11β-Hydroxysteroid dehydrogenase inhibitors and selectivity modeling of 11β-HSDs

11β-hydroksisteroididehydrogenaasientsyymit (11β-HSD) 1 ja 2 säätelevät kortisonin ja kortisolin määrää kudoksissa. 11β-HSD1 -entsyymin ylimäärä erityisesti viskeraalisessa rasvakudoksessa aiheuttaa metaboliseen oireyhtymän klassisia oireita, mikä tarjoaa mahdollisuuden metabolisen oireyhtymän hoitoon 11β-HSD1 -entsyymin selektiivisellä estämisellä. 11β-HSD2 -entsyymin inhibitio aiheuttaa kortisonivälitteisen mineralokortikoidireseptorien aktivoitumisen, mikä puolestaan johtaa hypertensiivisiin haittavaikutuksiin. Haittavaikutuksista huolimatta 11β-HSD2 -entsyymin estäminen saattaa olla hyödyllistä tilanteissa, joissa halutaan nostaa kortisolin määrä elimistössä. Lukuisia selektiivisiä 11β-HSD1 inhibiittoreita on kehitetty, mutta 11β-HSD2-inhibiittoreita on raportoitu vähemmän. Ero näiden kahden isotsyymin aktiivisen kohdan välillä on myös tuntematon, mikä vaikeuttaa selektiivisten inhibiittoreiden kehittämistä kummallekin entsyymille. Tällä työllä oli kaksi tarkoitusta: (1) löytää ero 11β-HSD entsyymien välillä ja (2) kehittää farmakoforimalli, jota voitaisiin käyttää selektiivisten 11β-HSD2 -inhibiittoreiden virtuaaliseulontaan. Ongelmaa lähestyttiin tietokoneavusteisesti: homologimallinnuksella, pienmolekyylien telakoinnilla proteiiniin, ligandipohjaisella farmakoforimallinnuksella ja virtuaaliseulonnalla. Homologimallinnukseen käytettiin SwissModeler -ohjelmaa, ja luotu malli oli hyvin päällekäinaseteltavissa niin templaattinsa (17β-HSD1) kuin 11β-HSD1 -entsyymin kanssa. Eroa entsyymien välillä ei löytynyt tarkastelemalla päällekäinaseteltuja entsyymejä. Seitsemän yhdistettä, joista kuusi on 11β-HSD2 -selektiivisiä, telakoitiin molempiin entsyymeihin käyttäen ohjelmaa GOLD. 11β-HSD1 -entsyymiin yhdisteet kiinnittyivät kuten suurin osa 11β-HSD1 -selektiivisistä tai epäselektiivisistä inhibiittoreista, kun taas 11β-HSD2 -entsyymiin kaikki yhdisteet olivat telakoituneet käänteisesti. Tällainen sitoutumistapa mahdollistaa vetysidokset Ser310:een ja Asn171:een, aminohappoihin, jotka olivat nähtävissä vain 11β-HSD2 -entsyymissä. Farmakoforimallinnukseen käytettiin ohjelmaa LigandScout3.0, jolla ajettiin myös virtuaaliseulonnat. Luodut kaksi farmakoforimallia, jotka perustuivat aiemmin telakointiinkin käytettyihin kuuteen 11β-HSD2 -selektiiviseen yhdisteeseen, koostuivat kuudesta ominaisuudesta (vetysidosakseptori, vetysidosdonori ja hydrofobinen), ja kieltoalueista. 11β-HSD2 -selektiivisyyden kannalta tärkeimmät ominaisuudet ovat vetysidosakseptori, joka voi muodostaa sidoksen Ser310 kanssa ja vetysidosdonori sen vieressä. Tälle vetysidosdonorille ei löytynyt vuorovaikutusparia 11β-HSD2-mallista. Sopivasti proteiiniin orientoitunut vesimolekyyli voisi kuitenkin olla sopiva ratkaisu puuttuvalle vuorovaikutusparille. Koska molemmat farmakoforimallit löysivät 11β-HSD2 -selektiivisiä yhdisteitä ja jättivät epäselektiivisiä pois testiseulonnassa, käytettiin molempia malleja Innsbruckin yliopistossa säilytettävistä yhdisteistä (2700 kappaletta) koostetun tietokannan seulontaan. Molemmista seulonnoista löytyneistä hiteistä valittiin yhteensä kymmenen kappaletta, jotka lähetettiin biologisiin testeihin. Biologisien testien tulokset vahvistavat lopullisesti sen kuinka hyvin luodut mallit edustavat todellisuudessa 11β-HSD2 -selektiivisyyttä.

