Terapia génica dirigida en una nuevo "sitio seguro" en células progenitoras hematopoyéticas humanas para su aplicación en anemia de Fanconi

La anemia de Fanconi es una enfermedad hereditaria de baja prevalencia, descrita por primera vez por el pediatra Guido Fanconi en 1927. Esta enfermedad se produce como consecuencia de mutaciones en cualquiera de los 19 genes de Fanconi descritos hasta la actualidad, y que participan en la ruta de Fanconi/BRCA. Esta ruta se encarga de la reparación de enlaces intercatenarios del ADN y de coordinar los distintos mecanismos de reparación de las dobles roturas en el ADN. La anemia de Fanconi está caracterizada por generar inestabilidad genómica, lo que da lugar a anomalías esqueléticas y predisposición al cáncer, si bien la principal causa de muerte de pacientes pediátricos es el fallo de médula ósea. Uno de los tratamientos alternativos al trasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos de pacientes con anemia de Fanconi se basa en la reinfusión de células madre hematopoyéticas autólogas, tras su corrección con vectores lentivirales. Para limitar al máximo los riesgos de este tipo de terapias se están desarrollando nuevas tecnologías de edición génica basadas en la inserción dirigida de los genes terapéuticos. Esta nueva aproximación se fundamenta en la generación de dobles roturas en regiones específicas del genoma, cuya reparación por recombinación homóloga facilitaría la entrada de los genes terapéuticos aportados por ADNs donadores externos con homología por dicha región. En este trabajo se ha desarrollado una aproximación de edición génica en un nuevo “sitio seguro” del genoma denominado SH6. Para ello se ha trabajado con la línea celular HEK-293H, así como también con progenitores hematopoyéticos humanos purificados en base a la expresión del marcador CD34. Para su desarrollo se han utilizado nucleasas de edición, tales como meganucleasas y TALEN, en combinación con matrices donadoras portadoras del gen marcador EGFP (GM) o del gen terapéutico FANCA (TM). En todos los casos los genes marcadores y terapéuticos estaban regulados por el promotor EF1α, y flanqueados por dos brazos de homología para el sitio SH6. Estos plásmidos han servido como molde para realizar la terapia génica de edición en el sitio seguro SH6...

Efecto de la introducción de genética Duroc y de la restricción de vitamina A en la dieta sobre parámetros productivos, expresión génica y calidad de la carne en el cerdo ibérico

El cerdo ibérico es una raza porcina que se caracteriza por una alta tasa de acumulación de grasa y por una capacidad de crecimiento magro limitada. Su carne tiene un alto contenido en grasa y un perfil de ácidos grasos característico que determina la alta calidad de sus productos. Esta raza ha sido cruzada con machos Duroc de forma habitual para mejorar el rendimiento productivo y el desarrollo muscular. Esta práctica disminuye la grasa intramuscular (GIM) y el contenido en ácidos grasos monoinsaturados (AGMI), parámetros asociados con la calidad de la carne. Estudios previos han demostrado que la genética y la nutrición entre otros, son factores clave que determinan la cantidad y composición de la GIM. El objetivo general de la presente Tesis Doctoral ha sido profundizar en el conocimiento de los mecanismos genéticos y moleculares asociados a caracteres fenotípicos de interés en el cerdo ibérico, especialmente el contenido y composición de la GIM, así como conocer la respuesta de estos mecanismos ante estrategias nutricionales, concretamente la restricción de vitamina A. Para la consecución de estos objetivos, se diseñaron dos ensayos experimentales. En el primero, se estudió el efecto del tipo genético y de la edad sobre el fenotipo y el transcriptoma muscular de cerdos ibéricos puros y cruzados con Duroc. Las etapas de desarrollo empleadas fueron el nacimiento y los cuatro meses de edad. Se analizaron diversos caracteres fenotípicos de interés y el transcriptoma de los músculos Longissimus dorsi (LD, en ambas edades) y Biceps femoris (BF, al nacimiento)...

Aplicación del sistema de recombinación específica de secuencia β-six al estudio de la regulación de la expresión génica en células eucariotas y modelos animales

Las recombinasas específicas de secuencia son herramientas muy valiosas en la generación de modificaciones génicas condicionales. Estos sistemas permiten controlar la recombinación de forma específica de tejido, temporalmente, o ambas, y sortean diversas limitaciones de los sistemas de knockout (KO) convencionales, como la letalidad embrionaria o la generación de mecanismos compensatorios. Actualmente los sistemas Cre/loxP y Flp/FRT son los más empleados tanto en modelos animales como vegetales. La necesidad de realizar modificaciones más complejas en un mismo organismo hace que sea primordial caracterizar otras recombinasas que complementen a las existentes. La b recombinasa (b-rec) es originaria del plásmido pSM19035 de Streptococcus pyogenes. A diferencia de Cre y Flp, que en ausencia de factores adicionales catalizan la integración en un nuevo sustrato, la b-rec necesita un sustrato superenrollado y un cofactor de la reacción, una proteína asociada a la cromatina (como la procariota Hbsu o la eucariota HMG1). Se ha demostrado que la b-rec cataliza de forma específicamente intramolecular (resolución o inversión) la recombinación en células eucariotas, tanto de sustratos episomales como integrados en la cromatina, lo que indica que el entorno eucariota es capaz de proveer del cofactor y del superenrollamiento necesarios para que la b-rec realice su función. En este trabajo hemos determinado que la tasa de recombinación mediada por la b-rec no se ve afectada en absoluto por la deficiencia en el cofactor HMG1, alcanzando el mismo valor de recombinación en MEF KO en HMG1 que en wt. Este y otros datos confirman que en el entorno eucariota hay otras proteínas accesorias que pueden actuar de cofactores y sugiere que estas reacciones pueden ocurrir en la mayor parte de tejidos y tipos celulares. Para estudiar detalladamente el potencial de la b-rec en eucariotas desarrollamos un sistema de RAGE (activación génica mediada por recombinación) dependiente de la actividad b-rec; este sistema ha resultado funcional tanto en sustratos episomales como en sustratos integrados en la cromatina. También hemos generado un vector retroviral que porta la proteína de fusión b-Egfp, permitiendo de forma rápida y eficiente la integración y expresión funcional de nuestra proteína...

