光敏核不育水稻41 kDa和61 kDa蛋白质的发现、N-端序列分析及其雄性不育性状关系的探讨

光敏核不育水稻农垦58S是石明松于1973年在晚粳农垦58的大田中发现的雄性不育突变体，它在长日照下雄性不育可被用于与恢复系杂交生产杂种，而在短日照下雄性可育能用于自交繁殖，它的恢复系来源广泛。基于这些特性，育种学家用光敏核不育水稻建立的二系杂交水稻制种技术有很大的应用潜力。近十几年来，育种学家用农垦58S作基因供体转育了许多新的不育系，研究结果表明育成的粳型不育系均为光敏不育系，但在育成的籼型不育系中，绝大多数丧失光敏核不育特性，变成温敏不育系。目前因不知光敏核不育的分子遗传机制，尚不能解释这些问题。 本文用双向电泳技术分析了农垦58S和农垦58苗期和育性转换光敏感期叶绿体蛋白质的差异，在农垦58S中发现三个蛋白质(Pl，P2和P3)，其中Pl和P2在苗期和光敏感期叶片内均存在，P3仅在光敏感期的叶片中存在，它们不受长日照或短日照处理的影响。农垦58没有这三个蛋白质。 用制备型双向电泳纯化后，得到SDS - PAGE和IEF纯的Pl和P2。经SDS-PAGE和IEF测定，Pl的等电点是6.2，分子量是41 kDa;P2的等电点是5.8，分子量是61 kDa。现称Pl为P41，P2为P61。氨基酸序列分析和同源性检索发现P41与水稻叶绿体ATP合成酶p亚基和酵母转录因子CAD1有同源性，此外，P41的N-端序列中有一个与蛋白激酶催化核心中的多功能motif Y-G-X-G-X- (P/T)-G-V相似的序列;P61的14个氨基酸长的N-端序列与水稻叶绿体ATP合成酶β亚基的一致。P41和P61 N-端前12个氨基酸的序列也完全一致。 PCR扩增和Southern杂交分析没有发现农垦58S和农垦58之间ATP合成酶β亚基基因(atpB)的多态性。Nothern杂交分析表明农垦58S中仅有一种、与农垦58 atpB mRNA分子量相同的atpB转录产物，但它的atpB mRNA丰度明显低于农垦58的。没有检测到突变的atpB和其它形式的atpB转录产物。 分析P41和P61在其它水稻材料中的分布特点发现它们在粳型光敏不育系7001S、5088S、31301S、C407S和1647S，籼型光敏不育系W7415S和W9451S以及温（光）敏不育系培矮64S中存在，而在对照材料三系水稻马协A、珍汕97A、马协B、珍汕97B和明恢63以及常规粳稻C94153中不存在。根据这些不育系的系谱和它们与农垦58S之间基因的等位性研究结果，讨论了P41和P61与光敏核不育性的可能联系。

晚粳水稻生长点在光周期反应中的地位

光敏核不育水稻晚粳农垦58S具有长日下不育，短日照下可育的特点。为了确定突变体NK58S突变基因的作用器官及功能。我们设计了一系列光周期处理实验，并对不同光周期处理的生长点或幼穗进行细胞学及细胞化学观察，同时选择光调节基因对其在NK58S上表达特性进行分析。材料选用突变体NK58S，及其野生型NK58S，和它的回复突变体NK58Sr，加两个籼稻品种W6154S及珍汕97，共设计十三个不同的光周期处理。根据试验分析我们发现： 第一，温度对结实率的影响，NK58S，NK58及NK58Sr表现一致，没有发现对NK58S有特异作用的温度效应。三个粳稻品种均因幼穗分化前的长日处理延迟抽穗，而使各处理粳稻品种处于不同环境条件下，引起结实率的变化。 第二，温度对花粉育性的影响较对结实率的影响小。因而用花粉育性进行不育材料的鉴定和比较较可靠。 第三，光周期处理引起生长点原套及原体组织的一定的细胞学变化，但三个粳稻品种间没有差异。生长点周围及其下节部的淀粉积累的变化，三个粳稻品种一致，没有发现不育与可育材料之间的差异。一直处于长日处理条件下的三个粳稻材料，表现出NK58S突变体生长点周围及节部淀粉积累少于NK58，和NK58Sr。 第四，就总RNA而言，三个粳稻品种在光周期处理下各样品绝对量不同，但不同光周期处理，三个粳稻品种反应一致。不同发育时期叶片内光调节基因表达丰度与总RNA水平不一致，不同基因表现出因不同发育阶段而不同的转录特点。在所选三个光调节基因的Northern印迹分析结果没有发现三个晚粳稻品种之间的差异。 第五，幼穗分化开始后的光周期反应不是农垦58S的花粉育性所特有，对NK58，及NK58Sr也有作用。光周期处理还会影响幼穗其它方面的发育。短日处理下农垦58S的育性恢复也只有农垦58的一半。 总之，我们的试验结果使我们得出光周期作用产生的信息在植物不同发育阶段一致。不同发育时期的生长点对来自该信息的作用产生不同的反应。光敏核不育的突变表型体现在生长点的变化上。突变基因的功能是感受来自不同环境因素所产生的胁迫作用。

