3.2 mega bases in 11 of the 166 tumours. The deletion was consistent with previously reported allelotyping studies of leiomyomas and it therefore suggested the presence of a tumour suppressor gene in the deleted region. Furthermore, the high-resolution aCGH-chip analysis refined the deleted region to only 2.79Mb. When combined with previous data, the commonly deleted region was only 2.3Mb. The mutation screening of the known genes within the commonly deleted region did not reveal pathogenic mutations, however. The expression microarray analysis revealed that FH-deficient fibroids, both sporadic and familial, had their distinct gene expression profile as they formed their own group in the unsupervised clustering. On the other hand, the presence or absence of 7q-deletions did not significantly alter the global gene expression pattern of fibroids, suggesting that these two groups do not have different biological backgrounds. Multiple differentially expressed genes were identified between FH wild-type and FH-mutant fibroids, and the most significant increase was seen in the expression of carbohydrate metabolism-related and hypoxia inducible factor (HIF) target genes.

Time to rest : Signals in shoot apex developmental transitions underlying dormancy

Vuodenajat rytmittävät monivuotisten kasvien elämää pohjoisella pallonpuoliskolla, jolla varmin merkki lähestyvästä talvikaudesta on asteittain lyhenevä päivänpituus. Kun päivänpituus on lyhentynyt tiettyyn raja-arvoon saakka, kasvu hiipuu ja kasvin kehityksessä tapahtuu suuria muutoksia. Väitöskirjatyössäni tutkittiin mekanismeja, jotka liittyvät pituuskasvun päättymiseen, silmujen lepotilan kehittymiseen ja kärkisilmun muodostumiseen hybridihaavan ja koivuntaimilla lyhyen päivänpituuden seurauksena kasvihuoneolosuhteissa. Vain lepotilaiset silmut selviytyvät luonnossa ankaran talvikauden yli, joten etenkin lepotilan kehittymisen tutkiminen on keskeistä pyrittäessä selvittämään monivuotisille kasveille tyypillisen kasvutavan mekanismeja. Jo pitkään on tiedetty, että täysikasvuiset lehdet vastaanottavat tiedon päivänpituudesta ja lähettävät signaaleja varren johtojänteissä ylöspäin kohti kasvin kärkiosaa. Sen sijaan varren kärjen ja kärkikasvupisteen roolia lepotilan kehittymisessä on selvitetty vain vähän. Kuitenkin juuri kärkikasvupisteen selviytyminen vuodesta toiseen on tärkeää, koska sen jakautumiskykyiset solukot tuottavat kasvin maanpäälliset osat. Tässä työssä tehdyissä varttamiskokeissa osoitettiin, että varren kärki ei ainoastaan vastaanota signaaleja lehdistä ja ajoita toimintaansa niiden mukaan, vaan myös kärjellä itsellään on aktiivinen rooli lepotilan kehittymisessä. Erityisesti kiinnitettiin huomiota kärkikasvupisteen eri alueiden, ns. apikaalimeristeemin ja rib-meristeemin erilaisiin tehtäviin ja pääteltiin, että molemmat vaikuttavat lepotilan kehittymiseen. Kokeissa käytettiin normaalien hybridihaapojen lisäksi siirtogeenisiä hybridihaapoja, jotka eivät lopeta kasvuaan lyhyt päivä –olosuhteissa. Siirtogeeniset hybridihaavat ilmensivät voimakkaasti fytokromi A -nimistä valon vastaanottajamolekyyliä rib-meristeemin alueella, mikä saattoi osaltaan vaikuttaa poikkeavaan pituuskasvukäyttäytymiseen. Myös useiden lepotilan kehittymiseen liittyvien geenien ilmenemisessä havaittiin poikkeavuuksia verrattuna ei-siirtogeenisiin kontrolleihin, joiden silmuissa kehittyi lepotila lyhyt päivä –altistuksen seurauksena. Väitöskirjatyössäni havaittiin, että myös kaasumainen kasvihormoni etyleeni toimii viestinvälittäjänä silmujen lepotilan kehittymisessä ja vaikuttaa etenkin lepotilan oikeaan ajoittumiseen. Etyleenillä huomattiin olevan määräävä rooli päätesilmun muodostumisessa: siirtogeeniset koivut, jotka eivät aisti etyleeniä, eivät muodostaneet päätesilmua. Silti siirtogeeniset koivut vaipuivat lepotilaan, joskin myöhemmin kuin ei-siirtogeeniset kontrollit. Tämän perusteella todettiin, että lepotilan ja päätesilmun kehittyminen ovat erillisiä kehitystapahtumia, vaikka ne saattavatkin ajoittua osaksi päällekkäin.

