Diastereomeric Drug Glucuronides: Enzymatic Glucuronidation and Analysis by Capillary Electrophoresis and Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Foreign compounds, such as drugs are metabolised in the body in numerous reactions. Metabolic reactions are divided into phase I (functionalisation) and phase II (conjugation) reactions. Uridine diphosphoglucuronosyltransferase enzymes (UGTs) are important catalysts of phase II metabolic system. They catalyse the transfer of glucuronic acid to small lipophilic molecules and convert them to hydrophilic and polar glucuronides that are readily excreted from the body. Liver is the main site of drug metabolism. Many drugs are racemic mixtures of two enantiomers. Glucuronidation of a racemic compound yields a pair of diastereomeric glucuronides. Stereoisomers are interesting substrates in glucuronidation studies since some UGTs display stereoselectivity. Diastereomeric glucuronides of O-desmethyltramadol (M1) and entacapone were selected as model compounds in this work. The investigations of the thesis deal with enzymatic glucuronidation and the development of analytical methods for drug metabolites, particularly diastereomeric glucuronides. The glucuronides were analysed from complex biological matrices, such as urine or from in vitro incubation matrices. Various pretreatment techniques were needed to purify, concentrate and isolate the analytes of interest. Analyses were carried out by liquid chromatography (LC) with ultraviolet (UV) or mass spectrometric (MS) detection or with capillary electromigration techniques. Commercial glucuronide standards were not available for the studies. Enzyme-assisted synthesis with rat liver microsomes was therefore used to produce M1 glucuronides as reference compounds. The glucuronides were isolated by LC/UV and ultra performance liquid chromatography (UPLC)/MS, while tandem mass spectrometry (MS/MS) and nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy were employed in structural characterisation. The glucuronides were identified as phenolic O-glucuronides of M1. To identify the active UGT enzymes in (±)-M1 glucuronidation recombinant human UGTs and human tissue microsomes were incubated with (±)-M1. The study revealed that several UGTs can catalyse (±)-M1 glucuronidation. Glucuronidation in human liver microsomes like in rat liver microsomes is stereoselective. The results of the studies showed that UGT2B7, most probably, is the main UGT responsible for (±)-M1 glucuronidation in human liver. Large variation in stereoselectivity of UGTs toward (±)-M1 enantiomers was observed. Formation of M1 glucuronides was monitored with a fast and selective UPLC/MS method. Capillary electromigration techniques are known for their high resolution power. A method that relied on capillary electrophoresis (CE) with UV detection was developed for the separation of tramadol and its free and glucuronidated metabolites. The suitability of the method to identify tramadol metabolites in an authentic urine samples was tested. Unaltered tramadol and four of its main metabolites were detected in the electropherogram. A micellar electrokinetic chromatography (MEKC) /UV method was developed for the separation of the glucuronides of entacapone in human urine. The validated method was tested in the analysis of urine samples of patients. The glucuronides of entacapone could be quantified after oral entacapone dosing.

Functional regulation of the Neurofibromatosis 2 tumor suppressor merlin

Neurofibromatosis 2 (NF2) is an autosomal dominant disorder manifested by the formation of multiple benign tumors of the nervous system. Affected individuals typically develop bilateral vestibular schwannomas which lead to deafness and balance disorders. The syndrome is caused by inactivation of the NF2 tumor suppressor gene, and mutation or loss of the NF2 product, merlin, is sufficient for tumorigenesis in both hereditary and sporadic NF2-associated tumors. Merlin belongs to the band 4.1 superfamily of cytoskeletal proteins, which also contain the related ezrin, radixin, and moesin (ERM) proteins. The ERM members provide a link between the cell cytoskeleton and membrane by connecting membrane-associated proteins to actin filaments. By stabilizing complexes in the cell cortex, the ERMs modulate morphology, growth, and migration of cells. Despite their structural homology, overlapping subcellular distribution, direct molecular association, and partial overlap of molecular interactions, merlin and ezrin exert opposite effects on cell proliferation. Merlin suppresses cell proliferation, whereas ezrin expression is linked to oncogenic activity. We hypothesized that the regions which differ between the proteins might explain merlin s specificity as a tumor suppressor. We therefore analyzed the regions, which are most diverse between merlin and ezrin; the N-terminal tail and the C-terminus. To determine the properties of the C-terminal region, we studied the two most predominant merlin isoforms together with truncation variants similar to those found in patients. We also focused on the evolutionally conserved C-terminal residues, E545-E547, that harbor disease causing mutations in its corresponding DNA sequence. In addition to inhibiting cell proliferation, merlin regulates cytoskeletal organization. The morphogenic properties of merlin may play a role in tumor suppression, since patient-derived tumor cells demonstrate cytoskeletal abnormalities. We analyzed the mechanisms of merlin-induced extension formation and determined that the C-terminal region of amino acids 538-568 is particularly important for the morphogenic activity. We also characterized the role of C-terminal merlin residues in the regulation of proliferation, phosphorylation, and intramolecular associations. In contrast to previous reports, we demonstrated that both merlin isoforms are able to suppress cell proliferation, whereas C-terminally mutated merlin constructs showed reduced growth inhibition. Phosphorylation serves as a mechanism to regulate the tumor suppressive activity of merlin. The C-terminal serine 518 is phosphorylated in response to both p21-activated kinase (PAK) and protein kinase A (PKA), which inactivates the growth inhibitory function of merlin. However, at least three differentially phosphorylated forms of the protein exist. In this study we demonstrated that also the N-terminus of merlin is phosphorylated by AGC kinases, and that both PKA and Akt phosphorylate merlin at serine 10 (S10). We evaluated the impact of this N-terminal tail phosphorylation, and showed that the phosphorylation state of S10 is an important regulator of merlin s ability to modulate cytoskeletal organization but also regulates the stability of the protein. In summary, this study describes the functional effect of merlin specific regions. We demonstrate that both S10 in the N-terminal tail and residues E545-E547 in the C-terminus are essential for merlin activity and function.

