A Proteomic Study on Cell Cycle Progression of Endothelium Exposed to Tumor Conditioned Medium and the Possible Role of Cyclin D-1/E

This study was designed to comprehensively analyze the differential expression of proteins from human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) exposed to tumor conditioned medium (TCM) and to identify the key regulator in the cell cycle progression. The HUVECs were exposed to TCM from breast carcinoma cell line MDA-MB-231, then their cell cycle distribution was measured by flow cytometer (FCM). The role of protein in cell cycle progression was detected via two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2-DE) and western blotting. Following the stimulation of TCM, HUVECs showed a more cells in the S phase than did the negative control group (ECGF-free medium with 20% FBS), but the HUVECs' level was similar to the positive control group (medium with 25 mug/ml ECGF and 20% FBS). Increased expression of cyclin D-1/E and some changes in other related proteins occurred after incubation with TCM. From our results, we can conclude that breast carcinoma cell line MDA-MB-231 may secrete soluble pro-angiogenic factors that induce the HUVEC angiogenic switch, during which the expression of cell cycle regulator cyclin D-1/E increases and related proteins play an important role in this process.

野大豆贮藏蛋白的基因的克隆及早期发育的基因表达的研究

豆科植物是动物获取植物蛋白的主要来源之一。豆类种子储藏蛋白作为一种多基因家族的产物专一性地积累于种子的发育过程。植物遗传工程需要深入地了解基因的特异性表达及调控。种子储藏蛋白基因为这类研究提供了一个理想的研究系统。在我国生长着大量的野生豆科资源，许多优良性状被期望应用于将来的植物遗传工程研究．本文选择了一种富含种子储藏蛋白高达50%的野生大豆品种Glycine soja 79-34作为材料进行了以下的研究： 1、大豆7s储藏蛋白基因同源片段的克隆。 以原生质体作为初始材料游离大片段染色体DNA，原生质体经低渗处理而破裂，方法简便，得到的DNA分子量大且重复率高。大片段染色体DNA经EcoRI酶切后，用32P标记的大豆a'-亚基基因作为探针进行分子杂交，得同源片段的杂交带。其中分子量大约为6.3kb的同源片段被克隆到Puc9质粒中，通过x-gal/IPTG培养基及原位杂交初步筛选出5个克隆。进一步的Sourthern分子杂交确认了一个克隆包含7s储藏蛋白a'-亚基基因的同源片段。其详细的序列分析尚需进一步进行。 2、种子储藏蛋白基因在体细胞胚胎发生中的表达。 以授粉20天左右的幼胚作为外植体，在含有2mg/l 2,4,5-T的B5液体培养基中直接诱导愈伤组织，一个月内得到了均一的野生大豆悬浮培养体系。悬浮培养细胞转至含有0.5mg／l萘乙酸，O.1mg／l 2,4-D，0.5mg／l BA，0.5mg/l玉米素的B5液体培养基中，得到了处于不同发育阶段的体细胞胚。分别从体细胞胚及悬浮培养细胞中提取总RNA，以种子储藏蛋白基因为探针，RNA斑点杂交首先证明种子储藏蛋白基因在体细胞胚中转录水平上的表达，而在末分化的悬浮培养细胞中则检测不到．从处于不同发育时期（球形胚，心形胚，鱼雷形胚及带有分化子叶的胚）的体细胞中分别提取盐溶蛋白，用大豆储藏蛋白的兔抗血清做Western blotting分析，发现最早在球形胚中即能检测到种子储藏蛋白的积累，大大早于合子胚发育过程中种子储藏蛋白积累的时期．随着体细胞的发育，储藏蛋白的积累略有增加，但总体水平上不如合子胚发育中的明显。本研究从几个方面探讨了种子储藏蛋白基因在体细胞胚及合子胚发育过程中表达的相似性及差异，并对其产生差异的原因作出了推测。 3、果蝇同源转化基因在植物基因组中的检测及表达的探讨。 果蝇同源转化基因(Homeotic gene)被认为是早期胚胎发育过程中形态发生的开关基因。在动物界中已有80多个同源序列从不同进化水平的动物中分离出来，是一个非常保守而与发育密切相关的基因。本研究以果蝇同源转化基因为探针，分别在野生大豆及土豆的基因组中都检测到了该基因同源序列的存在。用野生大豆染色体DNA的多种内切酶片段做分子杂交分析发现至少有一个拷贝的基因同源性非常高。进一步关于该基因表达的研究发现，在未成熟胚及浸泡过夜的种子中都能检测到该基因的表达，但在休眠种子，萌发5天以上的种子及成熟叶片中未能检测到。该基因的表达只局限于早期发育，因而推测其功能有与动物界中的一般性。

