Viilin varahapatteen kehittäminen

Kirjallisuuskatsauksessa käsiteltiin viiliä hapanmaitotuotteena, viilin arviointimenetelmiä sekä viilihapatteissa käytettyjen hapatekantojen vaikutuksia maidossa ja niiden vuorovaikutuksia toisiinsa. Lisäksi pohdittiin viilihapatteiden bakteriofaageja, niiden ehkäisyä sekä solunsisäisiä että -ulkoisia faagiresistenssimekanismeja. Kokeellisessa osassa tutkittiin, onko nykyisten tuotantohapatteiden koostaminen yksittäiskannoista mahdollista, sekä koostettiin uusista Lactococcus lactis ssp. cremoris -kannoista varahapate. Hapatteiden käyttökelpoisuutta tutkittiin rakennemittauksin ja aistinvaraisin menetelmin. Varahapatteen faagikestävyyttä testattiin valmistamalla viiliä ja infektoimalla viilit faaginäytteillä. Hapatekannat viljeltiin fermentorissa, konsentroitiin sentrifugoimalla ja pakastettiin –75 °C:ssa. Hapatteet koostettiin noin 1 päivä ennen viilin valmistusta. Viilit arvioitiin aistinvaraisesti 3–6 hengen ryhmässä ja viileille tehtiin rakennemittaukset (kiinteys, sakeus ja koossapysyvyys) sekä kemialliset analyysit. Aistinvaraisen arvioinnin tulokset käsiteltiin tilastollisesti ja tulosten perusteella tehtiin uudet kantakombinaatiot ja viilit. Tuotantohapatekannoilla valmistetut viilit arvioitiin kolmitestillä (n = 10–11) ja uusilla kannoilla valmistetut viilit arvioitiin profiilitestillä (n = 8). Lisäksi viileille tehtiin rakennemittaukset ja kemialliset analyysit. Varahapatekoosteilla valmistettujen viilien pH laski 4,5:een faagin läsnäollessa 0–10 tunnin viiveellä verrattuna faagivapaisiin viileihin, kun taas tuotantohapatteet eivät hapantuneet faagin läsnäollessa. Aromintuottajat eivät kasvaneet viileissä kunnolla, kun hapate koostettiin yksittäiskannoista. Kolmitestissä ei erotettu nykyisillä tuotantohapatteilla valmistettua viiliä yksittäin koostetusta hapatteesta, eli hapatteita on mahdollista koostaa yksittäiskannoista. Varahapatteilla koostetut viilit poikkesivat profiilitestissä tuotantohapatteella koostetusta viilistä ulkonäkö- ja rakenneominaisuuksiltaan. Makuominaisuuksien suhteen ei viilien välille saatu eroa.

Molekyylibiologisten menetelmien kehittäminen ihmisen suoliston sulfaattia pelkistävien bakteerien määrittämiseksi

Ihmisen ruuansulatuskanavan bakteeriston kehitys alkaa syntymästä, jolloin ensimmäiset bakteerit kansoittavat steriilin ruuansulatuskanavan. Bakteeristo kehittyy perimän, ympäristön ja varhaisen ruokavalion vaikutuksesta kohti monimuotoisempaa bakteeripopulaatiota. Aikuisen ruuansulatuskanavan normaalibakteeristo on varsin muuttumaton, mutta siihen vaikuttavat monet tekijät, kuten ikä, terveydentila, ruokavalio ja antibioottien käyttö. Bakteeriston koostumus vaihtelee ruuansulatuskanavan eri osissa ja bakteerimäärä kasvaa kohti paksusuolta, ollen paksusuolessa ja ulosteessa peräti 1010-1012 pmy/ml. Suurin osa ruuansulatuskanavan bakteereista on anaerobeja. Ruuansulatuskanavan bakteeristo vaikuttaa muun muassa suoliston kehittymiseen ja hiilihydraattien ja proteiinien hajotukseen sekä toimii osana immuunipuolustusta. Sulfaattia pelkistävät bakteerit (SRB) ovat monimuotoinen ryhmä pääosin anaerobisia bakteereita, jotka käyttävät aineenvaihdunnassaan elektronin vastaanottajana sulfaattia muuttaen sen lopulta sulfidiksi. SRB:t ovat sopeutuneet useisiin erilaisiin ympäristöihin. Niitä tavataan mm. vesistöjen sedimenteissä sekä ihmisen ruuansulatuskanavassa. Ihmisen ruuansulatuskanavassa on SRB:ta n. 105-108 pmy/g, ja niitä on löydetty erityisesti anaerobisista osista kuten suun ientaskuista ja paksusuolesta. SRB:t voivat olla haitaksi ruuansulatuskanavalle tuottamansa sulfidin vuoksi, joka esiintyy vesiliuoksessa vetysulfidina. Tämän on havaittu olevan toksista suoliston epiteelisoluille. Viimeaikoina on kiinnostuttu sulfaatinpelkistäjien yhteydestä suoliston sairaustiloihin, kuten tulehduksellisiin suolistosairauksiin (IBD). Pro gradu -tutkimukseni tavoitteena oli kehittää PCR-DGGE- ja qPCR-menetelmät ulosteen sulfaattia pelkistävien bakteerien määritykseen. Kohdegeeninä menetelmänkehityksessä käytettiin dsrAB-geeniä, joka koodaa dissimilatorista sulfiitinpelkistysentsyymiä. dsrAB-geeni on sulfaatinpelkistäjille ominainen konservoitunut geenialue, johon perustuvia tutkimuksia ei vielä ole paljon ihmispuolelta. qPCR-menetelmä saatiin optimoitua herkäksi ja spesifiseksi käyttäen dsrA-geenispesifisiä alukkeita, mutta PCR-DGGE-menetelmää ei saatu optimoitua käytössä olleilla alukkeilla, jotka monistivat PCR-DGGE:ssa myös negatiivikontrollikantoja. Tutkittaessa qPCR:lla IBD:tä (Crohn ja ulseratiivinen koliitti) sairastavien lasten ja terveiden kontrollihenkilöiden ulostenäytteistä eristettyä DNA:ta, merkittävää eroa SRB-määrissä ei havaittu eri ryhmien välillä. Crohnin tautia sairastavien aktiivisen vaiheen ja oireettoman vaiheen näytteiden välillä oli kuitenkin tilastollisesti merkitsevä ero (SRB-määrät; oireeton vaihe>oireellinen vaihe) (P <0,05).