Physiological and biochemical responses of Scytonema javanicum (cyanobacterium) to salt stress

Scytonema javanicum (Kutz.) Born et Flah (cyanobacterium) is one of the species distributed widely in the crust of desert soils regularly subjected to severe water stress. To investigate the response of the species to salt stress, many physiological and biochemical parameters, including growth rate, ratio of variable fluorescence to maximum fluorescence (Fv/Fm), reactive oxidative species (ROS), malondialdehyde (MDA), catalase (CAT), and superoxide dismutase (SOD), were determined in culture. The results showed that 50 mM NaCl inhibited growth and Fv/Fm in the medium BG-110, and that the inhibition was maximum after 1-2 days' exposure to salt stress; 50 mM NaCl also increased the contents of ROS and MDA in treated cells, which suggests that salt stress may lead to oxidative damage and lipid peroxidation in the alga. Further, changes in the antioxidative enzymes SOD and CAT in the treated alga were consistent with changes in ROS and MDA at certain extent. These observations suggest that oxidative stress resulting from salt stress in S. javanicum could result in the production of antioxidative enzymes to counteract the oxidative damage, and the enzymes may contribute to the ability of S. javanicum to survive the adverse desert environment. (c) 2007 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Effects of salt stress on carbohydrate metabolism in desert soil alga Microcoleus vaginatus Gom.

The effects of salt stress on carbohydrate metabolism in Microcoleus vaginatus Gom., a cyanobacterium isolated from desert algal crusts, were investigated in the present study. Extracellular total carbohydrates and exopolysaccharides (EPS) in the culture medium produced by M. vaginatus increased significantly during the growth phase and reached a maximum during the stationary phase. The production of extracellular carbohydrates also significantly increased under higher salt concentrations, which was attributed to an increase in low molecular weight carbohydrates. In the presence of NaCl, the production of cellular total carbohydrates decreased and photosynthetic activity was impaired, whereas cellular reducing sugars, water-soluble sugars and sucrose content and sucrose phosphate synthase activity increased, reaching a maximum in the presence of 200 mmol/L NaCl. These parameters were restored to original levels when the algae were transferred to a non-saline medium. Sodium and K+ concentrations of stressed cells decreased significantly and H+-ATPase activity increased after the addition of exogenous sucrose or EPS. The results suggest that EPS and sucrose are synthesized to maintain the cellular osmotic equilibrium between the intra- and extracellular environment, thus protecting algal cells from osmotic damage, which was attributed to the selective exclusion of cellular Na+ and K+ by H+-ATPase.

Salt tolerance of Microcoleus vaginatus Gom., a cyanobacterium isolated from desert algal crust, was enhanced by exogenous carbohydrates

Microcoleus vaginatus isolated from a desert algal crust of Shapotou was cultured in BG-11 medium containing 0.2mol l(-1) NaCl or 0.2mol l(-1) NaCl plus 100mg l(-1) sucrose, extracellular polymeric substances (EPS) or hot water-soluble polysaccharides (HWP), respectively. Photosynthetic oxygen evolution rates, photosystem 11 activity (Fv/Fm) and dark respiration of NaCl-stressed cells were enhanced significantly by the added sucrose or EPS under salt stress conditions (0.2mol l(-1) NaCl). Compared with cells treated with salt alone, sodium contents in cells reduced significantly; the content of cellular total carbohydrate did not change, and intracellular sucrose, water-soluble sugar increased significantly following the addition of exogenous carbohydrates. Sucrose synthase (SS) activity of NaCl-stressed cells increased following the addition of sucrose, and sucrose phosphate synthase (SPS) activity of NaCl-stressed cells increased following the addition of exogenous sucrose, EPS or HWP compared with cells stressed with NaCl only. The results suggested that the extruded EPS might be re-absorbed by cells of M. vaginatus as carbon source, they could increase salt tolerance of M. vaginatus through the changes of carbohydrate metabolism and the selective uptake of sodium ions. (C) 2003 Elsevier Science Ltd. All rights reserved.