长日光周期对水稻幼穗发育的影响及其对光敏核不育水稻育性转换的作用研究

光敏核不育水稻晚粳农垦58S具有长日照下不育、短日照下可育的特点，是目前二系法杂交水稻应用的基础。对于其长日光周期引起雄性败育的特性已得到很多实验的支持，但这种光周期反应特性是光敏不育材料所特有，还是在水稻穗发育中普遍存在，目前尚不清楚。对这一问题的认识涉及到对光敏不育性本质的了解及对这一性状的有效利用，本文对此进行了系统的研究分析。 本研究以24种水稻品种包括光敏核不育系及常规水稻品种为材料，在控制光周期下进行。即利用16h长日照处理(LD)和l0h短日照处理(SD)及其不同组合，以抽穗期、叶龄、抽穗叶片总数、花粉育性、结实率、穗长、穗粒密度为指标，结合光敏不育系幼穗发育的形态解剖学特征，探讨了在整个水稻发育中包括叶片生长、幼穗分化以及穗发育等过程中，不同材料的光周期反应特征，尤其是二次枝梗期后的穗发育过程中的光周期反应特征。此外还分析了温度与光周期反应的关系及温度在光敏不育现象中的作用，并研究了代谢抑制剂对光敏不育特征的影响。 研究表明，光周期对水稻的出叶速度基本没有影响，但对水稻的抽穗叶龄有影响，长日照使抽穗叶龄增加而延迟其穗分化及抽穗。光周期还对幼穗分化后的穗发育过程有抑制延迟，作用，影响大小因品种而异，以对早稻、籼稻的影响最弱，对晚稻、粳稻的影响最强，与其穗分化中的感光性有明显的相关性。 除对抽穗期有影响外，穗发育阶段的长日光周期还影响着穗发育的其它性状，如使穗长增加，芒较长、稳粒密度降低，花粉育性降低，结实率下降。此外植株发育的其它性状也可受到影响，如剑叶发育不良表现为叶片缺少仅有叶鞘、倒二叶生长旺盛、植株较高等。同时几组不同组合的光周期处理结果均表明，长日光周期对水稻穗发育的影响主要发生在穗发育的前5-10天即颖花原基分化期、雌雄蕊原基分化期至花粉母细胞形成期。这些结果表明水稻的光周期反应不仅表现在茎端从营养生长向生殖生长的转换上（幼穗分化），而且还表现在幼穗分化完成后的穗发育过程中。长日光周期对晚稻穗发育均有抑制效应，且日长对稳发育的影响时期与光敏核不育水稻的‘育性转换敏感期’完全一致。因此在农垦58S中引起‘光敏不育’的原因很可能不是一种特殊的光周期反应，而是该材料雄性器官发生过程不能对长日光周期做出适当的反应。 对24种不同品种水稻的光周期反应表明，不同材料光周期反应特性不同。光敏不育系农垦58S与农垦58在对长日照的反应上也有较大不同，表现为前者在短日照下穗分化较快，在自然日照下抽穗较早。这表明除了育性不同外，农垦58S与农垦58在光周期反应特征上也有所不同，然而我们认为这种不同不是农垦58S表现光敏不育的主要原因。因为本研究中还发现，光敏不育系农垦58S与其可育回复突变体农垦58S(r)在抽穗期等光周期反应特征上相当一致，但在育性反应上却有较大不同，长日照下农垦58S(r)表现为雄性可育，而农垦58S表现为雄性败育。根据上述几方面的比较，我们认为光敏不育的机制很可能在于农垦58S突变体其雄性器官发育对环境不利信号的反应能力的变弱所致。 在本研究中发现，温度对水稻穗发育的影响表现在两个方面：一方面是通过影响光周期反应强弱而起作用，如高温可加强短日照下的穗分化和发育过程，高温亦可加强长日照对穗分化发育的抑制作用;另一方面是直接对器官发生过程产生影响，如在对短日照下光敏不育系和常规稻不同温度条件下处理时的结实率比较分析发现，常规稻的结实率与其抽穗扬花期的平均温度显著负相关，而光敏核不育水稻的结实率虽与抽穗扬花期的温度有一定相关性，但更与穗发育期的平均温度呈显著负相关，二者在受温度影响的作用时期上有显著差异，因此温度也可直接对雄性器官发育起作用。区分温度对光敏不育的两方面影响，同时考虑到光敏不育机制更有可能在于光敏不育系农垦58S雄性器官发育对环境信号反应能力的变弱的假设。我们就可以较好地理解农垦58S‘光敏不育’性状经杂交转育到对光周期弱感的籼稻中所出现的‘温敏不育性’。 核酸代谢抑制剂5-FU，2-TU对SD下的幼穗分化有较强抑制作用，使幼穗分化被迟滞，而2-BrDU和蛋白质合成抑制剂CHX、CL对其影响较小。抑制剂处理也不能诱导LD下的穗分化。 短日照下，5-FU可对穗发育有强烈抑制作用，可使常规品种农垦58及光敏不育系农垦58S穗畸形，颖花减少并发育不良，穗长缩短，枝梗减少，花粉败育甚至无花粉，结实率显著降低，其有效作用时期为穗发育的二次枝梗分化期至雌雄蕊原基分化期，与长日照诱导农垦58S败育的作用时期也完全吻合，5-FU对SD下穗发育的影响还可被核酸抑制剂的恢复剂乳清酸所部分恢复。其它代谢抑制剂如2-TU、CHX、CL等也可使农垦58S育性明显降饭，而所有这些抑制剂对常规可育的农垦58及农垦58S(r)的育性影响较小，表明它们与光敏不育系对抑制信号的反应能力有显著不同。 长日照下5-FU对LD下的农垦58S的幼穗发育也有很强的抑制作用，使稳长缩短，颖数减少，但它还可使部分LD下处理植株抽穗期较LD对照明显提前，并可使农垦58S育性部分恢复而有结实，说明5-FU还可对LD的抑制作用有抑制，通过对LD抑制作用的抑制使LD下的育性转换有部分恢复。其它代谢抑制剂在穗发育前期处理LD下农垦58S叶片均可看到植株在抽穗期较LD下提前5—8天的同时，其花粉育性有不同程度的提高，在高温长日下甚至有一定程度的结实率，表明各种抑制剂均可对穗发育中的光周期作用产生影响。 总之，本研究结果表明，短日植物水稻的光周期反应不仅存在于幼穗分化上，还存在于幼穗发育和花器官发生等发育过程中。幼穗发育的光周期效应表现为抽穗期、穗长、穗粒密度、结实率等多方面的变化，作用时期以穗发育早期的花器官发生阶段影响最大。作用强弱因品种不同而异，以粳稻和晚稻中作用较强。光敏不育突变的更主要变化可能在于农垦58S的雄性器官分化发育时对环境不利信号的反应能力变弱，导致其正常发育受阻，育性不能正常表达。温度在水稻穗发育上既可通过影响光周期反应而起作用，还可直接对穗器官发育产生影响而对育性表达起作用。此外我们还发现农垦58S与农垦58不仅在雄性育性上有显著不同，而且其光周期反应特性也有较大的差异。抑制剂处理结果也支持光敏不育系农垦58S的雄性器官发生过程较农垦58更易受抑制剂影响而育性降低，而抑制剂对长日光周期抑制作用的部分解除，可以使其育性有一定程度的恢复，也表明光周期对雄性育性的影响最为显著。这些结果可以帮助我们更加全面地认识光敏不育水稻的基本特性，从而为进一步开展光敏不育的转育及应用研究提供可靠的科学依据。

