Aplicación del sistema de recombinación específica de secuencia β-six al estudio de la regulación de la expresión génica en células eucariotas y modelos animales

Las recombinasas específicas de secuencia son herramientas muy valiosas en la generación de modificaciones génicas condicionales. Estos sistemas permiten controlar la recombinación de forma específica de tejido, temporalmente, o ambas, y sortean diversas limitaciones de los sistemas de knockout (KO) convencionales, como la letalidad embrionaria o la generación de mecanismos compensatorios. Actualmente los sistemas Cre/loxP y Flp/FRT son los más empleados tanto en modelos animales como vegetales. La necesidad de realizar modificaciones más complejas en un mismo organismo hace que sea primordial caracterizar otras recombinasas que complementen a las existentes. La b recombinasa (b-rec) es originaria del plásmido pSM19035 de Streptococcus pyogenes. A diferencia de Cre y Flp, que en ausencia de factores adicionales catalizan la integración en un nuevo sustrato, la b-rec necesita un sustrato superenrollado y un cofactor de la reacción, una proteína asociada a la cromatina (como la procariota Hbsu o la eucariota HMG1). Se ha demostrado que la b-rec cataliza de forma específicamente intramolecular (resolución o inversión) la recombinación en células eucariotas, tanto de sustratos episomales como integrados en la cromatina, lo que indica que el entorno eucariota es capaz de proveer del cofactor y del superenrollamiento necesarios para que la b-rec realice su función. En este trabajo hemos determinado que la tasa de recombinación mediada por la b-rec no se ve afectada en absoluto por la deficiencia en el cofactor HMG1, alcanzando el mismo valor de recombinación en MEF KO en HMG1 que en wt. Este y otros datos confirman que en el entorno eucariota hay otras proteínas accesorias que pueden actuar de cofactores y sugiere que estas reacciones pueden ocurrir en la mayor parte de tejidos y tipos celulares. Para estudiar detalladamente el potencial de la b-rec en eucariotas desarrollamos un sistema de RAGE (activación génica mediada por recombinación) dependiente de la actividad b-rec; este sistema ha resultado funcional tanto en sustratos episomales como en sustratos integrados en la cromatina. También hemos generado un vector retroviral que porta la proteína de fusión b-Egfp, permitiendo de forma rápida y eficiente la integración y expresión funcional de nuestra proteína...

Nuevos modelos animales para el estudio de la infección por "Neospora caninum" durante la gestación

Neospora caninum es un parásito intracelular apicomplejo causante de la neosporosis, una enfermedad considerada como una de las principales causas de aborto en el ganado bovino. Esta parasitosis origina cuantiosas pérdidas económicas a nivel mundial, presentando una amplia distribución y una elevada prevalencia en el ganado bovino en la mayoría de países donde se ha estudiado. Actualmente, la inmunoprofilaxis se considera como la medida más importante para el control de la enfermedad, aunque, desafortunadamente, no existe una vacuna eficaz disponible. La única vacuna comercializada hasta el momento (Neoguard) ha sido retirada del mercado hace años debido a la baja eficacia mostrada. Por tanto, el esfuerzo de muchos grupos de investigación se centra hoy en día en el desarrollo de nuevas vacunas y fármacos eficaces y seguros frente a la neosporosis bovina. Con este fin, los modelos animales, además de ser de gran utilidad para estudiar la relación parásito-hospedador, la respuesta inmunitaria o la patogenia, son herramientas esenciales para realizar una evaluación adecuada de la eficacia y seguridad de vacunas y fármacos. Sin embargo, no existe un modelo normalizado, ya que aquellos descritos en la literatura se han llevado a cabo bajo condiciones experimentales muy variables. Estas diferencias incluyen, entre otras, la raza o estirpe de los animales empleados, el aislado de N. caninum, la manipulación del parásito para la inoculación, la vía de administración y la dosis utilizada en el ensayo. Además, en el caso de los modelos gestantes, el momento de la gestación en el cual se infecta a los animales supone una importante variable adicional. Por lo tanto, es necesario el desarrollo de modelos animales consensuados entre los diferentes laboratorios de investigación que permitan comparar y validar los resultados obtenidos en cada uno de ellos...

Papel biológico del diadenosin tetrafosfato en el ojo: efecto sobre la composición lacrimal e implicación en la función de barrera corneal

El Ap4A es una molécula con un amplio papel biológico en el ojo. Se ha descrito su implicación en procesos de secreción lagrimal, cicatrización epitelial, regulación de la presión intraocular, y presenta también un papel neuroprotector sobre los terminales simpáticos que inervan el cuerpo ciliar. El objetivo de este trabajo ha sido analizar la participación del Ap4A en otras posibles funciones a nivel ocular. En concreto se ha estudiado la capacidad de este dinucléotido para estimular la liberación de proteínas lagrimales de acción antibacteriana tales como la lisozima y la lactoferrina. Por otra parte se ha investigado su efecto como modulador de la función de barrera de la córnea a través de la regulación de los niveles de expresión de proteínas constituyentes de las tight junctions (TJ). Dicho efecto sobre la barrera puede tener una importante repercusión en la entrada de fármacos y en la consiguiente eficacia terapéutica de los mismos. Por último, se ha estudiado la posible implicación del dinucleótido en el proceso de edematización descrito en modelos animales glaucomatosos tales como el ratón DBA/2J. Con el objetivo de averiguar si la activación de Ap4A inducía un efecto sobre la producción de dos proteínas antimicrobianas relevantes de la lágrima (lisozima y lactoferrina) se realizaron ensayos en la lágrima de conejos albinos de Nueva Zelanda, mediante las técnicas de agar-agar y ELISA. Los resultados obtenidos demostraron que Ap4A produce un aumento en la concentración de lisozima y de lactoferrina del 93% y 24%, respectivamente, frente a valores basales, y este efecto está mediado por receptores de tipo P2...