胡杨体细胞再生植株及耐机制的研究

胡杨（Populus euphratica Oliv.）是干旱荒漠风沙前治地区唯一分布的乔木树种，具有极强的抗逆性，突出地表现出较强的耐盐碱能力。由于胡杨在繁殖上存在问题，种子采后极易丧失生活力和无性扦插繁殖难以生根，加之人们对胡杨耐盐抗逆机制缺乏了解，应而极大地制约了这一珍贵抗逆种质资源的开发和利用，现有资源的保存也受到严重危胁。试验首先利用植物细胞工程技术开展了胡杨体细胞再生植株的系统研究，并在分子水平上就愈伤组织的培养和器官发生过程中表达的特异蛋白开展了深入工作。其次，对胡杨耐盐机制进行了研究，分析了胡杨细胞盐胁迫响应蛋白，开展了盐胁迫条件下细胞对离子吸收和分配特性以及与耐盐有关的形态结构的研究。这一工作的开展对于有效地保存、开发和利用胡杨种质资源，对于荒漠化治理，以及深入认识胡杨耐盐性、丰富和发展木本植物耐盐理论，具有十分重要的意义。 研究取得的主要结果如下： 1.较好地解决了胡杨试管培养中黄萎和退化等难以克服的问题，通过全面和系统的比较研究和对培养条件的优化，首次获得了高频率的和成熟的胡杨体细胞再生植株体系。胡杨愈伤组织、离体叶片和离体茎段不定芽再生频率分别可达82.9％、100％和83％，试管苗生根为86.2％。 2.提出了以愈伤组织表达蛋白状况作为判定其器官发生能力的观点，确定了三类愈伤组织和器官发生中三个不同分化阶段的蛋白分子标记。利用SDS-PAGE和IEF－SDS－PAGE对胡杨不同类型愈伤组织和愈伤组织分化不定芽过程的蛋白进行了研究。结果表明：不同类型愈伤组织中表达的蛋白存在着一定差异。在光下和BA／NAA为1诱导产生的具有较强器官发生能力的茎基愈伤组织，其蛋白组分明显地少于其它类型的愈伤组织，表明其分化程度较低。经过黑暗和BA／NAA为0.5的继代培养，愈伤组织产生了特异的24。5KD和58.6KD的标记蛋白，并且也表达了其器官发生时表达的19KD和31KD蛋白。说明愈伤组织经过继代培养其器官发生能力下降是与细胞分化程度增加相关的。茎基愈伤组织在光下和BA／NAA为5的条件下进行器官发生诱导，随着愈伤组织形成分生细胞团块和不定芽原基明显地表达了20KD和55KD蛋白带，并且20KD蛋白中包含有特异的pI为5。5－6.5的蛋白。43KD和pI为6.5-7.5的蛋白为器官发生前期蛋白。本文不愈伤组织表达蛋白状况与器官发生能力间关系进行了讨论。 3.分离和鉴定了胡杨细胞盐胁迫响应蛋白，从蛋白表达上证实盐胁迫对胡杨细胞产生的影响明显地分为渗透胁迫和离子伤害胁迫两种效应。对悬浮培养的胡杨细胞进行NaCL和PEG(6000)胁迫处理，SDS－PAGE分析表明：NaCL和PEG胁迫处理的细胞均明显地表达了28KD和59KD蛋白带，表明28KD和59DK蛋白是与渗透胁迫有关的。66KD和60KD蛋白带仅在高水平盐胁迫细胞中显著表达，应而是与盐胁迫中离子伤害有关的蛋白。进一步证实胡杨细胞中28KD和66KD蛋白带表达受ABA诱导。通过IEF－SDS－PAGE证实，28KD蛋白包含有pI为8.0-9.0的蛋白，渗透胁迫和离子胁迫相关的分离和鉴定为通过蛋白途径克隆与渗透胁迫和离子胁迫相关基因，为深入认识胡杨耐盐机制奠定了基础。 4.通过X－射线细胞微区分析以及与毛白杨细胞比较发现，胡杨细胞对培养介质中高浓度的盐离子具有较强的拒吸作用和一定的忍耐性。胡杨细胞中液泡不具有积聚离子的功能，细胞分室性渗调节作用不明显。胡杨细胞膜对离子进入具有选择功能，表现在培养介质中Na和CL离子进入细胞和由细胞质进入液泡不以等摩尔数形式进行，进入的CL离子比Na离子约高50％，说明了二者通过质膜是由不同机制控制的，是分开进行的，也说明胡杨细胞拒Na离子强于拒CL离子。另外胡杨细胞受到盐胁迫时还表现出比较强的维持细胞内离子平衡的功能。正是由于上述特性，才赋予了胡杨细胞具有较强的耐盐性。 5.利用电子显微镜和光学显微镜中相差和微分干涉等技术，对胡杨细胞和组织结构进行了观察。与毛白杨细胞相比，胡杨细胞中具有较丰富的线粒体和质体，盐胁迫和渗透胁迫均明显地提高了细胞质中线粒体数和质体数，并使质体中内含体增多，细胞质中和液泡内缘出现明显的嗜饿物质。研究还发现，胡杨细胞膜与细胞壁之间呈齿状结合，说明了膜与壁之间结合的牢固性和稳定性，解释了胡杨细胞在胁迫中不易发生质壁分离的原因。胡杨细胞在受到盐或渗透胁迫时，细胞内出现明显的丝状结晚，细胞核变大，核仁明显。在器官和组织结构方面，胡杨根系具有发达的根冠和根内皮层，根毛较多，叶片输导组织不发达等。这些结构的存在与胡杨的抗逆性是密切相关的。文中从形态结构上阐述了胡杨的耐盐碱特性。

