牛耳草Bose hygrometrica 离体叶脱水-复水过程的光合作用及基因表达

本文以复苏植物牛耳草Boea hygrometrica成熟植株的离体叶片为试材，对比非复苏植物烟叶唇苣苔Chirita heterotricha, 以光合作用在脱水－复水过程中的变化为切入点，从生理水平上探讨其脱水保护位点：应用mRNA差异显示技术，从分子水平上探讨其脱水保护机制。 光合放氧速率、快速荧光诱导动力学、慢速荧光诱导动力学、荧光发射光谱、荧光激发谱的结果表明，相对于烟叶唇柱苣苔，脱水对牛耳草净光合速率、PS II和PS I光化学活性、电子传递、光合磷酸化及CO_2固定的影响有一个共同的特点，即脱水时迅速降低，复水后恢复能力强。通过非变性绿胶的研究牛耳草叶片类囊体膜叶绿素－蛋白复合体在脱水－复水过程中保持高度稳定。色素含量分析表明牛耳草的叶绿素含量在脱水－复水过程中也相对稳定。这些特征可能是牛耳草叶片光合作用脱水保护机制的一部分。 SDS－PAGE和IEF电泳结果表明，牛耳草脱水复苏过程中蛋白质表达有差异，或增或减，并分别发现了一条（SDS－PAGE）和两条（IEF）在脱水过程中特异出现的蛋白质。 本文以银染法代替放射自显影用于mRNA差异显示，不但简化了实验步骤，缩短了实验周期，而且在不降低灵敏度的前提下避免了放射性危害，降低了实验成本。本文证明了mRNA差异银染显示法用于复苏植物牛耳草脱水－复水过程中基因表达变化的研究是可行的。 mRNA差异银染显示法揭示牛耳草耐脱水复苏机制涉及到基因表达的调控。脱水－复水过程中差异表达的基因有6种，其中脱水特异诱导表达的13个cDNA所相应的基因、脱水上调节的15个cDNA所相应的基因可能参与牛耳草叶片脱水保护机制，复水特异诱导的8个cDNA的所相应基因可能参与牛耳草复水后的修复机制。2个脱水特异诱导表达的cDNA片段进行了克隆和测序。

牛耳草光合作用的脱水保护和复苏机理

本文以复苏植物牛耳草成熟植株的离体叶片为实验材料，以光合作用、蔗糖、抗氧化剂系统和离子渗漏等在脱水复苏过程中的变化为切入点，从生理生化水平上探讨其耐脱水复苏的机制;同时应用mRNA差异显示技术，从分子水平上探讨其耐脱水复苏的机制。 牛耳草叶片光系统II光化学活性参数和叶黄素循环色素在脱水复苏过程中的变化结果表明，极微弱光强（3μmol.m-2.s-1）下，脱水8天的牛耳草叶片诱导了叶黄素循环，叶黄素循环可能介导了牛耳草叶片脱水过程中的光保护作用。 利用不同浓度的磷酸盐溶液处理牛耳草叶片的结果表明，0.1mol/L以上的磷酸盐溶液对牛耳草叶片具有损伤作用，极大的影响了其光系统II的光化学活性，使得牛耳草叶片在脱水后不能很好的复苏。 牛耳草叶片在脱水复苏过程中，抗坏血酸（AsA）、还原型谷胱甘肽（GSH）和蔗糖含量在脱水时很快增加，复苏时又迅速恢复到原来水平，表明它们可能对脱水的牛耳草叶片具有保护作用，但对复苏的牛耳草叶片可能不重要;其离子渗漏情况表明质膜结构的完整性和稳定性在脱水复苏过程中能得到很好的保持，这可能是其耐脱水复苏的重要机制之一。 利用mRNA差异显示技术分离到牛耳草叶片脱水过程中一些脱水和磷酸盐特异诱导表达的cDNA。对其中5个脱水特异诱导表达和3个磷酸盐特异诱导表达的cDNA进行克隆测序、同源性探测和Northern 杂交检测表明，牛耳草脱水过程中诱导表达的基因可能涉及到脱水胁迫的信号转导、调节基因的级联和结构基因产物调节细胞结构在脱水胁迫中的稳定性等。

