Mecanismos celulares activados por receptores P2Y��� en los procesos ciliares: implicaciones en la hipertensi��n ocular y el glaucoma

El glaucoma es una neuropat��a ��ptica cr��nica de etiolog��a multifactorial, que provoca una p��rdida progresiva e irreversible de la visi��n debida a la degeneraci��n de los axones del nervio ��ptico y la muerte apopt��tica de las c��lulas ganglionares de la retina (Downs et al., 2011; Quigley, 2011; Soto et al., 2014). Actualmente es la principal causa de ceguera irreversible en el mundo (Pascolini et al., 2012). Aunque su etiolog��a a��n no est�� clara, se sabe que el principal factor de riesgo para desarrollar la enfermedad es el aumento de la PIO debido a anomal��as en la din��mica del humor acuoso (Casson et al., 2012). La presencia de receptores purin��rgicos P2X y P2Y ha sido descrita en las principales estructuras oculares relacionadas con la producci��n y drenaje del humor acuoso, los procesos ciliares y la malla trabecular, que son ba��adas por dicho fluido (Guzman-�����Aranguez et al., 2013). Al mismo tiempo, se ha referido la presencia del dinucle��tido Ap4A, agonista de dichos receptores, en el humor acuoso, y c��mo sus niveles se ve��an significativamente incrementados en pacientes glaucomatosos (Castany et al., 2011). El objetivo de esta tesis ha sido evaluar la implicaci��n de los receptores purin��rgicos P2Y2 de los procesos ciliares en la hipertensi��n ocular. M��s concretamente determinar el papel del Ap4A a trav��s de la activaci��n de dichos receptores sobre la movilizaci��n del ion cloruro y del agua a trav��s de las proteínas acuaporinas (AQPs), principales componentes del humor acuoso. Por otra parte, se ha investigado el origen de los niveles incrementados de Ap4A debidos al aumento de la PIO, caracterizando uno de los posibles sensores celulares implicados en dicho proceso. Al mismo tiempo se han evaluado y caracterizado los diferentes mecanismos implicados en dicha liberaci��n...

Aplicaci��n del sistema de recombinaci��n espec��fica de secuencia ��-six al estudio de la regulaci��n de la expresi��n g��nica en c��lulas eucariotas y modelos animales

Las recombinasas espec��ficas de secuencia son herramientas muy valiosas en la generaci��n de modificaciones g��nicas condicionales. Estos sistemas permiten controlar la recombinaci��n de forma espec��fica de tejido, temporalmente, o ambas, y sortean diversas limitaciones de los sistemas de knockout (KO) convencionales, como la letalidad embrionaria o la generaci��n de mecanismos compensatorios. Actualmente los sistemas Cre/loxP y Flp/FRT son los m��s empleados tanto en modelos animales como vegetales. La necesidad de realizar modificaciones m��s complejas en un mismo organismo hace que sea primordial caracterizar otras recombinasas que complementen a las existentes. La b recombinasa (b-rec) es originaria del pl��smido pSM19035 de Streptococcus pyogenes. A diferencia de Cre y Flp, que en ausencia de factores adicionales catalizan la integraci��n en un nuevo sustrato, la b-rec necesita un sustrato superenrollado y un cofactor de la reacci��n, una prote��na asociada a la cromatina (como la procariota Hbsu o la eucariota HMG1). Se ha demostrado que la b-rec cataliza de forma espec��ficamente intramolecular (resoluci��n o inversi��n) la recombinaci��n en c��lulas eucariotas, tanto de sustratos episomales como integrados en la cromatina, lo que indica que el entorno eucariota es capaz de proveer del cofactor y del superenrollamiento necesarios para que la b-rec realice su funci��n. En este trabajo hemos determinado que la tasa de recombinaci��n mediada por la b-rec no se ve afectada en absoluto por la deficiencia en el cofactor HMG1, alcanzando el mismo valor de recombinaci��n en MEF KO en HMG1 que en wt. Este y otros datos confirman que en el entorno eucariota hay otras proteínas accesorias que pueden actuar de cofactores y sugiere que estas reacciones pueden ocurrir en la mayor parte de tejidos y tipos celulares. Para estudiar detalladamente el potencial de la b-rec en eucariotas desarrollamos un sistema de RAGE (activaci��n g��nica mediada por recombinaci��n) dependiente de la actividad b-rec; este sistema ha resultado funcional tanto en sustratos episomales como en sustratos integrados en la cromatina. Tambi��n hemos generado un vector retroviral que porta la prote��na de fusi��n b-Egfp, permitiendo de forma r��pida y eficiente la integraci��n y expresi��n funcional de nuestra prote��na...

