外源褪黑激素对野芥菜(Brassica juncea)生长的影响

褪黑激素（N-乙酰基-5-甲氧基色胺）是一种广泛存在于生物体内的吲哚类活性分子。本文以野芥菜（Brassica juncea）为例，初步研究了外源褪黑激素对植物生长生殖的影响。我们选取了发芽2天和发芽4天的野芥菜幼苗，用不同浓度的褪黑激素对其处理24小时，然后测量根的伸长量。结果表明，对于发芽2天的野芥菜，0.1 µM的外源褪黑激素能够显著提高野芥菜幼苗根的生长，而100 µM的外源褪黑激素处理则能够显著抑制根的生长;对于发芽4天的野芥菜，低浓度的外源褪黑激素处理对根生长的影响不明显，而高浓度的褪黑激素处理（如100 µM）能够显著抑制根的伸长。结果表明发芽晚期的野芥菜幼苗的根可能对褪黑激素的处理不敏感。由于褪黑激素对植物的生理作用类似于生长素的作用，因此选用了发芽2天的野芥菜幼苗为植物材料，用外源褪黑激素处理其根24小时后，通过间接酶联免疫吸附测定(ci-ELISA)的方法测定了内源吲哚乙酸（IAA）含量的变化。结果表明低浓度的褪黑激素处理时，内源IAA的含量增高，而在高浓度的褪黑激素处理时，内源IAA含量的变化不大。 关于褪黑激素对野芥菜生殖的影响，我们在花蕾期用褪黑激素涂抹野芥菜的花蕾，并在开花授粉后用褪黑激素涂抹柱头，然后在结实时测量果荚长度，种子千粒重，平均每荚种子数，发芽率等指标。结果表明：对于在花蕾期用褪黑激素处理的植株来说，褪黑激素处理对其的果荚长度，千粒重，平均每荚种子数都没有显著的影响。对于开花后用褪黑激素处理授粉后的柱头，1 µM的褪黑激素处理过的主枝具有较长的果荚长度，而褪黑激素处理对千粒重，平均每荚种子数，发芽率，发芽势和发芽指数均没有显著的影响。在花粉萌发实验中，外源褪黑激素的处理浓度和时间均对花粉萌发有一定的影响，表现为随时间的增加，花粉萌发数目增加，在4 h时，低浓度的褪黑激素处理（10 µM）下花粉的萌发较多。