植物细胞壁富含羟脯氨酸糖蛋白生化特性及基因克隆的研究

植物细胞壁富含羟脯氨酸糖蛋白生化特性及基因克隆的研究分成三部分： 第一部分，首先从胡萝卜愈伤组织的细胞壁中获得0.2M氯气钙可溶性蛋白质组分, 经10% TCA沉淀及羧甲基纤维素层析，分离得到一个伸展蛋白，并以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，氨基酸组成分析，分子电镜观察对所得的伸展蛋白进行了鉴定，结果表明，在胡萝卜愈伤组织中只存在一种伸展蛋白;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的考马斯蓝染色和PAS反应均为阳性，表明伸展蛋白除蛋白质组分还含有糖基;氨基酸组成分析表明，羟脯氨酸的克分子含量约占全部氨基酸的40%，丝氨酸的克分子含量约为羟脯氨酸的四分之一，含有大量的碱性和中性氨基酸，而只含有非常少量的酸性氨基酸，并且这些氨基酸克分子百分数也接近于胡萝卜富含羟脯氨酸糖蚤白基因推测出的克分子百分数。这些结果表明已经得到了一个电泳纯的伸展蛋白。伸展蛋白分子电镜观察证明它是一个棒状分子，长度为87纳米。 第二部分，用得到的伸展蛋白免疫家兔和大鼠，得到的抗体的免疫双扩散效价分别为1:2和1:1，用酶联免疫吸附分析测定的兔抗体效价为1:12，800，同时还建立了竞争性酶联免疫吸附分析测定伸展蛋白含量的标准曲线，线性范围为10-0.00001微克。利用得到的抗体对大豆下胚轴伸展蛋白的合成进行了研究。免疫荧光定位表明，大豆下胚轴表皮细胞及表皮下几层薄壁细胞有大量的荧光标记，并且这些荧光标记大部分分布在细胞质内。大豆下胚轴O.lM Tris-HCl pH7.4和0.2M氯化钙的提取物Western Blotting分析证明0.2M氯化钙提取物有与胡萝卜伸展蛋白电流性质相似的组分，并且这个组分在真菌诱导物处理的大豆下胚轴中的积累明显高于受伤处理的下胚轴。受伤和真菌诱导物处理大豆下胚轴中伸展蛋白积累的变化已经用Western Blotting分析和斑点酶联免疫吸附分析来观察，发现真菌诱导物处理的对灰斑病抗性的大豆下胚轴能够较快地积累伸展蛋白（24 - 48小时），而敏感品系的大豆下胚轴则合成伸展蛋白较晚（43-72小时）。在观察大豆下胚轴免疫荧光定位也发现类似的结果。对伸展蛋白基因的转录活性的初步研究认为抗性品系的大豆下胚轴同源mRNA转录可能早于24小时，而敏感品系大豆下胚轴同源mRNA转录可能在24小时后。以上结果认为大豆下胚轴含同源的mRNA和蛋白质组分，因此推测大豆基因组DNA有伸展蛋白基因。 第三部分，根据第二部分得到的结果，用已经得到的编码胡萝卜伸展蛋白的基因（克隆于pUC8质粒载体中）作探针，与大豆基因组DNA的EcoRI部分酶解片段杂交寻找大豆伸展蛋白基因，已经发现四个片段与探针DNA有同源性。它们的分子量分别约为23kb，8kb，5kb和2.8kb，并且23kb片段可能有更高的同源性。将23kb片段插入pUC9质粒载体上进行可隆，并用菌落原位杂交筛选获得5个克隆，对其中两个克隆用ECoRI酶解并进行分子杂交分析，重组质粒被EcoRI切成四个片段。2.8kb片段为pUC9栽体，2kb片段为与pDC5AI质粒伸展蛋白同源性较好的片段。对于23kb片段的重组质粒有待于进一步的分析。