Identificaci��n y caracterizaci��n de las proteínas NcROP40 y NcNTPasa, y evaluaci��n de su utilidad vacunal frente a la neosporosis

Neospora caninum es un par��sito formador de quistes reconocido a nivel mundial como la principal causa de aborto en ganado vacuno, donde produce importantes p��rdidas econ��micas. A pesar de que la vacunaci��n se ha descrito como la estrategia de control m��s eficiente frente a la neosporosis bovina, hasta la fecha no existen formulaciones eficaces que prevengan la transmisi��n vertical y el aborto. En la actualidad, las medidas de control de la enfermedad dependen de un diagn��stico adecuado asociado a unas medidas de manejo concretas, por lo que el desarrollo de una vacuna frente a la neosporosis bovina es una tarea urgente. En este sentido, las vacunas de subunidades se presentan como una buena alternativa al uso de vacunas vivas, debido a su mayor seguridad y menor coste de producci��n; adem��s, dichas vacunas pueden ser espec��ficamente dise��adas frente a proteínas determinadas con el fin de bloquear procesos esenciales para la supervivencia del par��sito. Desgraciadamente, el conocimiento de los mecanismos de invasi��n y proliferaci��n de N. caninum es muy limitado a nivel molecular. Adem��s, son pocos los estudios en los que se haya abarcado la identificaci��n de factores de virulencia potenciales del par��sito. Todo ello dificulta la selecci��n de dianas apropiadas a la hora de dise��ar nuevas formulaciones vacunales frente a la neosporosis...

Estudio prote��mico de las ves��culas extracelulares y del secretoma de "Candida albicans" y an��lisis funcional de proteínas de superficie celular

Candida albicans es un importante pat��geno oportunista en humanos, que puede causar distintos tipos de infecciones, desde micosis superficiales hasta sist��micas. La candidiasis invasiva es una enfermedad que puede causar mortalidad en pacientes inmunocomprometidos. Para causar da��o en el hospedador, C. albicans cuenta con una serie de factores de virulencia. Entre ellos destaca la capacidad de cambiar su forma de crecimiento de levadura a hifa. La superficie celular es la estructura m��s externa de la c��lula y el punto de contacto entre el hongo y el hospedador. Las proteínas de superficie tienen un papel importante en la integridad estructural de la c��lula y en la adherencia e invasi��n de c��lulas del hospedador. Una de las proteínas localizadas en la superficie celular es Ecm33, una prote��na de pared celular con anclaje glicosilfosfatidilinositol (GPI). La deleci��n de esta prote��na afecta a la morfolog��a tanto de levaduras como de hifas, dando como resultado c��lulas con la pared celular alterada y virulencia reducida tanto en condiciones in vitro como in vivo. El secretoma o las proteínas secretadas por C. albicans son tambi��n relevantes en la interacci��n pat��geno-hospedador. C. albicans secreta muchas proteínas importantes relacionadas con diferentes procesos, entre los que se incluyen la formaci��n de biofilms, la adquisici��n de nutrientes y el mantenimiento de la integridad de la pared celular. Muchas de estas proteínas secretadas, como las pertenecientes a las familias de aspartil proteasas (Sap) y la familia de fosfolipasas B (Plb), tambi��n han sido detectadas en la pared celular, ya que deben pasar a trav��s de ella en su tr��nsito hacia el medio extracelular. Estas proteínas tienen un p��ptido se��al en el extremo N-terminal que es el responsable de dirigirlas a la ruta cl��sica de secreci��n. Sin embargo, cerca de un tercio de las proteínas identificadas en el medio extracelular de C. albicans no poseen dicho p��ptido se��al en su secuencia...