光敏核不育水稻叶片蛋白质的双向电泳分析及苗期的光周期反应

光敏核不育水稻农垦58S由晚粳农垦58突变形成。具有在适宜温度条件下，长日照诱导雄性不育、短日照诱导雄性可育的基本特性。光敏核不育水稻育性转换机理的阐明是两系法杂交稻技术的关键。 1.克隆光敏不育基因是研究光敏核不育水稻育性转换机理的一个重要方面，本文对通过反映农垦58S和农垦58遗传背景差异的蛋白质或受光周期调节的蛋白质实现克隆光敏不育基因的策略进行了可行性研究，得到以下结果： (1).利用双向电泳技术在光敏核不育水稻是58S叶片中发现一个不存在于农垦58的蛋白质，其分子量为59.8kDa，等电点pH为5.9（称为Pa），该蛋白的存在不受光照条件、发育时期的影响，反映出农垦58S与农垦58遗传背景的差异。 (2).Pa蛋白与农垦58S叶绿体P61蛋白具有相同的分子量、等电点和N－端氨基酸顺序，在不同品种水稻中具有相同的分布，因此它们很可能是同一个蛋白质分子。 (3).利用双向电泳技术发现P61(Pa)和P41蛋白不仅存在于光敏不育系中，也存在于常规可育粳稻中，与光敏不育性状没有平行关系。 (4).利用双向电脉技术发现10天14小时长日照能在农垦58S和农垦58中诱导一个分子量为36kDa、等电点pH为5.2的蛋白质（称为P_b)，该蛋白的表达受光敏色素的调控。因此P61（Pa）、P41及P_b蛋白均与光敏不育性状无直接关系，推测克隆这些蛋白的基因无法直接获得光敏不育基因。 2.在育性转换光周期敏感期已经发现长日照使农垦58S叶绿体发育不良，但在苗期光周期敏感期内，目前尚不知长日照是否会有同样的效应。本文以光周期对农垦58S苗期叶绿体发育的影响为主要内容，研究了农垦58S苗期的光周期反应，得到以下结果： (1).农垦58S从5叶龄期至6叶龄期开始对光周期敏感，短日照开始能诱导茎尖分化幼穗。 (2).不同的光周期对农垦58S 4叶龄期新展叶片叶绿体发育的影响无明显差异，叶结体结构与功能均表现正常。 (3).不同的光周期对农垦58S 6叶龄期新展叶片叶绿体发育的影响有明显差异。与短日照相比，长日照引起农垦58S部分叶绿体发育不良，导致光化学活性减弱、超分子结构异常。长日光周期对农垦58S叶绿体发育的不良效应可能是光周期敏感期内存在的一种特殊现象。