固氮菌突变种DJ35钼铁蛋白和UW3细菌铁蛋白的纯化、特性、晶体生长及鉴定

一、棕色固氮菌突变种DJ35固氮酶钼铁蛋白的纯化、体外重组及结晶研究 　　棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii Lipmann)突变种DJ35的菌体破碎后，所得的未经加热的粗提物经DEAE Cellulose 52柱层析后得到部分纯的钼铁蛋白（ΔnifE Av1）和铁蛋白(Av2)。部分纯的ΔnifE Av1再经Sephacryl S-300和Q-Sepharose Fast Flow柱层析进一步纯化，便首次得到SDS凝胶电泳检测为基本纯的ΔnifE Av1。SDS-PAGE及Western blotting的结果表明，ΔnifE Av1具有与野生型棕色固氮菌钼铁蛋白(OP Av1)相同的亚基种类和组成（α2β2）。质子还原活性测定表明，在与Av2进行活性互补时ΔnifE Av1不具有明显的质子还原活性，而与从OP Av1抽提出的FeMoco抽提液保温后便可与Av2实现活性互补。这表明，ΔnifE Av1是一种缺失FeMoco的钼铁蛋白。 　　将ΔnifE Av1用过量的邻菲啰啉(o-phenanthroline)厌氧处理并经Sephadex G-25柱层析分离后，便得到部分丢失Fe的ΔnifE Av1©。在同时存在Av2和MgATP发生系统的条件下，ΔnifE Av1©, 而不是处理前的ΔnifE Av1，可为由KMnO4或Na2CrO4、高柠檬酸铁、Na2S、Na2S2O4 和二硫苏糖醇组成的含Mn或含Cr重组液(RS-Mn或RS-Cr)显著激活，但在缺少MgATP或Av2的条件下，RS-Mn和RS-Cr则不能激活ΔnifE Av1©。这就表明，RS-Mn和RS-Cr对ΔnifE Av1©的激活都需要邻菲啰啉的预处理及Av2和MgATP的同时存在。从分别缺失nifZ和nifB点突变的固氮菌突变种DJ194和UW45中纯化得到的钼铁蛋白，ΔnifZ Av1和NifB- Av1，经邻菲啰啉厌氧处理并经Sephadex G-25柱层析分离后，也分别得到部分丢失Fe的ΔnifZ Av1©和NifB- Av1©。与ΔnifE Av1©一样，这两种蛋白在Av2和MgATP同时存在时也可被RS-Cr和含Mo重组液（RS-Mo）明显激活。 　　为获得可供X-射线衍射的ΔnifE Av1的大单晶，对组成蛋白质沉淀剂的各种化合物的种类和浓度、缓冲液的pH值、结晶方法及蛋白样品的批次、浓度等结晶条件进行了大量优化研究。首次获得了ΔnifE Av1的深棕色短斜四棱柱晶体，并对其蛋白组成进行了鉴定。 二、铬铁蛋白中残存的棕色固氮菌细菌铁蛋白的晶体生长及鉴定 　　从无钼、无氨而含铬的固氮培养基中生长的棕色固氮菌突变种UW3中纯化得到了部分纯的CrFe蛋白。在试图培养CrFe蛋白大晶体时发现，棕色晶体和砖红色晶体可同时或单独出现。SDS-和厌氧天然-PAGE皆表明，棕色晶体主要由与Av1类似大小的亚基（~60 kD）组成，而砖红色晶体则主要由~20 kD亚基组成。Western-blotting表明只有~60 kD亚基可与OP Av1的抗体发生反应，而~20 kD亚基则无这种反应。在部分纯的CrFe蛋白中，~20 kD的蛋白含量远低于~60 kD蛋白的含量，表明由这种小亚基组成的蛋白只是CrFe蛋白中的一种污染蛋白。用3,5-二氨基苯甲酸染色的天然电泳表明，形成砖红色和棕色晶体的蛋白是迁移率不同的两种含铁蛋白。质谱分析表明，该晶体蛋白为棕色固氮菌的细菌铁蛋白（AvBF）。分辨率为2.34 Å的X-射线衍射结果也表明，砖红色晶体属于H3空间群，晶胞参数为a = 124.965 Å, b= 124.965 Å 和 c = 287.406 Å。首次完成的结构解析也表明，这种砖红色晶体确为24聚体的AvBF。 关键词：棕色固氮菌突变种DJ35和UW3; ΔnifE Av1; 铬铁蛋白; 细菌铁蛋白; 纯化和特性; 体外激活组装; 晶体生长及组成鉴定