Variation in the expression of migratory activity in blackcap (Sylvia atricapilla); effects of the origin, environmental conditions, dominance and personalities

La migración es una respuesta a cambios estacionales del clima generando desplazamientos periódicos entre hábitats de cría y de invernada, permitiendo así el uso temporal de los recursos disponibles. La migración implica unos costes energéticos muy elevados, un aumento de la depredación potencial, variaciones ambientales y una disponibilidad de alimento impredecible a lo largo de la ruta migratoria; por lo que es una de las actividades más desafiantes de su ciclo vital. A pesar de ello, los beneficios de la migración compensan sus costes. La migración está programada genéticamente, siendo relativamente constante en su momento, distancia y dirección. Por otro lado, ambiente juega un papel predominante en algunas poblaciones, pudiendo modificar el comportamiento migratorio de una estrategia parcial o facultativa a un modo de vida sedentario. Con el fin de describir el origen y evolución del comportamiento migratorio en aves, se ha propuesto un “modelo de umbral” genético para determinar si un ave es migrante o sedentaria. Dentro de una variable continua (p.ej. la concentración de proteínas u hormonas), este modelo asume que existe una actividad migratoria subyacente implicada en su expresión génica. Este umbral divide cada variable en categorías dicotómicas que definen el fenotipo de un individuo. Los ejemplares sin actividad migratoria muestran valores por debajo de este umbral, siendo clasificados como sedentarios, mientras que los ejemplares migrantes muestran valores por encima del umbral definido. Los cambios de estrategia vital no dependen únicamente de la posición del umbral determinado genéticamente sino también de las variables ambientales, por lo que dichas variaciones deben ser añadidas al modelo. Este modelo de umbral ambiental predice que el carácter migratorio de los individuos situados en los extremos de distribución no se encuentra afectado por los factores ambientales, mientras que aquellos más próximos al umbral pueden más fácilmente cambiar su estrategia migratoria...

Estudio a corto y largo plazo de la melatonina y el 5-MCA-NAT como tratamiento en la hipertensión ocular y el glaucoma

El glaucoma engloba una serie de enfermedades que se caracterizan por la pérdida progresiva de las células ganglionares de la retina y la neuropatía del nervio óptico, que desencadenan finalmente una ceguera irreversible. La elevación de la presión intraocular (PIO) aparece como el principal desencadenante de esta patología en la mayoría de los casos, ya que produce una disminución del flujo sanguíneo hacia la retina y un aumento del estrés oxidativo. La estrategia terapéutica más común implica el uso de fármacos hipotensores, a menudo combinados, asociados a efectos no deseados. En este marco, la melatonina y sus análogos, como el 5-MCA-NAT, surgen como alternativas a los fármacos ya existentes, por sus propiedades hipotensoras y antioxidantes y, en el caso del 5-MCA-NAT, por su posible acción a largo plazo. El objetivo de esta tesis es elucidar los mecanismos de la acción hipotensora aguda ya descrita para estos compuestos, determinando además el receptor y las vías de señalización implicadas en esta respuesta a corto plazo. En este mismo sentido nos proponemos confirmar la existencia de efectos hipotensores a largo plazo, analizando esta respuesta a diferentes fármacos y esclareciendo si ésta se debe a la capacidad de estos compuestos como modificadores de la expresión génica de enzimas o receptores implicados en la regulación de la PIO...

Nutrigenómica de la tilapia, ("Oreochromis niloticus") alimentada con diferentes fuentes de ácidos grasos

El pescado es uno de los productos alimenticios básicos más comercializados en el mundo y desempeña un papel importante en la seguridad alimentaria y nutritiva, por ser una fuente de ácidos grasos omega 3 de cadena larga (EPA y DHA). El creciente interés por esta fuente de ácidos grasos ha incrementado su precio y, con ello, los costos de producción en la acuicultura. Todo esto ha llevado a la búsqueda de nuevas fuentes alternativas de ácidos grasos omega 3 de cadena larga para reemplazarlos. El objetivo de esta tesis fue investigar los efectos producidos en el metabolismo de los ácidos grasos y en los procesos de estrés en la Tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus), al sustituir el aceite de pescado (fuente de ácidos grasos omega-3 de cadena larga) de su dieta por aceites vegetales (aceite de lino, aceite de girasol y aceite de girasol alto-oleico). Utilizando muestras de cerebro, músculo e hígado, se evaluaron los perfiles de expresión génica por Differential Display y la expresión relativa de genes candidatos mediante RT-PCR cuantitativa. Los resultados mostraron que las dietas basadas en aceites vegetales produjeron un aumento significativo en la expresión de genes que participan en la elongación y desaturación de los ácidos grasos (que permiten la conversión de ácidos grasos esenciales linoleico y linolénico en PUFA de cadena larga: AA, EPA y DHA) y una disminución en la expresión de enzimas que se activan en situaciones de estrés por osmorregulación, choque térmico y respuesta inmune. Estos resultados aportan una prueba más de que es posible sustituir el aceite de pescado por aceites vegetales en la dieta de Tilapia del Nilo, sin generar efectos negativos en el bienestar animal...