TNFa在鱼腥藻7120中的高效表达和对宿主光合作用的影响

蓝藻分子生物学的飞速发展已使其成为生物学的前沿。近几年来，以蓝藻为宿主的基因工程发展迅速，使转基因蓝藻已有希望制备药物或处理环境问题。但迄今为止，国内外用蓝藻表达外源基因的表达效率都不高。为了使转基因蓝藻在应用上产生较好的社会效益和经济效益，必须进一步提高外源基因在蓝藻中的表速效率，以及提高光合效率、加速生长。 本研究用人肿瘤坏死因子a（Human Tumor Necrosis Factora简称hTNFa）作为外源目的基因。它是由巨噬细胞和单核细胞受到刺激后产生的一种多功能蛋白质细胞因子。hTNFcc多种生物学效应并作为信号传导体，其中最引人注目的是它对肿瘤组织和肿瘤细胞直接地、特异性和广谱性地杀伤作用，极有希望制成抗癌剩的天然因子之一。但是用大肠杆菌得到的重组产物需要严格纯化，通常用于静脉注射，但由于毒副作用大，十几年来国内外一直停留在临床实验阶段，我们研究组建议用蓝藻为宿主表达hTNFa制备口服剂，来减缓毒副作用，已经得到了转基因鱼腥藻，并测得产物具有抑瘤的生物学活性。但是表达效率一直不高，并且它的表达对蓝藻生长有些抑制。 由于蓝藻是原核生物，基因的表达调控主要是在转录水平和翻译水平。因此，寻找在蓝藻中高效的启动子，改变SD序列的结构是提高外源基因在蓝藻中表达效率的有效手段。本研究将连有不同SD序列的TNFa cDNA克隆到穿梭表达载体pRL-489的启动子（PpsbA）下游，构建2个鱼腥藻7120的穿梭表达载体（pMD-489-TNF1，2），通过三亲接合转移法分别导八鱼腥藻7120细胞。用放射免疫法定量分析TNFa在转基因蓝藻中的表达效率。结果表明，有效地提高了TNFa在鱼腥藻7120中的表达。TNFa的表达量占总可溶性蛋白的2.1 - 2.9%和0.15%，表达效率分别提高到原来的21 - 29倍和1.5倍。 在培养转基因鱼腥藻中，观测到它们在形态和生理上都发生了变化，这反应了TNFcc基因的转入和表达对宿主光合作用的影响。 光学显微镜和扫描电子显微镜的观察发现：转基因鱼腥藻比野生型异形胞数目减少约30%。转入空质粒的营养细胞比野生型略大，转TNFa基因的鱼腥藻异形胞体积明显增加，而营养细胞比正对照和野生型小。到了生长后期，转TNFa因的鱼腥藻营养细胞体积明里增大，多与异形胞相当，有的甚至比异形胞大。转pMD-489-TNFI的鱼腥藻细胞内出现明显的空腔。通过透射电子显微镜的观察发现：转基因藻中的类囊体膜片屡结构更加明显。转基因藻和野生藻的生长曲线的比较表明，转入空质粒pRL-489对宿主的生长几乎没有影响，甚至还略快于野生型;TNFa的表达对细胞的生长有一定副作用，胞内TNFa的含量高时，细胞数增长缓慢，并且平台期时细胞数有一定下降。 从光合作用光强曲线的分析可见，转TNFa因的鱼腥藻有较低的光饱和点，暗示了TNFa的表达可以增强宿主对光的敏感性;同时，TNFa的转入使宿主的呼吸作用加强，几乎比野生型和转空质粒的正对照高一倍，显示了TNFa基因的转入和表达可能给宿主带来更大的代谢负荷;在光饱和点以上，几种藻的真实光合放氧能力大致相同，表明TNFa的表达没有破坏宿主的光合反应中心。 从室温吸收光谱分析可见，转基因蓝藻有相对较高的类胡萝卜素和叶绿素a蓝峰，转TNF谌因的鱼腥藻显示了藻蓝蛋白含量有所降低。因为蓝藻的主要天线色素为藻胆蛋白，藻蓝蛋白相对含量的下降可能与宿主对光更敏感有关。 从低温荧光发射光谱分析可见，转TNFa基因的鱼腥藻7120光系统II能量分配较高。可能是TNFa基因的转入提高了藻胆蛋白的吸收和传递光能的效率。 从叶绿素荧光动力学分析可见，鱼腥藻7120在生长的过程中PSII的活性存在一个变化的过程。TNFa的转入和表达在对数后期提高了宿主的光系统II原初光能转化效率。 从转基因藻光系统I和光系统II光合放氧活性分析与TNFa表达随培养时间变化曲线表明，转TNFcc基因鱼腥藻的光合放氧活性比野生型和正对照高，尤其是显著地提高了宿主的Psn活性。 用自然界中原来不存在的转基因鱼腥藻作上述研究表明：原来只存在于高等、异养的人类和哺乳动物中的TNFa基因，一旦转入最古老的放氧光合生物后，其表达可被调控;同时TNFa的表达又能影响宿主的光合作用。它提高了宿主对光的敏感性、光系统II的活性和对光能的利用率。这似乎都表明TNFa在蓝藻细胞中起信号传导体的作用。而且，这些数据的积累，还有助于我们优化培养条件，提高TNFa的表达效率，为产业化做好准备。