缺失nifZ的棕色固氮菌突变株DJ194的钼铁蛋白研究—纯化、结晶及金属簇的组成与分布

从棕色固氮菌DJ194菌株得到的固氮酶粗提液经DEAE－52、Sephacryl S－200及Q－Sepharose等柱厌氧层析，分离纯化得到nifZ基因缺失的固氮酶MoFe蛋白（ΔnifZ Av1）制备物。通过天然电泳和SDS变性电泳发现早期纯化所得的ΔnifZ Av1制备物中残存相当比例的三个主要污染蛋白：属于热激蛋白60家族（Hsp 60 family）成员的分子伴侣GroEL、糖酵解过程的一个多功能酶——6-磷酸葡萄糖异构酶（6-Phosphate Glucose Isomerase，PGI）及棕色固氮菌细菌铁蛋白（Bacterioferritin，Bfr）。初步鉴定表明，它们分别为由约55kD亚基组成的14聚合体，62kD亚基组成的10聚体和20kD亚基组成的24聚体。首次发现PGI有如此高的聚合体。虽然GroEL和PGI在天然电泳中的迁移率小于ΔnifZ Av1蛋白，但它们的亚基在SDS变性电泳中与ΔnifZ Av1亚基具有相似的迁移率，互相重叠，从而使变性电泳比天然电泳显出更高的ΔnifZ Av1纯度;而细菌铁蛋白虽然不会在变性电泳中污染ΔnifZ Av1，但往往会在ΔnifZ Av1制备物的结晶中优先或较多地结晶出来,从而给它的晶体生长和解析研究带来干扰（Zhao等，2004）。 通过Sephacryl S－200柱洗脱峰收集精度的调整及Q－Sepharose柱的NaCl浓度梯度洗脱，得到了纯度大于90%的ΔnifZ Av1制备物。它的厌氧天然电泳及其免疫印渍（Western blotting），以及SDS-变性凝胶电泳显出，ΔnifZ Av1的电泳迁移率、分子量和亚基组成等均与野生种钼铁蛋白（OP Av1）相似，表明nifZ基因缺失并未改变ΔnifZ Av1的α2β2四聚体构成。ΔnifZ Av1的Mo含量、EPR信号（g≈4.3, 3.65和2.01）和520-660 nm附近的圆二色摩尔消光系数（Δε）也都与OP Av1较相似，从而表明ΔnifZ Av1含有与OP Av1数量相当的具有3/2自旋态的还原FeMoco。然而，ΔnifZ Av1的Fe含量和对底物（C2H2、H+和N2）的还原活性都较低, 分别约为OP Av1的74%和46-50%;而反映P-cluster状况的450nm附近的Δε也明显低于OP Av1。