复苏植物牛耳草干旱诱导的ACC氧化酶及乙烯调控的引导蛋白基因的克隆、表达与功能分析

本文以耐旱的牛耳草(Boea hygrometirica)为材料，研究了乙烯合成关键酶之一——ACC氧化酶编码基因（BhACO1）在干旱复苏过程中的诱导表达及其编码蛋白的酶活，分析了乙烯在干旱复苏过程中的积累及其对叶片复苏能力的影响和对干旱诱导基因的调控，探讨了一个受乙烯调控的干旱诱导的引导蛋白编码基因（BhDIR1）的表达及其功能。 利用cDNA微阵列技术从牛耳草干旱2h的叶片中得到一个ACC氧化酶基因片段，经5’-RACE得到全长cDNA，命名为BhACO1。BhACO1包含317个氨基酸，与其它植物中的ACC氧化酶具有80%左右的序列相似性。BhACO1基因受乙烯和干旱诱导、但ACC氧化酶抑制剂氯化钴可抑制其干旱诱导表达。BhACO1基因受ABA、2,4-D、SA、H2O2、CaCl2、EGTA及热害和盐害的诱导，但不受冷害诱导。原核表达的GST-BhACO1融合蛋白在体内体外均表现出ACC氧化酶的活性，而过量表达BhACO1的转基因植物的蛋白提取物也表现出较野生型更强的ACC氧化酶活性。 乙烯在牛耳草叶片干旱复水过程中随着时间延长而逐步积累。外源乙烯可诱导叶片黄化，但不影响叶片在复水后的复苏能力;氯化钴处理可部分地抑制乙烯合成而降低牛耳草叶片在干旱过程中乙烯的释放量，同时导致叶片失去复苏能力。与对照相比，氯化钴处理的叶片在干旱时仍可维持较低的离子渗漏水平，但复水后发生大量离子外渗，表明细胞膜完整性也遭到破坏;光系统ІІ活性下降程度在干旱时与对照相似，但复水后完全丧失。 乙烯诱导牛耳草干旱响应基因BhDohb561，BhLEA2和BhDIR1的表达，但不影响牛耳草干旱响应基因BhCML1，BhGRP1，BhSGP和BhLEA1的表达。除BhLEA1外，上述基因在干旱过程中的诱导表达均可被氯化钴预处理所抑制，尤其是BhSGP最明显。 BhDIR1在牛耳草干旱复水过程中mRNA明显地积累，乙烯、ABA、CaCl2、EGTA、H2O2、SA和热害、冷害、盐害都可诱导其表达。BhDIR1编码一个199个氨基酸的小分子量蛋白质，与松柏等植物中发现的可能参与木质素合成的引导蛋白具有约20-30%的序列相似性。与其它引导蛋白相同，BhDIR1在N’端包含一个外泌的信号肽，GFP定位分析表明BhDIR1定位于细胞膜和壁上。 上述结果表明，乙烯在牛耳草叶片耐脱水复苏反应中有不可或缺的作用，而ACC氧化酶所催化的反应是干旱诱导的乙烯合成中的关键步骤。氯化钴预处理通过抑制干旱过程中的乙烯合成，影响一系列基因的干旱诱导表达导致叶片在生理水平和细胞水平上造成了损伤，或是使牛耳草失去了在复水过程中原有的修复能力而无法恢复生命力。BhDIR1作为乙烯调控的下游靶基因之一，可能通过调控木质素的单体间的连接方式而改变木质素的物理性质来影响细胞壁的机械强度和柔韧性，减少干旱对细胞造成的机械伤害。

复苏植物牛耳草Boea hygrometrica耐旱复苏过程中LEA基因表达调控及功能研究

本实验室以复苏被子植物旋蒴苣苔（Boea hygrometrica (Bunge) R Br，牛耳草）为实验材料，利用cDNA微阵列技术，筛选到2个LEA蛋白的cDNA片段。它们在干旱条件下表达水平增加一倍以上。在上述基础上，通过5’-RACE的方法扩增得到这两个LEA基因的全长cDNA，BhLEA1和BhLEA2，发现二者编码蛋白均与玄参科复苏植物Craterostigma plantagineum中的第4组LEA蛋白pcCC2具有最高的同源性。PCR扩增得到的基因组序列中发现BhLEA1和BhLEA2在靠近5’端处各有一内含子，分别为97和171bp。利用tail-PCR和inverse-PCR扩增得到BhLEA2的1215bp的启动子序列，其中含ABRE、W-box、HDEs、MYB、MYC、和生长素响应元件等。两个基因在不同胁迫、激素等处理下都有诱导表达。构建过量表达载体, 转化烟草。筛选T2代的纯合体植株进行抗旱试验，测定了干旱过程中的土壤和叶片含水量，PSⅡ最大光化学效率Fv/Fm、SOD和POD酶的活性及蛋白质降解程度，发现BhLEA1和BhLEA2过量表达的烟草抗旱性有明显提高，与野生型相比，叶片含水量和光系统Ⅱ活性下降慢、SOD和POD活性增高、蛋白质降解减少。Western blot检测发现在干旱时，野生型烟草的RbcL、LHCⅡ和PsBO蛋白明显降解，而转基因植物的几乎没有降解，或者降解较少，说明BhLEA的过量表达可以在一定程度上抑制干旱诱导的蛋白质降解。这些结果表明，BhLEA基因可能直接或间接地在牛耳草干旱过程中参与了保护蛋白质的作用，为牛耳草叶片的复苏提供了基础。