转基因油菜和野芥菜杂交种的适合度

转基因植物与野生亲缘种间的基因流动是目前生物安全的研究热点。甘蓝型油菜（Brassica napus 以下简称油菜）及其亲缘种是基因流研究中的模式植物体系，油菜的亲缘种之一野芥菜(B. juncea)在中国分布广泛，是常见的农田杂草。本文以转基因抗虫油菜和野芥菜为研究材料，分别用综合适合度(基于生长和生殖)和适合度(仅基于种子产量)的指标来评估其杂交种在模拟农田情况下的适合度，揭示转基因在自然环境中的命运，以期为中国的油菜基因流的管理和控制提供参考。主要结果如下： 由于杂种优势和亲本效应的影响，转基因杂交种在不同的种植季节的生长与长势较好的亲本相近。因而转基因杂交种的综合适合度介于双亲之间，或与表现较好的亲本相似。因结实较差，从种子产量上来看，转基因杂交种的适合度较低。杂交种的后代因母本效应保留了一定的休眠特性，这有助于杂交种在种子库中持续存在。野芥菜和杂交种秋播时在冬季覆大棚条件下的适合度较高，在全球变暖的情况下，野芥菜和杂交种有可能在原先较冷不适宜的地区生长，从而促进转基因的散布。 杂交实验表明，转基因花粉与野芥菜的亲和性略高于非转基因花粉，但不显著；在两种花粉发生竞争时，转基因花粉的亲和性显著较高。混合花粉授粉的结实率高于单种花粉的结实率。可见在转基因花粉在授粉阶段不存在适合度代价。同时两季秋播田间实验表明，转基因油菜与非转基因油菜的适合度没有明显差异，即在植株的生长结实阶段，当没有竞争和虫害选择压力时，转基因没有适合度代价。也证明转基因散布的潜在可能性较大。此外，转基因杂交种的开花量很大，而回交实验中转基因杂交种花粉的育性高于胚珠的育性。转基因有可能通过持续的回交逃逸。 油菜的种子较大，野菜芥的种子较小，转基因油菜与野芥菜的杂交种基本都是小种子，其种子直径低于双亲。种子大小影响了发芽率、出苗率和营养生长期。小种子出苗率和发芽率较低，营养生长期较长。在没有竞争的条件下，春播实验中，种子大小对植物的适合度及综合适合度没有影响。秋播实验中种子大小对除转基因油菜外的所有植物基因型的综合适合度有显著影响。但对于依据种子产量计算的适合度指标来说，种子大小仅对野芥菜有影响，而对其它基因型影响不大。竞争扩大了种子大小之间生长表现的差异。竞争条件下，不同种子级别间的生长变异系数大于无竞争的情况。 总之，转基因花粉较强的竞争能力和其与野芥菜的亲和性使转基因杂交种的产生成为可能。来自母本的休眠特性有助于杂种种子在种子库中存在并在条件适宜时萌发、开花，有助于转基因的进一步扩散。转基因杂交种具有较高的综合适合度，虽然结实率很低，但其开花量比较大，可能会产生大量可育的花粉，在与野生亲本的持续回交过程中，转基因有可能逃逸。同时，转基因杂交种的种子级别偏小有可能会加剧这种逃逸。

脂肪酸钙对放牧肉牛超数排卵效果及雌二醇和孕酮水平的影响

以探讨添加脂肪酸钙对放牧肉牛(婆罗门和BMY)超数排卵效果及血中雌二醇(E2)和孕酮(P4)水平的影响为目的.将48头供体分为Ⅰ(放牧或对照组)、Ⅱ(放牧+浓缩饲料500 g/d)和Ⅲ(放牧+浓缩饲料500 g/d+脂肪酸钙100 g/d)3组,从同期发情处理开始到冲胚结束试验期32 d,并对供体牛在8个处理时段进行采血,用放射免疫分析法(RIA)分析E2和P4水平.试验结果表明:Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ组供体牛超数排卵的排卵率分别为75.4%,74.4%和81.7%(P＞0.05),受精率分别为81.4%,55.6%和93.2%(P＞0.05);获胚(卵)数分别为7.0枚,6.3枚和7.3枚(P＞0.05),可用胚数分别为3.9枚,2.6枚和4.7枚,Ⅲ组显著高于Ⅱ组(P＜0.05);E2平均水平分别为0.57 pg/mL,0.47 pg/mL和0.63 pg/mL(P＞0.05),P4平均水平分别为3.53 ng/mL,5.03 ng/mL和3.74 ng/mL,Ⅱ组高于Ⅰ,Ⅲ组(P＜0.01).表明适量添加脂肪酸钙能改善全放牧肉牛的营养、增强体质,促进排卵与受精,增加超数排卵的可用胚数;能使供体牛的E2和P4水平比对照组有所提高;添加效果冬、春季优于夏、秋季.

