Interactions of natural products with β-lactoglobulins, members of the lipocalin family

Natural products constitute an important source of new drugs. The bioavailability of the drugs depends on their absorption, distribution, metabolism and elimination. To achieve good bioavailability, the drug must be soluble in water, stable in the gastrointestinal tract and palatable. Binding proteins may improve the solubility of drug compounds, masking unwanted properties, such as bad taste, bitterness or toxicity, transporting or protecting these compounds during processing and storage. The focus of this thesis was to study the interactions, including ligand binding and the effect of pH and temperature, of bovine and reindeer β-lactoglobulin (βLG) with such compounds as retinoids, phenolic compounds as well as with compounds from plant extracts, and to investigate the transport properties of the βLG-ligand complex. To examine the binding interactions of different ligands to βLG, new methods were developed. The fluorescence binding method for the evaluation of ligand binding to βLG was miniaturized from a quartz cell to a 96-well plate. A method of ultrafiltration sampling combined with high-performance liquid chromatography was developed to assess the binding of compounds from extracts. The interactions of phenolic compounds or retinoids and βLG were investigated using the 96-well plate method. The majority of flavones, flavonols, flavanones and isoflavones and all of the retinoids included were shown to bind to bovine and reindeer βLG. Phenolic compounds, contrary to retinol, were not released at acidic pH. Those results suggest that βLG may have more binding sites, probably also on the surface of βLG. An extract from Camellia sinensis (L.) O. Kunze (black tea), Urtica dioica L. (nettle) and Piper nigrum (black pepper) were used to evaluate whether βLG could bind compounds from plant extracts. Piperine from P. nigrum was found to bind tightly and rutin from U. dioica weakly to βLG. No components from C. sinensis bound to βLG in our experiment. The uptake and membrane permeation of bovine and reindeer βLG, free and bound with retinol, palmitic acid and cholesterol, were investigated using Caco-2 cell monolayers. Both bovine and reindeer βLG were able to cross the Caco-2 cell membrane. Free and βLG-bound retinol and palmitic acid were transported equally, whereas cholesterol could not cross the Caco-2 cell monolayer free or bound to βLG. Our results showed that βLG can bind different natural product compounds, but cannot enhance transport of retinol, palmitic acid or cholesterol through Caco-2 cells. Despite this, βLG, as a water-soluble binding protein, may improve the solubility of natural compounds, possibly protecting them from early degradation and transporting some of them through the stomach. Furthermore, it may decrease their bad or bitter taste during oral administration of drugs or in food preparations. βLG can also enhance or decrease the health benefits of herbal teas and food preparations by binding compounds from extracts.

Disabled Revolutionary War Veterans and the Construction of Disability in the Early United States, c. 1776-1840

This thesis addresses the following broad research question: what did it mean to be a disabled Revolutionary War veteran in the early United States during the period from 1776 to roughly 1840? The study approaches the question from two angles: a state-centred one and an experiential one. In both cases, the theoretical framework employed comes from disability studies. Consequently, disability is regarded as a sociocultural phenomenon rather than a medical condition. The state-centred dimension of the study explores the meaning of disability and disabled veterans to the early American state through an examination of the major military pension laws of the period. An analysis of this legislation, particularly the invalid pension acts of 1793 and 1806, indicates that the early United States represents a key period in the development of the modern disability category. The experiential approach, in contrast, shifts the focus of attention away from the state towards the lived experiences of disabled veterans. It seeks to address the issue of whether or not the disabilities of disabled veterans had any significant material impact on their everyday lives. It does this through a comparison of the situation of 153 disabled veterans with that of an equivalent number of nondisabled veterans. The former group received invalid pensions while the latter did not. In comparing the material conditions of disabled and nondisabled veterans, a wide range of primary sources from military records to memoirs and letters are used. The most important sources in this regard are the pension application papers submitted by veterans in the early nineteenth century. These provide us with a unique insight into the everyday lives of veterans. Looking at the issue of experience through the window of the pension files reveals that there was not much difference in the broad contours of disabled and nondisabled veteran life. This finding has implications for the theorisation of disability that are highlighted and discussed in the thesis. The main themes covered in this study are: the wartime experiences of injured American soldiers, the military pension establishment of the early United States and the legal construction of disability, and the post-war working and family lives of disabled veterans. Keywords: disability, early America, veterans, military pensions, disabled people, Revolutionary War, United States, disability theory.