光敏核不育水稻中光敏色素的分析

本文报道了在育性转换敏感期光周期处理对光敏核不育水稻（农垦58S）及农垦58最新全展叶中光敏色素Ⅰ(PhyA)水平的影响PartI）．在10个光周期处理的最后一个暗期结束前,收获每株水稻的最上部二叶。PhyA用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定。 结果表明：0.5%(v／v)聚乙烯亚胺(PEI)可除去水稻叶片粗提液中干扰ELISA的物质;所用的ELISA专一性地检测水稻PhyA。和长日照(LD)处理相比，短日照(SU)处理导致农垦58S中PhyA的相对含量增加38.5%;而农垦58只增加18.5%。显然，在较长的暗期条件下（SD），农垦58S中PhyA的合成比农垦58快。SD处理下大量增加的PhyA可能和农垦58S的育性恢复有关。 上述结果也说明：在同一品种甚至不同品种的植株间，PhyA水平均易受光周期影响而剧烈变化。 为了进一步验证农垦58S中PhyA较快积累的推论，比较了农垦58s和农垦58幼苗（三叶期）在一延长暗期(24h)中PhyA的积累时程。和育性转换敏感期的植株相似，农垦58S幼苗中PhyA积累速度快于农垦58。在暗期开始6h后，这种差异更明显。这一结果证实了过去的假设：甲基化水平低的农垦58PhyA基因可能比农垦58PhyA基因更活跃地表达。 PhyA和PhyB同时存在于水稻叶片中。为了探讨PhyB是否参与农垦58S雄性不育的调节，在育性转换敏感期每日光期结束、暗期开始开始前进行短暂的FR照射实验(即end-of- dayFR irradiations)。EOD FR反应应由PhyB介导。和SD下的对照相比，经过10次EODFR处理(EOD FR+SD)的农垦58S植株抽穗和开花期都相应地推迟2天，而花粉败育率和种子结实率都没有变化。 EODFR处理抑制了农垦58的开花，但花粉育性几乎不受影响。 综上所述，可能是PhyA而不是PhyB参与调节农垦58S的雄性不育。 另外，本文采用免疫印迹(Immunoblotting or Western blotting)比较了农垦58S和农垦58黄化苗(3天龄)中PhyA的相对含量(PartⅡ)。 结果表明，RPA可以专一性地检测两品种中120KD多肽。该肽在照射R或FR后对内源蛋白酶水解的敏感性不同，照射FR后，该肽易降解产生116KD的片段;照射R后，相对较稳定。因此，上述120KD多肽是水稻PhyA。未观察到农垦58S和农垦58的PhyA在免疫原性、分子量及内源蛋白酶解水解带型有差异。定量分析表明农垦58s黄化苗中PhyA的相对含量比农垦58多40%。这一结果和上述光周期处理的结果是相辅相成的。由于干种子、以及吸涨36h以前的水稻胚中均检测不PhyA的存在，因此两品种间PhyA含量的差异是PhyA蛋白重新合成的结果。 活体低温(80K)荧光光谱分析表明：农垦58黄化苗（3天龄）具有典型光敏色素(主要为PhyA）的荧光发射，其最大波长为683.8nm，而农垦58S以及由其转育来的培矮64s都缺少明显的光敏色素峰。显然，农垦58S和农垦58的PhyA荧光光谱特性有所不同。这一差异是否和雄性不育有关仍待深入研究。 本文第三部分比较了农垦58S和农垦58黄化苗（6天龄）最初转到白光下(4h)合成叶绿素的情况。无论是短暂红光(R)处理或对照，农垦58幼苗合成叶绿素的量（在白光下4h）都多于农垦58S。由于R促进叶绿素合成的效果可被随后的远红光照射(FR)逆转，因此水稻幼苗中叶绿素合成是在光敏色素的控制下。FR逆转性在农垦58S中似乎更完全。连续FR（12h最有效）促进叶绿素合成的效果在农垦58S中更明显，但叶绿素合成的量（在白光下4h）仍是农垦58多。然而，对于自然光周期下生长的幼苗（2-4叶期），农垦58S的叶绿素含量明显高于农垦58。文中讨论了这种差异的可能原因。

Discovery of a male-biased mutant family and identification of a male-specific SCAR marker in gynogenetic gibel carp Carassius auratus gibelio

Gibel carp ( Carassius auratus gibelio) is a uniquely gynogenetic species with a minor ratio of males in natural habitats, but its male origin and sex determination mechanisms have been unknown. In this study, a male-biased mutant family was discovered from the gynogenetic gibel carp, and a male-specific SCAR marker was identified from the mutant family. Normal spermatogenesis was observed in the male testes by immuno. fluorescence histochemistry. Nearly identical AFLP profiles were observed between males and females, but a male-specific 86 bp AFLP fragment was screened by sex-pool bulked segregant analysis and individual screening. Based on the male-specific AFLP fragment, a total of 579 bp sequences were cloned by genome walking. Subsequently, a male-specific SCAR marker was designed, and the male-specific DNA fragment was confirmed to be steadily transmitted to the next generation and consistently detected only in males. (C) 2009 National Natural Science Foundation of China and Chinese Academy of Sciences. Published by Elsevier Limited and Science in China Press. All rights reserved.