全放牧婆罗门牛和BMY牛的超数排卵效果及激素水平比较

为了比较婆罗门牛和BMY牛的雌二醇(E2)、孕酮(P4)水平及胚胎生产潜力,并探讨MOET技术在BMY牛扩繁中的应用前景,采用进口激素(日本产FSH 24~36 mg+美国产PG 35 mg)和国产激素(国产FSH 10~12 mg+国产PG 0.8 mg)对全放牧婆罗门牛和BMY牛进行超排,并于超排前(同期发情第7天)、超排开始、超排第3天、超排发情当天和胚胎回收当天采集血液,采用RIA法分析血浆中的E2和P4水平。结果表明,BMY牛的黄体数和获胚(卵)数、可用胚数分别较婆罗门牛高2.09个和0.95、0.36枚,但差异不显著(P>0.05);BMY牛的排卵率较婆罗门牛高18.46%(P<0.01),而可用胚率则较婆罗门牛低2.55%(P<0.01)。BMY牛在5个处理时段的E2和P4平均值分别较婆罗门牛高0.58 pg/mL(P<0.01)和1.44 ng/mL(P>0.05),在各处理时段的P4水平变化规律几乎与婆罗门牛一致,E2/P4值为婆罗门牛的5.16倍。结果提示,BMY母牛的E2和P4水平高于婆罗门牛,在激素水平和繁殖性能方面表现出一定的杂种优势;E2水平低是婆罗门牛发情微弱和排卵率低的主要原因...

镉、铅污染土壤的植物-微生物联合修复研究

植物－微生物联合修复是利用微生物作为植物修复重金属土壤的一种强化手段，在弥补单纯植物及微生物修复技术不足的同时，利用植物和微生物的共存体系提高植物修复效率。本研究考察了向日葵（Helianthus annuus L.），芥菜（Brassica juncea L.），紫花苜蓿（Medicago sativa L.）和蓖麻（Ricinus communis L.）对Cd、Pb的富集特征，并筛选出向日葵作为富集植物；探讨了向日葵根系分泌物在重金属胁迫下的变化；通过重金属耐受菌株与向日葵的配伍对Cd、Pb污染土壤进行联合修复，结果如下： 液体培养实验结果表明，四种植物对Cd、Pb富集能力明显不同，其中向日葵对两种重金属的提取效果较好。四种植物对重金属的富集量随着浓度的增加而增加，而富集系数随重金属浓度的增加而减小，转移系数同重金属浓度及地上部/地下部生物量比值呈现一定的相关性；Cd、Pb复合处理中，一种重金属的存在会在不同程度上影响植物对另一种重金属的吸收；此外，不同植物及重金属处理中根际区域的酸碱度及氧化还原电位呈现负相关性。 砂培实验结果表明，向日葵对重金属的富集规律基本同液体培养实验相似。富集系数与重金属浓度和培养时间呈现线性相关关系。复合处理中，当Cd和Pb在适当浓度比例时，向日葵可以增加对某一重金属的吸收效率。向日葵的根系分泌物组成因重金属的存在而明显减少，根系分泌物中的草酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、乙酸及丁二酸含量随着不同浓度Cd、Pb而发生不规则变化。 在以根系分泌物作为唯一营养来源筛选重金属耐受菌株实验中，细菌和真菌对Cd及Pb的耐性及吸附效率不同。总体上看，微生物生物量随重金属浓度升高而降低，而重金属吸附量随浓度升高而增加，重金属复合毒性也减少了微生物对单一重金属的吸收；另外，培养基中酸碱度因微生物种类及重金属浓度而有所差异。 将筛选出的优势微生物与向日葵配伍处理Cd、Pb污染土壤的实验中，由于Cd、Pb污染模式及菌株种类的不同，微生物对向日葵吸收重金属的强化效果呈现很大差异，其中真菌对植物吸收重金属的强化能力较细菌强；同时，根系分泌物中6种有机酸的含量在不同处理中变化较大；在处理单一Cd或Pb污染的时候选用菌株B1、F1或混合菌B1+B2、F1+F2、B2+F1、B1+F2与向日葵配伍修复的效果较好；混合菌F1+F2、B1+F2、B2+F1的添加能较好的强化Cd、Pb复合污染中向日葵吸收重金属的能力。