水稻(Oryza sativa L. ssp japonica)幼苗根质膜蛋白质组分析

根质膜具有重要的生物学功能，它参与了根响应脱落酸（ABA）的一系列活动。尽管已经有很多有关ABA影响根的生长和发育的报道，但是在蛋白质组水平上研究参与ABA信号转导及相关活动的质膜蛋白质的报道还未见到。我们期望利用蛋白质组学技术平台研究外源ABA胁迫下水稻根质膜与ABA功能相关的蛋白质组的变化。 本论文通过双向电泳（2DE）结合质谱（MALDI-TOF MS 和 MALDI-TOF/TOF MS）分析的方法鉴定了102个质膜相关蛋白质。这些蛋白质功能涉及到跨膜运输（16.2%）、胁迫反应（14.3%）、物质运输（4.8%）、细胞骨架动态变化（5.7%）、细胞壁重建（3.8%）、碳代谢和能量循环（13.3%）、蛋白质代谢（14.3%）、信号转导（18.1%）和其他功能的蛋白质（4.8%），以及未知功能的蛋白质（2.9%）。其中大约30％的蛋白质以同工型的形式存在。在这些鉴定结果中，有10个斑点（代表10种蛋白质）已被报道为质膜特异的蛋白质;68个蛋白质斑点（代表58种蛋白质）是质膜相关蛋白质。其余54个蛋白质斑点（代表42种蛋白质）是首次在水稻根的质膜囊泡中被鉴定出来。 在ABA处理条件下，我们在2DE胶上发现了15个响应ABA调节的蛋白质斑点。9个上调的蛋白质斑点分别代表以下9种蛋白质：vacuolar proton-ATPase A subunit, vacuolar ATPase B subunit、patatin、 Salt-stress root protein RS1、谷氨酰氨合成酶（Glutamine synthetase，GS）、OSR40c1、H+-exporting ATPase （vacuolar ATPase E subunit）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶I型（glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase, type I，GADPH）和醛缩酶C-1（aldolase C-1）。6个下调的蛋白质斑点分别代表4种蛋白质：endosperm lumenal binding protein、remorin protein、富含脯氨酸蛋白质（glycine-rich protein，GRP）和蔗糖合成酶（sucrose synthase, SuSy）。其中，OSR40c1和endosperm lumenal binding protein与蛋白质合成相关，从它们与ABA的关系中可以看出，ABA可能抑制了细胞的蛋白质合成。而vacuolar proton-ATPase A subunit、vacuolar ATPase B subunit和 H+-exporting ATPase参与了细胞质pH的调控，ABA致使了细胞质pH的上升。甘油醛-3-磷酸脱氢酶I型、醛缩酶C-1和蔗糖合酶参与了细胞壁的生长发育，ABA的作用可能导致了细胞壁生长发育的延迟。ABA促使Patatin上升，其作用可能与质膜膜脂的降解有关。而ABA的刺激也使谷氨酰氨合成酶的表达显著上升，谷氨酰氨合成酶可以去除细胞内有害的游离NH+4。同时还有未知功能的富含脯氨酸蛋白质（glycine-rich protein，GRP）同样受到ABA的诱导，但具体的功能及其与ABA的关系还要进一步的实验证据。