湖北光周期敏感核不育水稻雄性器官发育中长日抑制作用的研究

本文研究了HPGMR农垦58S及农垦58品种与雄性器官发育有关的基本光周期反应特性。探索了与光周期反应过程有关的叶片特异蛋白变化，对HPGMR的研究及这一材料在光周期现象研究中的意义提出了一些看法。 实验得到以下三点主要结果： 1、58S及58生长发育过程在不同阶段均可受到光周期的影响，共同的表现是长日起抑制效应而短日起促进效应。这种效应的基本特征是累积性。对于生殖器官发生而言，存在有一定的短日需求阈值，当所给短日少于需求阈值时，器官的发生过程受阻乃至中断，在幼穗分化上表现为不抽穗;在雄性器官发育上，对予58S这一特殊材料而言，可表现出发育的中止，即mst。在58上不能引起类似的反应，这是由两个材料不同的遗传背景决定的。 2、对于58S及58，10天14h的长日光周期可以在键壮的功能叶片中诱导出一个35KDPI5.1的蛋白质。在本实验所用的电泳系统中，尚未检测到其他受光周期调节的蛋白质。 3、不同品种（系）的叶片蛋白电泳结果表明，在58S及由其转育的晚粳类型的PGMR材料中，均存在一个60KDPI5.5的蛋白。在只对光周期有反应但不出现不育的材料（58）和只表现不育但无光周期反应的材料（野败型不育系珍汕97A等）中，均不存在该蛋白。 根据以上结果，本文提出以下三点看法： 1、HPGMR中光周期控制的雄性不育，是水稻这种短日植物在幼穗分化过程中，短日需求未得到满足而在特殊遗传背景中表现出的雄性器官正常发育的中止。这一概念包括两个方面，一是幼穗发育过程有短日需求，二是雄性器官对经叶片转换的日长信号有特殊的反应。根据这种看法，建议在育种上应以幼穗发育有短日需求的材料为不育性状的转育对象;在机理研究上应更加注意雄性器官发生过程的研究。 2、60KD蛋白可能是判断一个水稻材料是否具有稳定光敏不育特性的有效指标。这一看法若经进一步实验确认，则不仅可在MPGMR的应用上起积极的作用，而且还可为光敏不育性状的遗传控制及操作的研究提供一个很好的入手点。 3、长日诱导35KD蛋白在不同叶位的叶片中出现、结合长日对不同生育阶段的抑制，暗示光周期反应中叶片和顶端关系上存在这样一种可能：即叶片是信号转换器，把环境的日长信号转换为顶端可以接受的生物信号，这种转换只要有环境信号存在即可进行，但顶端是否对此做出相应的反应则取决于顶端自身的状态。这样一种对光周期反应的假设可能将有助于对光周期现象的认识。但若要对它进行实验研究，必须用同样的光周期可以在顶端引起不同反应的实验系统。HPGMR即是这样一种合适的实验系统。从这个意义上，HPGMR及其叶片中的35KD蛋白有可能对光周期反应这一重要的植物发育现象的研究做出有意义的贡献。