Protein Kinase C and Anaplastic Lymphoma Kinase Targeted Compounds

The protein kinases (PKs) belong to the largest single family of enzymes, phosphotransferases, which catalyze the phosphorylation of other enzymes and proteins and function primarily in signal transduction. Consequently, PKs regulate cell mechanisms such as growth, differentiation, and proliferation. Dysfunction of these cellular mechanisms may lead to cancer, a major predicament in health care. Even though there is a range of clinically available cancer-fighting drugs, increasing number of cancer cases and setbacks such as drug resistance, constantly keep cancer research active. At the commencement of this study an isophthalic acid derivative had been suggested to bind to the regulatory domain of protein kinase C (PKC). In order to investigate the biological effects and structure-activity relationships (SARs) of this new chemical entity, a library of compounds was synthesized. The best compounds induced apoptosis in human leukemia HL-60 cells and were not cytotoxic in Swiss 3T3 fibroblasts. In addition, the best apoptosis inducers were neither cytotoxic nor mutagenic. Furthermore, results from binding affinity assays of PKC isoforms revealed the pharmacophores of these isophthalic acid derivatives. The best inhibition constants of the tested compounds were measured to 210 nM for PKCα and to 530 nM for PKCδ. Among natural compounds targeting the regulatory domain of PKC, the target of bistramide A has been a matter of debate. It was initially found to activate PKCδ; however, actin was recently reported as the main target. In order to clarify and to further study the biological effects of bistramide A, the total syntheses of the natural compound and two isomers were performed. Biological assays of the compounds revealed accumulation of 4n polyploid cells as the primary mode of action and the compounds showed similar overall antiproliferative activities. However, each compound showed a distinct distribution of antimitotic effect presumably via actin binding, proapoptotic effect presumably via PKCδ, and pro-differentiation effect as evidenced by CD11b expression. Furthermore, it was shown that the antimitotic and proapoptotic effects of bistramide A were not secondary effects of actin binding but independent effects. The third aim in this study was to synthesize a library of a new class of urea-based type II inhibitors targeted at the kinase domain of anaplastic lymphoma kinase (ALK). The best compounds in this library showed IC50 values as low as 390 nM for ALK while the initial low cellular activities were successfully increased even by more than 70 times for NPM-ALK- positive BaF3 cells. More importantly, selective antiproliferative activity on ALK-positive cell lines was achieved; while the best compound affected the BaF3 and SU-DHL-1 cells with IC50 values of 0.5 and 0.8 μM, respectively, they were less toxic to the NPM-ALK-negative human leukemic cells U937 (IC50 = 3.2 μM) and BaF3 parental cells (IC50 = 5.4 μM). Furthermore, SAR studies of the synthesized compounds revealed functional groups and positions of the scaffold, which enhanced the enzymatic and cellular activities.

Mammalian Mat1 subunit of Transcription Factor IIH in gene-specific and general transcription

All protein-encoding genes in eukaryotes are transcribed into messenger RNA (mRNA) by RNA Polymerase II (RNAP II), whose activity therefore needs to be tightly controlled. An important and only partially understood level of regulation is the multiple phosphorylations of RNAP II large subunit C-terminal domain (CTD). Sequential phosphorylations regulate transcription initiation and elongation, and recruit factors involved in co-transcriptional processing of mRNA. Based largely on studies in yeast models and in vitro, the kinase activity responsible for the phosphorylation of the serine-5 (Ser5) residues of RNAP II CTD has been attributed to the Mat1/Cdk7/CycH trimer as part of Transcription Factor IIH. However, due to the lack of good mammalian genetic models, the roles of both RNAP II Ser5 phosphorylation as well as TFIIH kinase in transcription have provided ambiguous results and the in vivo kinase of Ser5 has remained elusive. The primary objective of this study was to elucidate the role of mammalian TFIIH, and specifically the Mat1 subunit in CTD phosphorylation and general RNAP II-mediated transcription. The approach utilized the Cre-LoxP system to conditionally delete murine Mat1 in cardiomyocytes and hepatocytes in vivo and and in cell culture models. The results identify the TFIIH kinase as the major mammalian Ser5 kinase and demonstrate its requirement for general transcription, noted by the use of nascent mRNA labeling. Also a role for Mat1 in regulating general mRNA turnover was identified, providing a possible rationale for earlier negative findings. A secondary objective was to identify potential gene- and tissue-specific roles of Mat1 and the TFIIH kinase through the use of tissue-specific Mat1 deletion. Mat1 was found to be required for the transcriptional function of PGC-1 in cardiomyocytes. Transriptional activation of lipogenic SREBP1 target genes following Mat1 deletion in hepatocytes revealed a repressive role for Mat1apparently mediated via co-repressor DMAP1 and the DNA methyltransferase Dnmt1. Finally, Mat1 and Cdk7 were also identified as a negative regulators of adipocyte differentiation through the inhibitory phosphorylation of Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) γ. Together, these results demonstrate gene- and tissue-specific roles for the Mat1 subunit of TFIIH and open up new therapeutic possibilities in the treatment of diseases such as type II diabetes, hepatosteatosis and obesity.