油菜素内酯对脯氨酸积累的影响

环境胁迫诱导的脯氨酸积累是植物一种非常显著的代谢适应机制。和其他胁迫应答反应一样，脯氨酸积累也受到各种植物激素和信号分子的调控，如脱落酸、钙离子等。本论文的研究目的在于了解植物激素油菜素内酯（BR）在拟南芥脯氨酸积累中的作用。 首先，我们发现拟南芥经不同浓度的24-表油菜素内酯（EBL）预处理后，200mM NaCl诱导的脯氨酸积累受到不同程度的抑制。同时脯氨酸合成途径的关键基因P5CS1以及OAT的诱导表达减弱，降解途径的关键酶基因PDH1的转录水平有所上调，说明脯氨酸积累程度的降低是相关基因表达的调控的结果。BR缺陷型突变体det2-1和不敏感突变体bin2-1在盐胁迫下的脯氨酸积累均高于野生型，而且det2-1的P5CS1受到的诱导增加，PDH1的表达有所下调。说明BR在脯氨酸积累中起负调控的作用。 经不同浓度的24-EBL处理后，50µM ABA诱导的脯氨酸积累受到明显抑制。det2-1和bin2-1在ABA处理下脯氨酸积累均高于野生型，但是ABA不敏感突变体abi1-1在盐胁迫下的脯氨酸积累并没有受到BR的抑制。说明BR可以特异地抑制由ABA介导的脯氨酸积累，而对不依赖ABA途径介导的脯氨酸积累没有明显影响。但是，BR处理后并没有改变ABA诱导的P5CS1的转录水平。 上述BR对脯氨酸的抑制作用是在短日照（8小时光照）条件下得到的，而在长日照（16小时光照）条件下生长和处理材料时，24-EBL对盐胁迫或ABA诱导的脯氨酸积累都略有促进作用。det2-1和bin2-1中的脯氨酸积累仍比野生型高。由以上的结果推测光照增加可以抑制BR对脯氨酸积累的抑制作用。 我们还对det2-1和bin2-1在生长发育各个时期的盐敏感性进行了初步鉴定。det2-1在种子萌发阶段对盐胁迫和ABA超敏感；在幼苗生长阶段det2-1和bin2-1在长势、存活率、根长以及鲜重方面对盐胁迫都比野生型更敏感，外加24-EBL可以部分恢复det2-1的盐敏感性；成株阶段bin2-1则表现出比野生型明显的抗盐性。这些结果表明BR可能对拟南芥盐响应有重要调节作用。