Tuuleen piirrän nimeni : Daniel Urwindin fragmentaarinen omaelämäkerta Bo Carpelanin romaanissa Alkutuuli

Tutkielma käsittelee Bo Carpelanin romaania Alkutuuli (Urwind 1993) päähenkilö Daniel Urwindin fragmentaarisesti kerrottuna elämäntarinana. Kyse on kahdella aikatasolla etenevästä fiktiivisestä omaelämäkerrasta, joka perustuu viikottaisiin päiväkirjamerkintöihin. Daniel hahmottaa identiteettiään tilaan kytkeytyneiden muistojen sekä oman nimensä avulla leikaten samalla kerronnan jatkuvuuden. Tutkimusongelmana on hahmottaa Danielin kerronnan tavat, kirjoittamisen syyt sekä prosessiin lopputulos. Menneisyyteen kohdistuvan minä-kerronnan analyysi perustuu Dorrit Cohnin Transparent minds -teoksen käsitteistöön. Alkutuulessa esiintyy muistikerronnan ja muistimonologin epäsäännöllistä vuorottelua. Niiden osana on edesmenneiden läheisten upotettuja monologeja, joiden takaa kuultaa Danielin ääni: monologit ovat Danielin kuvittelemia tai referoimia puheita ja ajatuksia, joiden esittäjä on hänen yksinäisen keskustelunsa toinen osapuoli. Omaelämäkertaa käsittelevinä teoreettisina lähteinä ovat ensisijaisesti Päivi Kososen artikkelit sekä hänen tutkimuksensa Elämät sanoissa. Tutkielman tulkinnan kannalta keskeisessä asemassa ovat Bo Carpelanin essee- ja kaunokirjallinen tuotanto. Kirjoittamisen lähtökohtana on päähenkilön identiteettiä horjuttava elämänvaihe. Vaimo Marian lähdettyä vuodeksi Amerikkaan Daniel pyrkii löytämään oman kielensä ja luomaan muistojensa avulla eheämmän kuvan itsestään. Prosessiin kytkeytyy keskeisesti tila - Danielin kulkiessa talossaan, joka on hänen lapsuudenkotinsa, aistitodellisuus toimii mieleenpalauttajana: äänet ja tuoksut johdattavat hänet elämään menneisyyden muistoja uudelleen nykyhetkessä. Samalla talo ja huoneet personifioituvat ja minuus alkaa rakentua tilan kaltaiseksi. Uusien ovien ja huoneiden löytyminen symboloi Danielin muistojen selkeytymistä ja itseymmärryksen syvenemistä. Kirjoittamisen voi tulkita olevan psykoanalyyttinen prosessi, jossa omaelämäkerran minä keskustelee menneisyyden minänsä kanssa. Puhuja odottaa vastausta toiselta, vaikka vastaus löytyy paradoksaalisesti itsestä. Omaelämäkerran moniäänisyyttä korostavat edesmenneiden läheisten läsnäolo, Danielin eri ikävaiheiden identiteetit ja kaksoisolentojen hahmoissa esiintyvät minuudet. Kirjoittamisen avulla Daniel pyrkii pääsemään etäämmälle itsestään ja saavuttamaan minättömyyden tilan, jota käsitellään John Keatsilta peräisin olevan käsitteen "negatiivinen kyky" avulla. Alkutuuli on taiteilijaromaani, jossa taiteilijuutta edustavat siivet ja lentäminen kytkeytyvät mielikuvitukseen ja uusiutumiseen. Danielin tie taiteilijuutta edeltävään minättömyyteen on kuitenkin vaikea ja monet merkit viittaavat diletantin kohtaloon. Unenomaisen logiikan omaavan, fragmentaarisen kerronnan takaa on hahmotettavissa myös lainalaisuuksia. Muiden henkilöiden lyhyet elämäkerrat ovat heidän haavansa paljastavia episodeja, jotka muuttuvat osaksi Danielin elämäntarinaa. Danielin kirjallinen omakuva on montaasi, jossa eri tasossa olevat elementit, nykyhetki ja menneisyys, mielikuvitus, unet ja upotetut monologit rinnastuvat samaan tasoon. Daniel peilaa elettyä ja koettua koomisen peilirakenteen avulla, jossa hänen elämäänsä osallisena olleet menneisyyden henkilöt kulkevat narrikulkueen mukana. Toive eheästä minäkuvasta osoittautuu kuitenkin mahdottomaksi merkityssulkeuman todenvastaisuuden vuoksi. Urwind-nimen pohdinnasta liikkeelle lähtenyt omaelämäkerta päättyy syklistä liikettä mukaillen tilanteeseen, jossa päähenkilö hyväksyy elämän käsittämättömyyden ja luottaa omassa nimessään piilevään voimaan, tuuleen, viitaten samalla myös romaanin nimeen. Avainsanat: Bo Carpelan - muistot - tila - fragmentaarisuus - fiktiivinen omaelämäkerta