同源四倍体水稻三系亲本的遗传差异、细胞遗传学比较研究及低直链淀粉含量突变体Wx基因序列分析

同源四倍体水稻（2N=4X=48,AAAA）是由二倍体水稻（2N=2X=24,AA）通过秋水仙素诱导染色体加倍后得到的新品系，具有优良的抗病性以及较高的蛋白质含量。因此，在四倍体水平上挖掘水稻的增产潜力成为水稻育种的新手段。同源四倍体水稻具有很强的遗传可塑性和很弱的遗传保守性，利用其作为水稻远缘杂交的桥梁，从野生物种中不断地引进有益的基因，这将有助于杂交水稻的多代利用和固定水稻的杂种优势。但是迄今为止，还没有关于同源四倍体水稻遗传多样性，遗传背景的报道。目前世界关于同源四倍体水稻的研究主要集中在中国，主要研究方向为培育、筛选结实正常的亲本材料，配置和筛选结实率正常或接近正常的组合。经过几十年研究，虽然在材料构建，细胞学研究等方面取得了较大进展，但同样由于结实率低的瓶颈问题未解决，而使多倍体水稻育种未能取得实质性进展。而近年来一些关于同源四倍体水稻低结实率机理的细胞学研究也由于缺乏统计学数据而缺乏说明性。本文用SSR标记，对选取的36个结实率正常同源四倍体水稻三系亲本和14个来源二倍体亲本，分析他们的遗传差异和群体遗传结构。本文还利用我们培育的高、低结实率的同源四倍体水稻恢复系、优良保持系和杂种F1及二倍体对照为材料，进行系统深入的细胞遗传学研究，进一步探讨同源四倍体水稻有性传递后代的发育过程，探索分裂期染色体行为特征与遗传性状稳定性的关系，为进一步选育多倍体水稻品种并将其应用于生产提供理论依据。同源四倍体水稻突变株D4063-1直链淀粉含量比来源二倍体明恢63下降一半,即其直链淀粉含量为5.23%，为研究其直链淀粉含量下降的原因，本文还根据普通水稻Wx基因设计引物，扩增测序获得了D4063-1Wx基因的全序列，与已报道Wx基因进行比对分析，并根据D4063-1和籼稻、粳稻的序列差异并根据D4063-1在该片段上的特征序列位点设计了用于识别D4063-1的寡核苷酸片段,为快速、准确的鉴别低直链淀粉的D4063-1创造了条件。 SSR标记具有基因组分布广泛、数量丰富、多态性高、容易检测、共显性、结果稳定可靠、实验重现性好、操作简单、经济、易于高通量分析等许多优点，被认为是用于遗传多样性、品种鉴定、物种的系统发育、亲缘关系及起源等研究的非常有效的分子标记。本研究选取了中国科学院成都生物所培育的同源四倍体和二倍体水稻亲本，并用36个微卫星标记进行了遗传差异和种群遗传结构分析。在50个品系中，我们观察到较高水平的多态性，每基因等位基因数（Ae）分布于2至6之间（平均值3.028），多态性信息含量（PIC）分布于0.04至0.76之间（平均值0.366）；期望杂合度（He）分布于0.04至0.76之间（平均值0.370），Shannon指数（I）分布于0.098至1.613之间（平均值0.649）。同源四倍体品系的等位基因数，期望杂合性和Shannon指数都比二倍体品系高。在供试50个品系中，较多材料均发现Rare基因，根据SSR多态性指数我们构建了同源四倍体和二倍体水稻的核心指纹库。F-统计值表明遗传差异主要存在于同源四倍体品系中（Fst=0.066）。聚类分析结果表明50个品系可以分为4个组。I组包括所有的同源四倍体和二倍体籼稻保持系，以及一个同源四倍体籼稻雄性不育系及其来源二倍体。II组仅包括IR来源的品系。III组比II组和IV组更复杂，包括同源四倍体和二倍体籼稻恢复系品系。IV组包括同源四倍体和二倍体粳稻品系。此外,由于等位基因及配子的遗传差异,同源四倍体与二倍体品系中存在单位点和双位点的遗传差异。分析结果表明,二倍体和四倍体水稻基因库的不同,其中遗传变异可以区分四倍体与二倍体水稻。同源四倍体水稻具有长期而独立的遗传性，我们能够选育并得到与二倍体亲本相比有特殊优良农艺性状的品系。 本研究以高结实率的同源四倍体水稻恢复系DTP-4、D明恢63及优良保持系D46B为材料进行农艺性状及细胞遗传学比较研究。DTP-4、D明恢63及保持系D46B的的染色体组成均为2N=4X=48，花粉母细胞具有较为理想的减数分裂行为，配对染色体的比率在99%以上，这与理论染色体组构成相符。DTP-4和D明恢63PMC减数分裂各个时期单价体和三价体的比例都非常低，而在MI， PMC观察到较多的二价体和四价体且四价体多以环状形式出现，其最大频率的染色体构型分别为12II 6IV和10II 7IV。恢复系DTP-4和D明恢63在MI四价体频率分别为2.00/PMC和2.26/PMC，而保持系D46B在MI四价体频率为6.00/PMC，极显著地高于恢复系品系，表明保持系D46B具有更好的染色体配对性质；AI保持系D46B的染色体滞后频率为10.62%，远低于恢复系材料DTP－4和D明恢63的19.44％和23.14％，接近二倍体对照明恢63的7.30%水平；TI保持系D46B具有比恢复系更低频率的微核数。而在TII，D46B的正常四分小孢子比率不但高于恢复系品系甚至高于二倍体对照。对高低结实率的同源四倍体水稻恢复系和杂种F1代的花粉育性，结实率和细胞遗传学行为进行了比较研究。DTP-4, D明恢63, D46A´DTP-4和D46A´D明恢63的花粉育性和结实率比D什香和D46A´D什香显著提高。减数分裂分析的结果表明，DTP-4，D明恢63，D什香，D46A´DTP-4，D46A´D明恢63和D46A´D什香其减数分裂染色体构型分别为：0.05I +19.96 II (9.89棒状+10.07环状) +0.01III + 2.20 IV, 0.11I +19.17 II (8.90 棒状+10.37 环状) +0.09III + 2.26 IV + 0.01 VI, 1.33I +9.46 II (4.50 棒状+4.96 环状) +0.44III + 6.02 IV + 0.09VI + 0.09 VIII, 0.02I +14.36 II (6.44 棒状+7.91 环状) +0.01III + 4.80IV + 0.01VIII, 0.06 I +17.67 II (11.01 棒状+6.67 环状) +0.06 III + 3.10 IV + 0.01 VI and 1.11 I +11.31 II (5.80 棒状+5.51 环状) +0.41 III + 5.63 IV+0.03VI+0.03VIII。在同源四倍体水稻恢复系和杂种F1代材料中，最常见的染色体构型为16II +4IV和12II +6IV。在减数分裂过程中，结实率较高的材料染色体异常现象较少而结实率较低的材料染色体异常现象较严重。在杂种F1代中，二价体的比例要低于其相应的恢复系亲本，同样的，单价体，三价体和多价体的比例相比其恢复系亲本也偏低。然而，在减数分裂MI，杂种F1代中四价体的比例要显著高于其恢复系亲本。在中期I，每细胞单价体的比例和花粉育性呈现出极高的负相关(-0.996)，当单价体数目升高时，花粉育性下降。其次是每细胞三价体的比例(-0.987)，之后则是每细胞多价体的比例与花粉育性的负相关(-0.948)。但是统计分析表明，二价体和四价体的比例对花粉育性和结实率没有显著影响。这一结果表明出了花粉育性和细胞减数分裂行为的相关性，同源四倍体的减数分裂行为为筛选高结实率的同源四倍体种系提供了理论依据。 突变体是遗传学研究的基本材料。利用突变体克隆水稻基因,并进而研究基因的生物学功能是水稻功能基因组学的重要研究内容。本课题组在多年的四倍体水稻育种研究中已获得多个低直链淀粉含量突变体，其中一些突变体在直链淀粉含量下降的同时，胚乳外观也发生了显著改变，呈半透明或不透明。同源四倍体水稻突变株D4063-1直链淀粉含量比来源二倍体明恢63下降一半,即其直链淀粉含量为5.23%。为研究其直链淀粉含量下降的原因，我们根据普通水稻Wx基因设计引物，扩增测序获得了D4063-1Wx基因的全序列，与已报道Wx基因进行比对分析；同源四倍体水稻D4063-1Wx基因最显著变化为在外显子序列中发生了碱基缺失，导致移码突变，在第9外显子终止密码子提前出现。D4063-1Wx基因碱基位点的变化还导致了其序列上的酶切位点的变化,对常用限制性内切酶位点分析分析结果表明同源四倍体水稻相对于籼稻和粳稻多了2个sph1酶切位点，相对于粳稻减少了6个Acc1，增加了4个Xba1，1个Xho1，1个Pst1和1个Sal1酶切位点。聚类分析表明D4063-1Wx基因序列与籼稻亲源关系较近，由此推测D4063-1Wx基因来源于籼稻的Wxa基因型。另外，根据D4063-1Wx基因的碱基差异，我们推测D4063-1Wx基因外显子碱基变化导致的RNA加工障碍是其直链淀粉降低的主要原因，并可能与其米饭较软等品质相关。本文还根据D4063-1和籼稻、粳稻的序列差异并根据D4063-1在该片段上的特征序列位点设计了用于识别D4063-1的寡核苷酸片段,并作为PCR反应的引物命名为AUT4063-1,将该引物与我们设计的扩增普通籼稻、粳稻的Wx基因引物F5配合使用建立了识别D4063-1的显性和共显性两种检测方式的分子标记,为快速、准确的鉴别低直链淀粉的D4063-1创造了条件。 研究同源四倍体水稻基因组的遗传差异，探索同源四倍体水稻的遗传规律，研究分裂期染色体行为特征与遗传性状稳定性的关系,旨在揭示四倍体水稻中同源染色体配对能力的遗传差异，为进一步选育多倍体水稻品种并将其应用于生产提供理论依据。 