气体信号分子一氧化氮和乙烯的生物学功能：一氧化氮在植物盐胁迫中的作用和乙烯激活钙离子通道

一氧化氮（NO）是重要的植物信号分子，参与许多植物生理过程。以拟南芥野生型和Atnoa1突变体为材料研究了NO在植物抗盐胁迫中的作用。 T-DNA插入AtNOA1基因的第一个外显子，使Atnoa1突变体中NOS活性大幅度下降，NO释放减少。用不同浓度的NaCl对拟南芥野生型和Atnoa1突变体进行盐胁迫处理后，Atnoa1突变体中Na+离子积累较野生型多，K+离子吸收较野生型少，从而使突变体中的Na+/K+比野生型高，对突变体造成了更大的伤害。Atnoa1突变体种子萌发和幼苗生长对盐胁迫更敏感。盐胁迫处理后，Atnoa1突变体的存活率比野生型低。无论是在正常生长条件下，还是盐胁迫条件下，Atnoa1突变体中的H2O2和TBARS含量都比野生型中高，说明Atnoa1突变体对盐胁迫和氧化胁迫都比野生型更敏感。用NOS抑制剂和NO清除剂处理拟南芥野生型，减少内源NO释放量，使其在盐胁迫条件下的Na+/K+比增高。盐胁迫处理降低了野生型体内的NOS活性，减少了NOA1蛋白的表达，DAF-2DA标记的NO荧光强度减弱。用NO供体SNP处理Atnoa1突变体，可以减少盐胁迫引起的Na+/K+比增加。以上研究结果证明NOS介导的NO合成在植物抗盐胁迫中起重要作用。 乙烯作为一种植物气体激素参与植物生长发育的许多生理生化过程。植物细胞自由钙离子（[Ca2+]c）是重要信号分子，在植物应答外界信号中起非常重要的作用。外界信号通过开启植物细胞质膜的钙离子通道，使得胞外钙离子进入细胞，导致瞬间[Ca2+]c的增加，激活钙依赖型的蛋白和蛋白激酶，从而改变生理生化过程。本研究利用膜片钳和激光共聚焦显微技术，研究了外源乙烯对烟草悬浮细胞质膜Ca2+离子通道和细胞中[Ca2+]c活性的影响。乙烯供体乙烯利和乙烯合成前体ACC能够迅速诱导内向型电流，表明这些处理能开启离子通道。通过离子替代实验和离子通道的药理学分析证实乙烯利和ACC激活了一种对Ba2+, Mg2+和Ca2+等阳离子具有通透性的离子通道，La3+、Gd3+和Al3+抑制该通道的活性。乙烯受体拮抗物（1-MPP）和ACC合成酶抑制剂，能够减弱乙烯利和ACC对这种通道的活化作用，说明乙烯利和ACC是通过乙烯活化此类Ca2+离子通道。用Ca2+敏感的荧光标记物Fluo-3标记，通过激光共聚焦显微观察，发现乙烯利能够诱导烟草悬浮细胞中[Ca2+]c离子浓度的增加，而且Gd3+和BAPTA显著抑制乙烯利诱导的细胞中[Ca2+]c离子的增加。说明外源Ca2+离子通过质膜上被激活的Ca2+离子通道进入细胞，使细胞中[Ca2+]c离子浓度增加。以上结果说明，乙烯活化质膜上的Ca2+离子通道，使细胞外Ca2+离子进入细胞，导致细胞中[Ca2+]c离子浓度增加，是乙烯信号转导途径的重要步骤。