一种催化甲状腺素脱碘的抗体酶

目的　模拟生物体内一族重要的含硒酶 甲状腺素脱碘酶 ,制备催化甲状腺素脱碘的含硒抗体酶。方法用杂交瘤技术制备出抗甲状腺素的单克隆抗体 4C5 ,再用化学修饰法将催化基团硒代半胱氨酸引入到抗体的抗原结合部位 ,得到含硒抗体酶Se 4C5 ;通过RIA方法测定抗体酶活力。结果　抗体酶Se 4C5有明显的催化甲状腺素脱碘活性 ,其Vmax为 2 70pmol·min- 1 ·mg- 1 (protein) ;催化反应速率与底物浓度的双倒数图为一组平行线 ;对底物甲状腺素的特异性高于天然酶 ;6 丙基 2 硫代尿嘧啶对其活力起抑制作用 ,是二硫苏糖醇 (DTT)的竞争性抑制剂。结论　首次制备出有天然脱碘酶活性的抗体酶 ,催化机制属于双底物乒乓反应机制

Expression of human epidermal growth factor gene in cyanobacteria

The human epidermal growth factor (hEGF) is a small single-chain polypeptide of 53 amino acid residues. It can stimulate the proliferation of many cell types, mainly those of epidermal and epithelial tissues both in vivo and in vitro. A vector pRL-hEGF was constructed using plasmids pRL-489 and pUC-hEGF. The synthetic hEGF gene was recombined into the downstream of strong promoter psbA in plasmids pRL-489. Then, the vector was introduced into Synechococcus sp. PCC 7002 and Anabaena sp. PCC 7120 by triparental conjugative transfer. The transformation was confirmed by PCR amplification. The pRL-hEGF is thought to be retained as a plasmid form in the transgenic Anabaena sp. PCC 7120, since it can be recovered. However, it has been integrated into the chromosome of Synechococcus sp. PCC 7002 as there is no duplication origin in the pRL-hEGF in this cyanobacterium. and plasmid cannot be isolated from the Synechococcus sp. PCC 7002 either. The radioimmunoassay (RIA) proved that the hEGF gene has been expressed as the protein existed in these two strains of transgenic cyanobacteria, and the hEGF protein in Anabaena sp. PCC 7002 could be secreted into the medium.