Autotetraploid rice (2N=4X=48, AAAA) is a new germplasm developed from diploid rice (2N=2X=24, AA) through chromosomes doubling with colchicines and is an excellent resource for desirable resistance genes to the pathogens and high protein content. Therefore, heterosis utilization on polyploidy is becoming a new strategy in rice breeding. At present, the main research on autotetraploid rice centralizes in China. Breeding effort has been made to improve autotetraploid rice genetically, however, the progresses are limited due to higher degree of divergence between hybrid sterility and polygenic nature. But to date, almost nothing is reported about the genetic diversity, original and genetic background of autotetraploid rice. Despite several reports on cytological analysis of the mechanisms of low seed set in autotetraploid rice still the results are inconclusive due to lack the statistical evaluation. Therefore, the study on the mechanisms of low seed set in autotetraploid is a priority for rice breeding. Microsatellites or simple sequence repeats (SSRs) are the widely used marker for estimating genetic diversity in many species, including wild, weedy, and cultivated rice. In our research, genetic diversity and population genetic structure of autotetraploid and diploid populations collected from Chengdu Institute of Biology, Chinese Academy of Sciences were studied based on 36 microsatellite loci. For the total of 50 varieties, a moderate to high level of genetic diversity was observed at population levels with the number of alleles per locus (Ae) ranging from 2 to 6 (mean 3.028) and PIC ranging from 0.04 to 0.76 (mean 0.366). The expected heterozygosity (He) varied from 0.04 to 0.76 with the mean of 0.370 and Shannon’s index (I) ranging from 0.098 to 1.613 (mean 0.649). The autotetraploid populations showed a slightly higher level of effective alleles, the expected heterozygosity and Shannon’s index than that of diploid populations. Rare alleles were observed at most of the SSR loci in one or more of the 50 accessions and core fingerprint database of the autotetraploid and diploid rice was constructed. The F-statistics showed that genetic variability mainly existed among autotetraploid populations rather than among diploid populations (Fst=0.066). Cluster analysis of the 50 accessions showed four major groups. Group I contained all of the autotetraploid and diploid indica maintainer lines and a autotetraploid and its original diploid indica male sterile lines. Groups II contained only original of IR accessions. Group III was more diverse than either group II or IV and comprised of both autotetraploid and diploid indica restoring lines. Group IV included japonica cluster of the autotetraploid and diploid rices. Furthermore, genetic differences at the single-locus and two-locus levels, as well as components due to allelic and gametic differentiation, were revealed between autotetraploid and diploid varieties. This analysis indicated that the gene pools of diploid and autotetraploid rice are somewhat dissimilar, which made a variation that distinguishes autotetraploid from diploid rices. Using this variation, we can breed new autotetraploid varieties with some new important agricultural characters but the diploid rice has not. Cytogenetic characteristics in restorer lines DTP-4, DMinghui63 and maintainer line D46B of autotetraploid rices were studied. DTP-4, DMinghui63 and D46B showed the advantage of high seed set and biological yield. The meiotic chromosome behavior was slightly irregular in DTP-4, DMinghui63 and D46B. We observed less univalent, trivalent and multivalent at MI, but more bivalent and quadrivalent were observed. The most frequent chromosome configurations were 12II 6IVand 10II 7IV in restorer and maintainer lines, respectively. The quadrivalent frequency of DTP-4 and Dminghui63 at metaphase(MI) was respectively 2.00/PMC and 2.26/PMC. However that frequency of D46B was 6.00/PMC, which was greatly significantly higher than DTP-4 and Dminghui63. That indicates the maintainer D46B has better chromosome pairing capability in metaphase (MI). The frequency of lagging