长期驯化环境下丁香属植物的光合生理生态学研究

本研究是在丁香属植物半个世纪的丰富引种基础上，采用光合生理的实验手段探讨该属重要物种长期驯化中的环境响应机制。 在迁地条件下，与广布种华北紫丁香相比， 濒危种羽叶丁香有较低的光需求，在中等光强下净光合速率显著低于广布种;气孔限制值较大，对光合作用的调节较弱;蒸腾作用亦较弱，导致中午叶温较高造成叶片伤害。功能叶片的净光合速率在8:00光强及气温较低时已达峰值，叶片生长历时短暂并于初夏前结束，长此以往可能影响光合产物积累。可见羽叶丁香以“逃避”的方式适应迁入地生长季节环境胁迫。 为了探究羽叶丁香在引种地“逃避”策略的环境驱动因子，我们分别选取种植在园内全光照曝晒和60% 遮荫、生物量差异极为显著，而其它条件相同的羽叶丁香开展实验。尽管曝晒单株比遮荫单株有着显著低下的生物量，但最大量子效率及叶绿素a/b的结果都表明曝晒并未对其PSⅡ及LHCⅡ造成损伤。遮荫单株也已经由高叶绿素含量表现出对低光环境的适应。可见，其光适应机制已经存在，而引种地生长季节的高温可能是羽叶丁香生长中要回避的主要因子。 为了进一步证实这个推断，并希望了解羽叶丁香在原产地的环境响应状况和致濒的生理原因，我们在其原产地贺兰山对该种进行了调查和试验。调查发现在贺兰山羽叶丁香分布在海拔1700m、西北坡向、近谷底处。由于坡度较缓，晴朗天气光照时数达8h，叶片厚重，净光合速率极显著地高于引种地;最大量子效率表明中午的强光并未带来严重光抑制，且小幅度的光抑制在次日清晨可完全恢复，并且有较高的实际量子效率。故在原产地强光仍旧不是其生长的限制因子;其极高的光合速率及高效的实际量子效率是对冷凉强光条件的特殊适应，说明羽叶丁香具有喜冷凉不惧光的固有特点，而冷凉条件于高温炎热的引种地不能得到满足时，便放弃了对光的要求而在遮荫的生境中适应下来。因此引种地的高温应该是其要“逃避”的重要因子。同时表明较强的光合能力及强光的适应特征不会使羽叶丁香在原产地成为濒危物种。 为了搞清羽叶丁香的濒危原因，我们将原产地野外分布状况连同两地水分利用效率棕合分析发现：在水分保证适当的北京植物园栽培条件下，即使是曝晒的植株也有着较高的水分利用效率，而原产地的羽叶丁香低下的水分利用效率表明其生存和分布对水分条件极为敏感。因此，羽叶丁香是良好水分条件的“享受者”，而不是干旱条件的“耐受者”，而这对于生长在干旱半干旱地区的物种来说在一定程度上限制了其散布的可能性，以致数量极为有限。 “全能” 的华北紫丁香恰是丁香属系统演化中较为进化的种，而“低能” 的羽叶丁香又恰是居于顶生花序系（原始）与欧丁香系（进化）之间的重要过渡种。在对丁香属起源及散布进行推断的基础上，这些已经得到的结果促使我们从区系和演化的层面去了解演化系在长期迁地驯化的光合生理差异。结果发现演化过渡种羽叶丁香的光合指征也多处于中间位置;顶生花序系（原始）种类光合效能相对较低，较强的水分平衡的保持能力可能成为它们能在跨气候带引种中成活的解释。欧丁香系（进化）种类气孔导度对光梯度反应敏感，但较强的蒸腾降低了其水分利用效率，在引种地干旱高温的生长季会因水分不能及时供给而可能在年周期尺度上直接影响生物量。小乔木型的种类可能由于较高的水分利用效率而不畏干旱，形成了拟女真亚组从西北到东北继而向日本的广泛分布。 驯化的现实意义之一是应用。丁香的盐碱耐受性是区域栽培中面对的问题。我们模拟氯化物硫酸盐型盐碱土（NaCl - MgSO4）与光照梯度交互的试验结果表明紫丁香系品种曝晒栽植能耐受0.2% 的土壤盐度，如果在相同盐度生境中遮荫种植会有更高的盐分耐受表现。 对迁地物种环境适应性的研究论证着眼点从“种” 的水平归结到“系”的层次，从对特殊代表物种当今适应机制的量化比较联系到其起源和散布的历史发展，在一定程度上超越了常规引种驯化对现存实体“种” 的定性描述;将迁地驯化与就地适应相联系，以较为科学的思路贯穿驯化保护研究，并最终将研究结果回归于驯化保护实践。