复苏植物牛耳草Boea hygrometrica干旱诱导基因的筛选和功能分析

干旱对植物的影响和植物对干旱的反应是十分复杂的，涉及到植物的各种生理活动，由胁迫强度及时间、植物本身的遗传特性、发育阶段和生理状况以及其他环境因子共同决定。现代分子生物学和生物技术的发展深化了对植物逆境反应的研究，对植物抗旱分子反应的研究成为这个领域的热点，也引发了抗逆基因资源的争夺战。 以拟南芥等植物为实验材料的研究对深入了解植物对干旱胁迫感知和反应机制提供了重要信息, 但对植物抗旱机制的了解仍然十分匮乏。其中， 限制人们对抗旱机制深入了解的一个重要因素就是植物抗旱机制的复杂性和多样性，这种抗旱机制的复杂性决定了不是所有的机制都可通过拟南芥等植物来加以揭示。因此利用特殊生境植物来研究相关基因的表达对揭示植物对环境适应机制有着极为重要的价值。 我们实验室以复苏被子植物旋蒴苣苔（Boea hygrometrica (Bunge) R Br.，牛耳草）为实验材料，开展了多方面的工作，以期从复苏植物的角度加深人们对抗旱机制的了解。目前我们实验室已成功地建立了利用cDNA微阵列技术研究牛耳草基因表达谱的体系，并比较了4562个cDNA克隆在干旱前后的表达差异, 发现434个cDNA在干旱条件下表达水平增加一倍以上。 本工作是在上述工作的基础上，对这些表达差异的cDNA克隆并测序，利用Northern blot进一步验证这些基因。序列分析表明，这434个cDNA片段实际上代表着42个基因。根据序列同源性分析表明其中36个克隆与已知功能的基因具有同源性，它们分别是细胞壁相关基因、LEA基因和糖类、抗氧化酶类的编码基因等。另外，4个克隆未能找到同源序列，这可能意味着它们是一些新基因；2个克隆虽找到同源基因但功能未知。36个克隆中有3个编码的是细胞壁相关基因，它们在干旱早期就被诱导，而编码LEA蛋白的基因在干旱中期或后期大量诱导，这说明牛耳草耐旱反应的启动是程序化的，随干旱时间的延长和程度的加强，一步步地启动相应的基因来发挥作用，多方面地对植物细胞进行保护和修复。 本实验室的前期工作表明牛耳草脱水复水过程中细胞超微结构分发生了明显变化，其中细胞壁脱水时发生折叠复水时恢复原状。鉴于细胞壁如此显著的变化及其重要作用，我们以两个细胞壁相关的基因BhGRP1和BhGLP1为对象，对其表达的时间空间特点和对不同胁迫信号的应答、编码产物的理化性质、过量表达或抑制表达的转基因植物的表现型及转基因植物对不同逆境胁迫的抗/感性状等方面的进行研究，综合分析其在耐旱反应中可能参与的代谢途径或信号途径，以期为揭示牛耳草耐旱复苏机制提供有力的佐证。 我们利用Northern blot和半定量RT-PCR对两基因进行了表达模式分析，发现BhGRP1在干旱早期被诱导，干旱后期其转录本水平下降。而BhGLP1在早期诱导后一直保持高的表达。两者在不同胁迫、激素等处理下都有不同的响应。经PSORT分析两基因编码的蛋白都具有N-端信号肽，意味着两蛋白定位于胞外基质。构建BhGRP1-GFP和BhGLP1-GFP融合蛋白进行亚细胞定位分析，质壁分离后BhGRP1-GFP的信号仅保留在细胞壁，而BhGLP1-GFP则在胞壁胞膜上都存在。过量表达BhGRP1后发现它能赋予植物更强的耐旱复苏能力及机械强度，而抑制GLP表达的植株的抗旱性明显弱于野生型，表明BhGRP1和BhGLP1与牛耳草的耐旱复苏有密切的关系。