牙鲆性腺分化发育及类固醇激素T和E2对性腺分化的影响

本文采用组织学手段研究了牙鲆性腺在分化、发育和成熟过程中的变化。然后，通过放射性免疫方法（RIA）测定了牙鲆仔稚幼鱼全组织匀浆液中的性类固醇激素—睾酮（T）和雌二醇（E2）的含量，并结合牙鲆血清中T和E2含量的年周期测定，从内分泌学水平探讨了T和E2在其性腺分化、发育和成熟过程中水平的变化规律。同时，采用高温和雌性激素对性腺未分化的普通和雌核发育牙鲆仔稚鱼进行诱导处理，获得了较高比例的雄性鱼/假雄鱼或100%雌性鱼；并研究了这些外界环境因子对牙鲆性腺分化、性别比率及体内T和E2水平的影响，藉此探讨了牙鲆性别决定与性腺分化的细胞学和内分泌学机制。 对牙鲆仔稚幼鱼性腺的组织切片观察发现，培育水温18~20℃下，孵化后第45天、平均全长<22.0±2.8 mm的牙鲆，其性腺分化尚未开始，属于原始性腺；在孵化后70日龄、平均全长为38.0±1.7 mm左右，部分个体中观察到卵巢的雏形，其余个体的性腺在此阶段以及之后的一段时间内变化并不明显；到了第110天、平均全长达到86.5±5.9 mm时，雌性个体卵巢出现了卵原细胞向卵母细胞的转变，标志着卵巢分化的结束。在90日龄、平均全长为63.5±3.4 mm的雄性牙鲆中，精原细胞快速增殖，并观察到了输精管结构；进一步的细胞学分化则出现在100日龄、平均全长为76.0±8.6 mm的个体中，此时可以看到精小叶的形成；在平均全长为140.0±15.2 mm时，精巢中出现初级精母细胞，标志着性腺分化的基本完成。 对牙鲆仔稚幼鱼全组织匀浆和成鱼血清中的T和E2水平的比较发现，在全长为6 mm左右的仔鱼中T和E2含量均较高。随后，在性腺分化过程中T含量大大降低，E2的含量急剧增高，而性腺分化后期E2含量又降到较低的水平。在雄性牙鲆成鱼中， 从精巢第Ⅲ期开始，T含量随着精巢的发育而增加，到了精巢第Ⅴ期性腺发育成熟并排精后，又降低到较低的水平；E2含量在从精巢第Ⅲ期发育至精巢第Ⅴ期过程中略呈降低的趋势，但是总体上来说没有明显的差异。在雌性牙鲆成鱼中，卵巢从第Ⅱ期到第Ⅳ期的过程中，T水平逐渐升高，在第Ⅴ期时则明显降低；而E2含量在卵巢第Ⅱ期时保持较低的水平，随着卵巢的发育，E2含量逐渐增高，在卵巢第Ⅳ期时达到最高水平，在第Ⅴ期产卵后又有所降低。在雌雄个体中T和E2均呈现周期性的变化。5月份随着水温的升高，雄性个体T和E2含量显著上升；到了9月份又逐渐下降至最低值。雌性个体E2含量自3月份开始增高，在5月份急剧升高，并在6月份达到最高值；在7月份的时候，E2突然降低，而到了8月份又有所回升；9月份之后E2逐渐降低并在1月份左右降到最低；而T的含量分别在2月份和6月份出现两次高峰。 温度诱导牙鲆幼鱼性腺分化的结果表明，牙鲆中存在明显的TSD机制，即其性腺分化因饲育水温的不同而变化：在一定温度范围内，随着饲育温度的增加，牙鲆的雄性比例逐渐增高，常温对照组和21℃组中的雄性比例分别为51.62%、60.00%，而在24℃和28℃高温组中，雄性比例显著高于对照组，分别达到73.33%和87.27%。T和E2含量测定显示，在性腺分化时期，高温和对照组中T含量没有明显的变化，而温度处理组中的E2水平则低于对照组，特别是在28℃高温组，其E2水平显著低于对照组（P<0.05）。外源E2处理性腺未分化的牙鲆幼鱼的结果也表明，牙鲆的死亡率与雌性化比率均为雌性激素剂量依赖型的。随着外源E2剂量的增加，雌性比率增加，但同时死亡率也增高。此期间T和E2水平比较发现，在性腺分化时期，对照组中的T含量稍高于雌激素处理组；而对照组中的E2含量高于0.2 ppm和2 ppm两个低剂量组，却低于20 ppm和100 ppm两个高剂量组。 同时，还对人工诱导培育的雌核发育牙鲆和性反转牙鲆进行了性腺发育观察，在所观察的雌核发育牙鲆个体中，其雌性比例为83.33%，而高温28℃饲育群体中的雄性比例（即假雄鱼比例）为91.67%；在雌性个体中，也有一定比例的个体性腺发育不正常，有的性腺发育较小，有的则缺少部分性腺。进一步对雌核发育成体的血清中T和E2含量进行测量，发现在普通牙鲆个体中T含量显著低于雌核发育个体，而E2含量则高于雌核发育牙鲆；在雌核发育牙鲆中，性腺发育不正常的个体比性腺发育正常的个体中的T含量稍高，而E2含量则显著低于正常雌核发育牙鲆个体和普通牙鲆个体（P< 0.05）。