Stress and developmental responses in Arabidopsis thaliana: regulation through the transcription factor-interacting protein RCD1

Plants constantly face adverse environmental conditions, such as drought or extreme temperatures that threaten their survival. They demonstrate astonishing metabolic flexibility in overcoming these challenges and one of the key responses to stresses is changes in gene expression leading to alterations in cellular functions. This is brought about by an intricate network of transcription factors and associated regulatory proteins. Protein-protein interactions and post-translational modifications are important steps in this control system along with carefully regulated degradation of signaling proteins. This work concentrates on the RADICAL-INDUCED CELL DEATH1 (RCD1) protein which is an important regulator of abiotic stress-related and developmental responses in Arabidopsis thaliana. Plants lacking this protein function display pleiotropic phenotypes including sensitivity to apoplastic reactive oxygen species (ROS) and salt, ultraviolet B (UV-B) and paraquat tolerance, early flowering and senescence. Additionally, the mutant plants overproduce nitric oxide, have alterations in their responses to several plant hormones and perturbations in gene expression profiles. The RCD1 gene is transcriptionally unresponsive to environmental signals and the regulation of the protein function is likely to happen post-translationally. RCD1 belongs to a small protein family and, together with its closest homolog SRO1, contains three distinguishable domains: In the N-terminus, there is a WWE domain followed by a poly(ADP-ribose) polymerase-like domain which, despite sequence conservation, does not seem to be functional. The C-terminus of RCD1 contains a novel domain called RST. It is present in RCD1-like proteins throughout the plant kingdom and is able to mediate physical interactions with multiple transcription factors. In conclusion, RCD1 is a key point of signal integration that links ROS-mediated cues to transcriptional regulation by yet unidentified means, which are likely to include post-translational mechanisms. The identification of RCD1-interacting transcription factors, most of whose functions are still unknown, opens new avenues for studies on plant stress as well as developmental responses.

Secondary metabolites in Gerbera hybrida

Plants produce a diversity of secondary metabolites, i.e., low-molecular-weight compounds that have primarily ecological functions in plants. The flavonoid pathway is one of the most studied biosynthetic pathways in plants. In order to understand biosynthetic pathways fully, it is necessary to isolate and purify the enzymes of the pathways to study individual steps and to study the regulatory genes of the pathways. Chalcone synthases are key enzymes in the formation of several groups of flavonoids, including anthocyanins. In this study, a new chalcone synthase enzyme (GCHS4), which may be one of the main contributors to flower colour, was characterised from the ornamental plant Gerbera hybrida. In addition, four chalcone synthase-like genes and enzymes (GCHS17, GCHS17b, GCHS26 and GCHS26b) were studied. Spatial expression of the polyketide synthase gene family in gerbera was also analysed with quantitative RT-PCR from 12 tissues, including several developmental stages and flower types. A previously identified MYB transcription factor from gerbera, GMYB10, which regulates the anthocyanin pathway, was transferred to gerbera and the phenotypes were analysed. Total anthocyanin content and anthocyanidin profiles of control and transgenic samples were compared spectrophotometrically and with HPLC. The overexpression of GMYB10 alone was able to change anthocyanin pigmentation: cyanidin pigmentation was induced and pelargonidin pigmentation was increased. The gerbera 9K cDNA microarray was used to compare the gene expression profiles of transgenic tissues against the corresponding control tissues to reveal putative target genes for GMYB10. GMYB10 overexpression affected the expression of both early and late biosynthetic genes in anthocyanin-accumulating transgenic tissues, including the newly isolated gene GCHS4. Two new MYB domain factors, named as GMYB11 and GMYB12, were also upregulated. Gene transfer is not only a powerful tool for basic research, but also for plant breeding. However, crop improvement by genetic modification (GM) remains controversial, at least in Europe. Many of the concerns relating to both human health and to ecological impacts relate to changes in the secondary metabolites of GM crops. In the second part of this study, qualitative and quantitative differences in cytotoxicity and metabolic fingerprints between 225 genetically modified Gerbera hybrida lines and 42 non-GM Gerbera varieties were compared. There was no evidence for any major qualitative and quantitative changes between the GM lines and non-GM varieties. The developed cell viability assays offer also a model scheme for cell-based cytotoxicity screening of a large variety of GM plants in standardized conditions.