Hallinnonalariippumattoman palvelumallin jäljillä. Yhteispalvelun näkökulma toimivaltaan, asiakkuuteen ja hallinnon kehittämiseen.

Tutkielman tutkimusongelmana on hallinnonalariippumattoman palvelumallin toteuttaminen julkisessa hallinnossa. Hallinnonalariippumattomalle palvelumallille määritellään tutkielmassa kolme teoreettista lähtökohtaa, jotka ovat toimivalta, asiakkuus ja hallinnon kehittäminen. Tutkimusongelmaan vastataan ottamalla suomalainen yhteispalvelumalli empiirisen ja aineistolähtöisen tutkimuksen kohteeksi ja peilaamalla siitä saatuja kokemuksia määriteltyihin teoreettisiin lähtökohtiin. Samassa yhteydessä tutkimuksen kohteena oleva suomalainen yhteispalvelumalli asettuu osaksi laajempaa hallinnon tutkimuksen viitekehystä ja teoreettista keskustelua. Tutkielman teoreettisia lähtökohtia koskien aineistona on tutkielmassa tarkemman tarkastelun kohteiksi valittuja käsitteitä käsittelevä hallinto- ja organisaatlotieteellinen kirjallisuus. Empiirinen tutkimuskohde, yhteispalvelu, määritellään hallinnon tuottamia virallisasiakirjoja ja voimassa olevaa lainsäädäntöä aineistona käyttäen. Tutkimuskohteen empiirisen analyysin edellyttämän aineiston keräämisen metodina on sovellettu teemahaastattelua. Haastatteluja on tehty yhteensä kuusi tutkimuskohteena olevan aiheen asiantuntijoille, ja haastatellut edustavat kuntakenttää sekä valtion keskus- ja paikallishallintoa. Empiirisen aineiston analyysissa sovelletaan aineistolähtöisen kuvan muodostamiseksi grounded theorya. Tutkielman johtopäätökset muodostuvat tarkasteltaessa tutkimusongelman teoreettisia lähtökohtia yhteispalvelusta aineistolähtöisesti ja ilman teoriaohjautuvuutta muodostuneen kuvan valossa. Toimivaltaa koskien keskeinen johtopäätös on, että kun tavoitellaan kokonaisvaltaista ja laajasti sovellettavaa hallinnonalariippumatonta palvelumallia, ei toimivallan kysymystä voida jättää huomiotta. Yhtenä ratkaisumahdollisuutena on määritellä perinteisen asiallisen toimivallan ohella hallinnonalariippumattomalle palvelujen tarjoamisen menetelmälle toimivaltainen ja keskitetty omistaja- ja vastuutaho. Asiakkuutta koskien hallinnonalariippumaton palvelumalli edellyttää kokonaisvaltaista Citizen Relationship Management -käsitteen kaltaista ymmärrystä asiakkuuksista ja asiakaslähtöisyydestä. Näin ollen New Public Managementin mukainen kulttuurinen siirtymä pois perinteisestä julkisen hallinnon paradigmasta ei ole riittävä, vaan asiakkuuden suhteen olisi huomioitava myös organisaatio-, teknologia- ja prosessinäkökulmat. Hallinnon kehittämisestä voidaan todeta sen sisältyvän implisiittisesti ajatukseen hallinnonalariippumattomasta palvelumallista. Tämä koskee erityisesti eGovemment -käsitteen mukaista informaatioteknologian hyödyntämistä. Vasta informaatioteknologian kehitys on mahdollistanut hallinnonalariippumattoman palvelumallin visioimisen ja tavoittelemisen käytännössä. Samalla hallinnon kehittäminen kohtaa toimintana kuitenkin monia haasteita, joista hallinnonalariippumattoman palvelumallin tapauksessa erityisen relevantteja ovat yhteispalvelusta saatujen kokemusten perusteella rakenteelliset, kulttuuriset ja toiminnalliset haasteet.

