2,1,3-Bentsoksadiatsolirakenteiset molekyylit antibakteerisina ja antiparasiittisina yhdisteinä

Aikaisemman tutkimuksen perusteella tiedettiin tiettyjen 2,1,3-bentsoksadiatsolirakenteisten molekyylien olevan aktiivisia Chlamydia pneumoniae –bakteeria vastaan. Tutkimusta lähdettiin jatkamaan ja 2,1,3-bentsoksadiatsolimolekyylien rakenne-aktiivisuusuhteista haluttiin saada lisätietoa. Tarkoituksena oli kehittää 2,1,3-bentsoksadiatsolimolekyyleille ja sen avulla muodostaa molekyylikirjasto. Syntetisoidut molekyylit haluttiin testata sekä Chlamydia pneumoniae -bakteeria että Leishmania donovani –parasiittia vastaan. Chlamydia pneumoniae –bakteeri aiheuttaa akuutteja ylä- ja alahengitystieinfektiota, kuten keuhkoputkentulehdusta. Akuutissa tulehduksessa oireet vaihtelevat huomattavasti. Chlamydia pneumoniae –bakteerilla on myös taipumus aiheuttaa kroonisia tulehduksia. Nämä ovat useissa tutkimuksissa yhdistetty kansantaloudellisesti merkittäviin sairauksiin, kuten ateroskleroosiin ja astmaan. Leishmanioosi on toiseksi yleisin loissairaus ihmisellä malarian jälkeen. Leishmania donovani –parasiitti voi aiheuttaa tappavaa viskeraalista leishmanioosia. Vuodessa leishmanioosiin kuolee yli 50 000 ihmistä. Viime vuosina leishmanioosin lääkehoidossa on esiintynyt monenlaisia ongelmia. Osat lääkkeistä ovat menettäneet tehonsa ja osalla esiintyy vakavia haittavaikutuksia. 2,1,3-Bentsoksadiatsolirakenteisille yhdisteille saatiin kehitettyä toimiva synteesireitti. Lähtöaineena käytettiin 4-amino-2-nitrobentsoehappoa, josta saatiin hapettavalla renkaansulkeutumisreaktiolla 2,1,3-bentsoksadiatsoli-5-karboksyylihappoa. Karboksyylihaposta syntetisoitiin amidi-välituotteen kautta 2,1,3-bentsoksadiatsoli-5-karbonitriiliä. Hydroksyyliamiini hydrokloridin avulla 2,1,3-bentsoksadiatsoli-5-karbonitriilistä muodostettiin vastaavaa karboksimidamidia, joka oli synteesireitin yhteinen välituote kaikille molekyyleille. Viimeisessä vaiheessa N´-hydroksidi-2,1,3-bentsoksadiatsoli-5-karboksimidamidin annettiin reagoida joko fenyyli-isosyanaatin tai fenyyli-isotiosyanaatin kanssa, jolloin saatiin lopputuotetta. Synteesireitin kehittäminen osoittautui haastavaksi ja loppujen lopuksi saatiin ainoastaan kolme lopputuotetta syntetisoitua. Yksi lopputuotteista testattiin C. pneumoniae –bakteeria vastaan Åbo akademissa Turussa. Testattavaa yhdiste ei sisältänyt 2,1,3-bentsoksadiatsoliarengasta ja bioaktiivisuuskokeen tulos oli odotusten mukainen. Yhdiste ei ollut aktiivinen C. pneumoniae –bakteeria vastaan alhaisilla konsentraatioilla ja tuloksesta voitiin todeta 2,1,3-bentsoksadiatsolirengaan olevan tärkeä aktiivisuuden kannalta. Kaksi lopputuotetta saatiin testaukseen Leishamania donovani –parasiittia vastaan Israeliin. Ainoastaan toinen molekyyleistä sisälsi 2,1,3-bentsoksadiatsolirakenteen. Bioaktiivisuuskokeiden tulokset olivat erittäin rohkaisevia. Yhdisteet olivat aktiivisia parasiittia vastaan jo alhaisilla konsentraatioilla. Kuitenkin 2,1,3-bentsoksadiatsolirakenteinen molekyyli oli aktiivisempi, joten tämäkin aktiivisuuskokeen perusteella huomattiin rengasrakenteen olevan tärkeä aktiivisuuden kannalta.