此外，与OP Av1相同的ΔnifZ Av1在g≈2.01的EPR信号却与推测含由双[4Fe-4S]簇组成的P-cluster前体的His-tagged ΔnifZ Av1（Hu等，2004）的信号明显不同。这就表明，ΔnifZ Av1与OP Av1的差别不在于FeMoco的结构、含量和氧还状态，也不在于P-cluster的结构和氧还状态，而仅在于ΔnifZ Av1中P-cluster数目的减少（约一半）。据此推测出与国外提出的His-tagged ΔnifZ Av1模型不同的ΔnifZ Av1(DJ194)的如下结构模型。一个αβ亚基对含有一个FeMoco和一个P-cluster，而另一个αβ亚基对只含FeMoco，其P-cluster区域则是空的。由于nifZ基因的缺失只造成了钼铁蛋白中两个P-cluster中的一个不能组装，因此推测P-cluster的组装可能不是受单一基因产物的影响。根据Lee等（1998）对nifZ产物（NifZ）和nifW产物（NifW）可以形成[NifWx-NifZy]多聚体，并可能是通过同一途径来影响固氮酶的合成的研究，提出NifZ的如下的可能作用机理。[NifWx-NifZy]多聚体影响与P-cluster合成相关的金属簇(如[4Fe-4S])的进入和P-cluster的最终合成，而其中的一个αβ对上的P-cluster的形成可能较多的受到NifZ的影响;nifZ的某些突变或缺失虽然不影响[NifWx-NifZy]多聚体的形成，但对于更依赖于NifZ的那个αβ对上的P-cluster的合成可能会产生不同的影响。 对这一高纯度的ΔnifZ Av1制备物结晶的研究表明，使用Tris缓冲系统的25%PEG 6K/MgCl2晶体培养液可以在较短的晶体培养时间内得到较大的晶体;在一定条件下，pH为7.5和8.3的培养液对出晶数和晶体大小的影响不明显;PEG 6K的浓度与MgCl2的浓度对出晶大小的影响有一定的相关性，即较低的PEG浓度在较低的MgCl2浓度下和较高的PEG浓度搭配较高的MgCl2浓度较易长出较大的晶体。虽然ΔnifZ Av1制备物的纯度达到90%以上，并且在染铁实验中表明其基本不含细菌铁蛋白，但我们在对得到的晶体进行电泳鉴定中仍然发现了一种与以前报导的砖红色晶体不同的深棕红色的细菌铁蛋白晶体，之所以颜色不同可能和所含的铁元素的氧化状态有关。不过在所鉴定的5支结晶管中只在一个管内发现了与固氮酶晶体同时存在的这种细菌铁蛋白晶体，说明通过蛋白纯度的提高减少细菌铁蛋白的含量以及晶体培养条件的优化，细菌铁蛋白晶体形成的几率就可大大降低。