Insights into the molecular genetics of celiac disease : Applying family- and population-based strategies

Celiac disease, or gluten intolerance, is triggered by dietary glutens in genetically susceptible individuals and it affects approximately 1% of the Caucasian population. The best known genetic risk factors for celiac disease are HLA DQ2 and DQ8 heterodimers, which are necessary for the development of the disease. However, they alone are not sufficient for disease induction, other risk factors are required. This thesis investigated genetic factors for celiac disease, concentrating on susceptibility loci on chromosomes 5q31-q33, 19p13 and 2q12 previously reported in genome-wide linkage and association studies. In addition, a novel genotyping method for the detection of HLA DQ2 and DQ8 coding haplotypes was validated. This study was conducted using Finnish and Hungarian family materials, and Finnish, Hungarian and Italian case-control materials. Genetic linkage and association were analysed in these materials using candidate gene and fine-mapping approaches. The results confirmed linkage to celiac disease on the chromosomal regions 5q31-q33 and 19p13. Fine-mapping on chromosome 5q31-q33 revealed several modest associations in the region, and highlighted the need for further investigations to locate the causal risk variants. The MYO9B gene on chromosome 19p13 showed evidence for linkage and association particularly with dermatitis herpetiformis, the skin manifestation of celiac disease. This implies a potential difference in the genetic background of the intestinal and skin forms of the disease, although studies on larger samplesets are required. The IL18RAP locus on chromosome 2q12, shown to be associated with celiac disease in a previous genome-wide association study and a subsequent follow-up, showed association in the Hungarian population in this study. The expression of IL18RAP was further investigated in small intestinal tissue and in peripheral blood mononuclear cells. The results showed that IL18RAP is expressed in the relevant tissues. Two putative isoforms of IL18RAP were detected by Western blot analysis, and the results suggested that the ratios and total levels of these isoforms may contribute to the aetiology of celiac disease. A novel genotyping method for celiac disease-associated HLA haplotypes was also validated in this thesis. The method utilises single-nucleotide polymorphisms tagging these HLA haplotypes with high sensitivity and specificity. Our results suggest that this method is transferable between populations, and it is suitable for large-scale analysis. In conclusion, this doctorate study provides an insight into the roles of the 5q31-q33, MYO9B, IL18RAP and HLA loci in the susceptibility to celiac disease in the Finnish, Hungarian and Italian populations, highlighting the need for further studies at these genetic loci and examination of the function of the candidate genes.

Microarrays in Molecular Profiling of Ewing Sarcoma Family of Tumors and CDKN2A Aberrations