A proteomic view of probiotic Lactobacillus rhamnosus GG

Lactobacillus rhamnosus GG is a probiotic bacterium that is known worldwide. Since its discovery in 1985, the health effects and biology of this health-promoting strain have been researched at an increasing rate. However, knowledge of the molecular biology responsible for these health effects is limited, even though research in this area has continued to grow since the publication of the whole genome sequence of L. rhamnosus GG in 2009. In this thesis, the molecular biology of L. rhamnosus GG was explored by mapping the changes in protein levels in response to diverse stress factors and environmental conditions. The proteomics data were supplemented with transcriptome level mapping of gene expression. The harsh conditions of the gastro-intestinal tract, which involve acidic conditions and detergent-like bile acids, are a notable challenge to the survival of probiotic bacteria. To simulate these conditions, L. rhamnosus GG was exposed to a sudden bile stress, and several stress response mechanisms were revealed, among others various changes in the cell envelope properties. L. rhamnosus GG also responded in various ways to mild acid stress, which probiotic bacteria may face in dairy fermentations and product formulations. The acid stress response of L. rhamnosus GG included changes in central metabolism and specific responses related to the control of intracellular pH. Altogether, L. rhamnosus GG was shown to possess a large repertoire of mechanisms for responding to stress conditions, which is a beneficial character of a probiotic organism. Adaptation to different growth conditions was studied by comparing the proteome level responses of L. rhamnosus GG to divergent growth media and to different phases of growth. Comparing different growth phases revealed that the metabolism of L. rhamnosus GG is modified markedly during shift from the exponential to the stationary phase of growth. These changes were seen both at proteome and transcriptome levels and in various different cellular functions. When the growth of L. rhamnosus GG in a rich laboratory medium and in an industrial whey-based medium was compared, various differences in metabolism and in factors affecting the cell surface properties could be seen. These results led us to recommend that the industrial-type media should be used in laboratory studies of L. rhamnosus GG and other probiotic bacteria to achieve a similar physiological state for the bacteria as that found in industrial products, which would thus yield more relevant information about the bacteria. In addition, an interesting phenomenon of protein phosphorylation was observed in L. rhamnosus GG. Phosphorylation of several proteins of L. rhamnosus GG was detected, and there were hints that the degree of phosphorylation may be dependent on the growth pH.

Rihmamatolääkkeiden vaikutuskohteita. Betuliinin johdannaisia mahdollisiksi uusiksi yhdisteiksi

Jokisokeus eli onkosersiaasi on ihmisen loismatotauti, jota aiheuttaa Onchocerca volvulus -rihmamato. Tautia esiintyy trooppisilla alueilla Afrikassa ja Latinalaisessa Amerikassa. Tartunnan saaneita on noin 37 miljoonaa. Jokisokeus ilmenee iho- ja silmäoireina. Oireet johtuvat loisen nuorimmista muodoista eli mikrofilarioista. Jokisokeutta vastaan on käyty jakamalla lähinnä mikrofilarioihin tehoavaa ivermektiiniä. Tarvetta olisi lääkkeelle, joka tappaisi aikuiset madot tai steriloisi naaraat. Rokote olisi vielä parempi vaihtoehto. Antibiootit on uusi hoitokeino, sillä O. volvuluksella on elintärkeänä symbionttina Wolbachia-bakteeri. Doksisykliini tappaa vähintään 60 prosenttia aikuisista madoista ja steriloi naaraita, mutta kuuri kestää viikkoja. Yksi lupaava yhdiste on emodepsidi, jolla on loismatolääkkeille uusi vaikutusmekanismi. Rihmamatolääkkeiksi on testattu lukuisia yhdisteitä. Jotkut niistä inhiboivat entsyymejä, joilla madot kiertävät ihmisen immuunipuolustusta. Toiset häiritsevät neljä kertaa tapahtuvaa nahanvaihtoa. Hyvä lääkkeiden vaikutuskohde on loiselle välttämätön mutta puuttuu nisäkkäiltä. Betuliini on triterpeeni, jota on runsaasti koivun tuohessa. Betuliini ja monet sen johdannaiset ovat farmakologisesti aktiivisia yhdisteitä, joita tutkitaan etenkin syöpä- ja HIV-lääkkeiksi. Helsingin yliopiston lääkekemian ryhmä on syntetisoinut ja tutkinut lukuisia johdoksia. Jotkin niistä ovat lupaavia esimerkiksi Leishmania-alkueläimiin, Chlamydia pneumoniae -bakteeriin ja alfaviruksiin. Siksi yhdisteitä kannattaisi tutkia muihinkin taudinaiheuttajiin, kuten rihmamatoihin. Sekä Wolbachialla että C. pneumoniaella on sama lipidisynteesireitti, joka on kummallekin elintärkeä. Betuliinista syntetisoitiin johdoksia, joissa betuliinin alkoholeja on hapetettu karbonyyleiksi ja joihin on liitetty typpiheterorengas. Sekä Leishmania donovani että L. braziliensis -tutkimuksissa tehokkain oli formyylibetuliinin heterosykli. Vaikka valmistettuja yhdisteitä ei ole tutkittu rihmamatotesteissä, jatkossa voisi syntetisoida johdannaisia, joissa karbonyylien tilalla on typpirakenteita, koska C. pneumoniaehen hyvin tehonneessa yhdisteessä betuliinin OH-ryhmien tilalla on oksiimi.