Sika- ja siipikarjatalouden rakennemuutoskorvaus C-tukialueella

Sika- ja siipikarjatilojen määrä Suomessa on vähentynyt koko EU-jäsenyyden ajan tuotannon keskittyessä yhä suurempiin yksiköihin. Tuotantomäärät ovat kasvaneet, mutta viljelijöiden tulotaso on alentunut, joten maatalouden ulkopuoliset ammatit houkuttelevat luopumaan eläinten pidosta tai maataloudesta kokonaan. Sika- ja siipikarjatalouden rakennemuutoksen taloudellisena kannustimena otettiin vuonna 2009 käyttöön sika- ja siipikarjatalouden rakennemuutoskorvaus, jota maksetaan kompensaationa sika- ja siipikarjataloudesta luopuville viljelijöille. Tämän työn tarkastelukohteena on rakennemuutoskorvaus C-tukialueella, jossa yksinään on lähes yhtä paljon sika- ja siipikarjatiloja kuin A- ja B-alueilla yhteensä. Tutkimuksen tavoitteena on selvittää, millaiset sika- ja siipikarjatilat sekä koko C-alueella että C-alueen eri osissa ovat hakeneet rakennemuutoskorvausta ja miten tilat ovat alueellisesti sijoittuneet. Maatalouden rakennepolitiikalla pyritään vaikuttamaan maatalouden yhteiskunnalliseen rakenteeseen. Rakennepoliittisilla toimilla pyritään vähentämään viljelijöiden ja tilojen määrää, jolloin maataloustulo jakaantuu pienemmälle viljelijämäärälle taaten heille suuremmat tulot. Maatalouden rakennemuutosta tapahtuu, kun maatalouden rakenteessa tapahtuu tietyllä aikavälillä muutos. Rakennemuutoksessa ja -kehityksessä on alueellisia eroja. Aluetaloustiede pyrkii selittämään, mistä alueelliset erot johtuvat ja miksi alueet erilaistuvat. Suomessa eri maakunnilla on eroja ja omia alueellisia ominaispiirteitään, joilla on suuri merkitys alueen työllisyyteen ja väestön sijoittumiseen alueella. Eri maakunnissa työllisyystilanne on vaihteleva, mutta joka maakunnassa on kuitenkin työvoimapulaa useissa sellaisissa ammateissa, joihin eläinten tai tilan pidon lopettavien viljelijöiden olisi mahdollista työllistyä. Sika- ja siipikarjatalouden rakennemuutoskorvaus on kansallinen kotieläintuki, jota maksetaan tilakohtaisen viitemäärän perusteella tiloille, jotka ovat juuri lopettaneet sika- ja siipikarjatuotantonsa tai aikovat sen lopettaa. Korvausta on voitu maksaa tukiehdot täyttävälle tuenhakijalle joko vuosina 2009–2010 tai vuosina 2010–2011 ja sen maksimimäärä on tilaa kohden enintään 20000 euroa vuodessa. Kahden korvausvuoden jälkeen tilan viitemäärä lakkautetaan ja sen jälkeen tilalle ei enää makseta sika- ja siipikarjatalouden tukia. Tilan on kuitenkin edelleen mahdollista jatkaa sika- ja siipikarjatuotantoaan markkinaehtoisena. Tutkimuksen aineisto on 389 tilan tiedot sisältävä Tiken raportti tukityypin 1612 (sika- ja siipikarjatalouden rakennemuutoskorvaus, pohjoinen) tukihakutiedoista vuodelta 2010. Tutkimusote oli kvantitatiivinen ja koska havaintoaineisto kattaa kaikki C-alueen korvauksenhakijat, tehtiin tutkimus kokonaistutkimuksena. Tutkimustulosten mukaan 63 % korvausta hakeneista tiloista sijoittuu C1-alueelle ja 54 % Etelä-Pohjanmaalle ja Pohjanmaalle. Kuntatasolla eniten rakennemuutoskorvaustiloja oli Närpiössä. C-alueella tuenhakijat olivat iältään 20–71-vuotiaita. Hakijoista 62 % harjoitti päätuotantosuuntanaan viljanviljelyä ja peltoalaa kaikilla hakijoilla oli hallinnassaan lähes 16000 ha. Rakennemuutoskorvausta maksettiin C-alueella yhteensä yli 2,3 miljoonaa euroa. Kun rakennemuutoskorvauksen viitemäärät kahden korvausvuoden jälkeen lakkautetaan, poistuu tuo-tannosta yli 9600 ey. Sekä C-alueella että kaikki ELY-keskukset huomioiden oli korvauksenhakijoita kaikkia ikäluokkia tarkasteltaessa eniten 50–59-vuotiaissa. Eniten hakijoita oli viitemääräluokassa 10,01–20 ey ja viljelyalaluokassa 25,01–40 ha, vähiten luokissa 40,01–50 ey ja 50,01 ey tai enemmän sekä 150,01 ha tai enemmän. Yleisin maksuluokka oli 3000,01–4500 euroa, harvinaisin 15000,01–20000 euroa. Rakennemuutoskorvauksella saavutettuja hyötyjä ja kustannuksia on toistaiseksi vaikea määritellä, koska vuoden 2011 maksatus on vielä kesken.