Background: The Ewing sarcoma family of tumors (ESFT) are rare but highly malignant neoplasms that occur mainly in bone or but also in soft tissue. ESFT affects patients typically in their second decade of life, whereby children and adolescents bear the heaviest incidence burden. Despite recent advances in the clinical management of ESFT patients, their prognosis and survival are still disappointingly poor, especially in cases with metastasis. No targeted therapy for ESFT patients is currently available. Moreover, based merely on current clinical and biological characteristics, accurate classification of ESFT patients often fails at the time of diagnosis. Therefore, there is a constant need for novel molecular biomarkers to be applied in tandem with conventional parameters to further intensify ESFT risk-stratification and treatment selection, and ultimately to develop novel targeted therapies. In this context, a greater understanding of the genetics and immune characteristics of ESFT is needed. Aims: This study sought to open novel insights into gene copy number changes and gene expression in ESFT and, further, to enlighten the role of inflammation in ESFT. For this purpose, microarrays were used to provide gene-level information on a genomewide scale. In addition, this study focused on screening of 9p21.3 deletion sizes and frequencies in ESFT and, in another pediatric cancer, acute lymphocytic leukemia (ALL), in order to define more exact criteria for highrisk patient selection and to provide data for developing a more reliable diagnostic method to detect CDKN2A deletions. Results: In study I, 20 novel ESFT-associated suppressor genes and oncogenes were pinpointed using combined array CGH and expression analysis. In addition, interesting chromosomal rearrangements were identified: (1) Duplication of derivative chromosome der(22)(11;22) was detected in three ESFT patients. This duplication included the EWSR1-FLI1 fusion gene leading to increase in its copy number; (2) Cryptic amplifications on chromosomes 20 and 22 were detected, suggesting a novel translocation between chromosomes 20 and 22, which most probably produces a fusion between EWSR1 and NFATC2. In study II, bioinformatic analysis of ESFT expression profiles showed that inflammatory gene activation is detectable in ESFT patient samples and that the activation is characterized by macrophage gene expression. Most interestingly, ESFT patient samples were shown to express certain inflammatory genes that were prognostically significant. High local expression of C5 and JAK1 at the tumor site was shown to associate with favorable clinical outcome, whereas high local expression of IL8 was shown to be detrimental. Studies III and IV showed that the smallest overlapping region of deletion in 9p21.3 includes CDKN2A in all cases and that the length of this region is 12.2 kb in both Ewing sarcoma and ALL. Furthermore, our results showed that the most widely used commercial CDKN2A FISH probe creates false negative results in the narrowest microdeletion cases (<190 kb). Therefore, more accurate methods should be developed for the detection of deletions in the CDKN2A locus. Conclusions: This study provides novel insights into the genetic changes involved in the biology of ESFT, in the interaction between ESFT cells and immune system, and in the inactivation of CDKN2A. Novel ESFT biomarker genes identified in this study serve as a useful resource for future studies and in developing novel therapeutic strategies to improve the survival of patients with ESFT.

Novel insights on functions of myotilin/palladin family members

Poikkijuovaisen luuranko- ja sydänlihaksen supistumisyksikkö, sarkomeeri, koostuu tarkoin järjestyneistä aktiini- ja myosiinisäikeistä. Rakenne eroaa muista solutyypeistä, joissa aktiinisäikeistö muovautuu jatkuvasti ja sen järjestyminen säätelee solun muotoa, solujakautumista, soluliikettä ja solunsisäisten organellien kuljetusta. Myotilin, palladin ja myopalladin kuuluvat proteiiniperheeseen, jonka yhteispiirteenä ovat immunoglobuliinin kaltaiset (Igl) domeenit. Proteiinit liittyvät aktiinitukirankaan ja niiden arvellaan toimivan solutukirangan rakenne-elementteinä ja säätelijöinä. Myotilinia ja myopalladinia ilmennetään poikkijuovaisessa lihaksessa. Sen sijaan palladinin eri silmukointimuotoja tavataan monissa kudostyypeissä kuten hermostossa, ja eri muodoilla saattaa olla solutyypistä riippuvia tehtäviä. Poikkijuovaisessa lihaksessa kaikki perheen jäsenet sijaitsevat aktiinisäikeitä yhdistävässä Z-levyssä ja ne sitovat Z-levyn rakenneproteiinia, -aktiniinia. Myotilingeenin pistemutaatiot johtavat periytyviin lihastauteihin, kun taas palladinin mutaatioiden on kuvattu liittyvän periytyvään haimasyöpään ja lisääntyneeseen sydäninfarktin riskiin. Tässä tutkimuksessa selvitettin myotilinin ja pallainin toimintaa. Kokeissa löydettiin uusia palladinin 90-92kDa alatyyppiin sitoutuvia proteiineja. Yksi niistä on aktiinidynamiikkaa säätelevä profilin. Profilinilla on kahdenlaisia tehtäviä; se edesauttaa aktiinisäikeiden muodostumista, mutta se voi myös eristää yksittäisiä aktiinimolekyylejä ja edistää säikeiden hajoamista. Solutasolla palladinin ja profilinin sijainti on yhtenevä runsaasti aktiinia sisältävillä solujen reuna-alueilla. Palladinin ja profilinin sidos on heikko ja hyvin dynaaminen, joka sopii palladinin tehtävään aktiinisäideiden muodostumisen koordinoijana. Toinen palladinin sitoutumiskumppani on aktiinisäikeitä yhteensitova -aktiniini. -Aktiniini liittää solutukirangan solukalvon proteiineihin ja ankkuroi solunsisäisiä viestintämolekyylejä. Sitoutumista välittävä alue on hyvin samankaltainen palladinissa ja myotilinissa. Luurankolihaksen liiallinen toistuva venytys muuttaa Z-levyjen rakennetta ja muotoa. Prosessin aikana syntyy uusia aktiinifilamenttejä sisältäviä tiivistymiä ja lopulta uusia sarkomeereja. Löydöstemme perusteella myotilinin uudelleenjärjestyminen noudattaa aktiinin muutoksia. Tämä viittaa siihen, että myotilin liittää yhteen uudismuodostuvia aktiinisäikeitä ja vakauttaa niitä. Myotilin saattaa myös ankkuroida viesti- tai rakennemolekyylejä, joiden tehtävänä on edesauttaa Z-levyjen uudismuodostusta. Tulostemme perusteella arvelemme, että myotilin toimii Z-levyjen rakenteen vakaajana ja aktiinisäikeiden säätelijänä. Palladinin puute johtaa sikiöaikaiseen kuolemaan hiirillä, mutta myotilinin puutoksella ei ole samanlaisia vaikutuksia. Tuotettujen myotilin poistogeenisten hiirten todetiin syntyvän ja kehittyvän normaalisti eikä niillä esiintynyt rakenteellisia tai toiminnallisia häiriöitä. Toisaalta aiemmissa kokeissa, joissa hiirille on siirretty ihmisen lihastautia aikaansaava myotilingeeni, nähdään samankaltaisia kuin sairailla ihmisillä. Näin ollen muuntunut myotilin näyttä olevan lihaksen toiminnalle haitallisempi kuin myotilinin puute. Myotilinin ja palladinin yhteisvaikutusta selvittääksemme risteytimme myotilin poistegeenisen hiiren ja hiirilinjan, joka ilmentää puutteellisesti palladinin 200 kDa muotoa. Puutteellisesti 200 kDa palladinia ilmentävien hiirten sydänlihaksessa todettiin vähäisiä hienorakenteen muutoksia, mutta risteytetyillä hiirillä tavattiin rakenteellisia ja toiminnallisia muutoksia myös luurankolihaksessa. Tulosten perusteella voidaan todeta, että palladinin 200 kDa muoto säätelee sydänlihassolujen rakennetta. Luurankolihaksessa sen sijaan myotilinilla ja palladinilla näyttäisi olevan päällekkäisiä tehtäviä.