chromosomes of the maintainer D46B at anaphaseI (AI) was 10.62%, which was significantly lower than that of DTP-4(19.44%) and Dminghui63(23.14%) and nearly reaching the level of diploid CK(7.30%). In telophaseI (TI) maintainer D46B showed lower frequency of microkernel at TI and lower frequency of abnormal spores at telophaseII(TII). We also studied pollen fertility, seed set and cytogenetic characteristics of restorer lines and F1 hybrids of autotetraploid rice. DTP-4, DMinghui63, D46A´DTP-4 and D46A´DMinghui63 showed significantly higher pollen fertility and seed set than DShixiang and D46A´DShixiang. Pairing configurations in PMC of DTP-4, DMinghui63, DShixiang, D46A´DTP-4, D46A´DMinghui63 and D46A´DShixiang were 0.05 I+19.96 II (9.89 rod+10.07 ring)+0.01 III+2.20 IV, 0.11 I+19.17 II (8.90 rod+10.37 ring)+0.09 III+2.26 IV+0.01 VI, 1.33 I+9.46 II (4.50 rod+4.96 ring)+0.44 III+6.02 IV+0.09 VI+0.09 VIII, 0.02 I+14.36 II (6.44 rod+7.91 ring)+0.01 III+4.80 IV+0.01V III, 0.06 I+17.67 II (11.01 rod+6.67 ring)+0.06 III+3.10 IV+0.01 VI and 1.11 I+11.31 II (5.80 rod+5.51 ring)+0.41 III+5.63 IV+0.03 VI+0.03 VIII, respectively. Configuration 16 II+4 IV and 12 II+6 IV occurred in the highest frequency among the autotetraploid restorers and hybrids. Meiotic chromosome behaviors were less abnormal in the tetraploids with high seed set than those with low seed set. The hybrids had fewer frequencies of bivalents, univalents, trivalents and multivalents than the restorers, but higher frequency of quatrivalents than the restorers at MI. The frequency of univalents at M1 had the most impact on pollen fertility and seed set, i.e., pollen fertility decreased with the increase of univalents. The secondary impact factors were trivalents and multivalents, and bivalents and quatrivalents had no effect on pollen fertility and seed set. The correlative relationship between pollen fertility and cytogenetic behaviors could be utilized to improve seed set in autotetraploidy breeding. The amylose content of autotetraploid indica mutant Rice D4063-1 dropped by half than diploid Minghui 63, that is, its amylose content of 5.23%.The whole sequence of Waxy gene of D4063-1 is amplified and sequenced. And the discrepancy of bases is found comparing to the reported Waxy gene. The Waxy gene of autotetraploid Rice D4063-1 had a base deletion in exon sequence, which resulted frameshift mutation in exon 9 and termination codon occur early. The mutation of Wx also led to the change of some common restriction endonuclease sites. Results showed compared to indica and japonica, D4063-1 had two adding sph1 sites. Compared to japonica, D4063-1 had six decreasing Acc1, a adding Xho1, Pst1 and Sal1 restriction sites. Phylogeny analysis shows that the DNA sequence of Waxy gene of D4063-1 is closer to Indica, and we suppose that the Waxy gene of D4063-1 is origin from genotype Wxa. In addition, according to the base differences of Wx in D4063-1, we deduce that RNA processing obstacle led by base change of intron is the main cause to low the amylose content, and related to phenotype of its soft rice. Based on analysis of fragments of D4063-1, indica and japonica and according to the special point of the three species, primers as markers-AUT4063-I were designed for distinguishing the D4063-1 from other rice. Combining with primer pair F5, dominant and codominant ways were established for discriminating them., rapid and correct identification of D4063-1 from other rice could be done. The genetic analysis is important to ensure the original of autotetraploid rice, for maintaining the “distinctiveness” of autotetraploid varieties, and to differentiate between the various genetic background of autotetraploid rice. The autotetraploid breeding will benefit from detailed analysis of genetic diversity in the germplasm collections. Further investigation on mechanisms of meiotic stability should benefit polyploid breeding. These findings demonstrated opportunity to improve meiotic abnormalities as well as grain fertilities in autotetraploid rice.