Enzymes with radical tendencies: the PFL family

The first glycyl radical in an enzyme was described 20 years ago and since then the family of glycyl radical enzymes (GREs) has expanded to include enzymes catalysing five chemically distinct reactions. The type enzymes of the family, anaerobic ribonucleotide reductase (RNRIII) and pyruvate formate lyase (PFL) had been studied long before it was known that they are GREs. Spectroscopic measurements on the radical and an observation that exposure to oxygen irreversibly inactivates the enzymes by cleavage of the protein proved that the radical is located on a particular glycine residue, close to the C-terminus of the protein. Both anaerobic RNRIII and PFL, are important for many anaerobic and facultative anaerobic bacteria as RNRIII is responsible for the synthesis of DNA precursors and PFL catalyses a key metabolic reaction in glycolysis. The crystal structures of both were solved in 1999 and they revealed that, although the enzymes do not share significant sequence identity, they share a similar structure - the radical site and residues necessary for catalysis are buried inside a ten stranded $\ualpha $/$\ubeta $-barrel. GREs are synthesised in an inactive form and are post-translationally activated by an activating enzyme which uses S-adenosyl methionine and an iron-sulphur cluster to generate the radical. One of the goals of this thesis work was to crystallise the activating enzyme of PFL. This task is challenging as, like GREs, the activating component is inactivated by oxygen. The experiments were therefore carried out in an oxygen free atmosphere. This is the first report of a crystalline GRE activating enzyme. Recently several new GREs have been characterised, all sharing sequence similarity to PFL but not to RNRIII. Also, the genome sequencing projects have identified many PFL-like GREs of unknown function, usually annotated as PFLs. In the present thesis I describe the grouping of these PFL family enzymes based on the sequence similarity and analyse the conservation patterns when compared to the structure of E. coli PFL. Based on this information an activation route is proposed. I also report a crystal structure of one of the PFL-like enzymes with unknown function, PFL2 from Archaeoglobus fulgidus. As A. fulgidus is a hyperthermophilic organism, possible mechanisms stabilising the structure are discussed. The organisation of an active site of PFL2 suggests that the enzyme may be a dehydratase. Keywords: glycyl radical, enzyme, pyruvate formate lyase, x-ray crystallography, bioinformatics