G蛋白在松类植物花粉管发育中的亚细胞定位及调控机制

G蛋白参与了哺乳动物内多种细胞信号途径，但其在植物花粉萌发和花粉管发育过程中的细胞学定位、生化特性及功能研究比较滞后，有关这方面的研究报道较少。在显花植物授粉受精过程中，具顶端极性生长特性的花粉管是雄性生殖单位的载体，也是研究细胞生长分子调控机理的理想体系。与被子植物相比，裸子植物具有生长周期长，花粉管生长缓慢、易分叉等特点，具有不同于被子植物花粉发育的独特发育模式。对于裸子植物花粉萌发和花粉管生长的调控机理，目前尚不十分清楚。本文以松类植物中比较有代表性的裸子植物青杆（Piceawillsonii）和白皮松(Pinus bungeana)花粉为试材，应用免疫分析和间接免疫荧光显微镜技术，结合药理学实验和FTIR手段，研究了异三聚体G蛋白和小G蛋白在花粉管细胞中的定位、生化特性及其在花粉管发育中的调控作用。结果如下： 应用Western Blotting技术和来自于抗哺乳动物中不同序列G蛋白O【亚基抗体，我们在白皮松花粉管中检测到一条分子量为40 kDa左右的蛋白。去污剂处理显示，该蛋白与质膜偶联。间接免疫荧光显微镜实验发现，在花粉管发育的整个时期，代表Ga蛋白的荧光均一的分布在整个质膜区域，尤其在尖端皮层区域荧光最亮，显示此处该蛋白浓度最高。无论是在正常发育的花粉管抑或是发生弯曲或扭曲生长的花粉管，均呈现同样的分布模式。随着花粉管发育，Ga蛋白表达量发生变化。在花粉管发育中期，Ga蛋白表达量比较高;随着花粉管离体培养时间的延长，Ga蛋白表达量下降。另外，在花粉刚刚萌发时，Ga蛋白表达量也比较低。 对白皮松花粉萌发进行的药理学实验显示，G蛋白调节剂 CTX和PTX对白皮松花粉管的影响呈现双阶段效应。当添加的药剂浓度小于400 ng mL-I时，无论CTX还是PTX均抑制了花粉萌发和花粉管生长，且花粉管容易破裂;而当二者浓度分别升至500 ng mL-I时，同对照相比，花粉管生长明显受到促进。这一结果不支持Ma等人在百合花粉中的研究结果。进一步应用FTIR技术分析发现，当用浓度为400 ng mL-I CTX或PTX处理花粉管时，花粉管细胞壁酚类物质增加，而纤维素、半纤维素、木聚糖等物质下降，这可能是导致此浓度处理下花粉管易破裂的原因。这些结果显示了G蛋白a亚基参与了白皮松花粉管生长，CTX和PTX可能通过下游对其敏感的功能蛋白而非Ga本身，影响着花粉管生长并调控着花粉管壁的建成。 利用来源于烟草的抗NtRacl抗体和拟南芥的抗ROPs抗体，应用WeternBlotting技术，我们在青杆花粉管中检测到分子量为23kDa的多肽。间接免疫荧光显微镜实验显示，在花粉萌发18和24小时后，Rac蛋白主要定位于花粉管尖端质膜区域，时而会延伸到顶端两侧区域，但从尖端到基部存在浓度梯度，这种分布模式多在花粉管发育的后期观察到。Rac蛋白在青杆花粉管不同发育时期的分布模式变化可能和花粉管的生长状态有关，在花粉管发育早期和中期，正是花粉管旺盛生长期，Rac蛋白的尖端定位保证了花粉管的极性生长。对Rac蛋白在花粉管的分布进行的连续切片扫描发现，Rac蛋白不但分布在质膜上，并与质膜偶联，而且在胞质中亦有分布。通过对一系列正常发育（即极性生长的花粉管）和畸形发育的花粉管进行观察发现，Rac蛋白主要分布在旺盛生长的花粉管尖端质膜或离顶端20 Vm处，在分叉的生长缓慢的分枝端分布较少。而在那些发生分叉生长的花粉管中，处于次要位置的基本停止生长的分枝端几乎没有Rac蛋白存在。在顶端发生膨大的花粉管中，Rac蛋白均匀分布在花粉管整个质膜上，丧失浓度梯度，失去极性生长。这些结果显示了Rac蛋白参与了青杆花粉管生长。 应用抗NtRacl抗体进行的间接免疫荧光显微镜定位实验，我们在正在生长的花粉管的管核中观察到明亮的荧光，显示了有Rac蛋白的存在。当精细胞在花粉粒中未移动到花粉管中时，几乎没有观察到荧光信号。随着花粉管发育，两个精细胞的位置发生变化，当其中一个较大的精细胞移动到花粉管中时，观察到明亮的荧光信号，这些结果显示了Rac蛋白可能参与了管核或精细胞在花粉管内的移动。

光敏核不育水稻中光敏色素的分析

本文报道了在育性转换敏感期光周期处理对光敏核不育水稻（农垦58S）及农垦58最新全展叶中光敏色素Ⅰ(PhyA)水平的影响PartI）．在10个光周期处理的最后一个暗期结束前,收获每株水稻的最上部二叶。PhyA用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定。 结果表明：0.5%(v／v)聚乙烯亚胺(PEI)可除去水稻叶片粗提液中干扰ELISA的物质;所用的ELISA专一性地检测水稻PhyA。和长日照(LD)处理相比，短日照(SU)处理导致农垦58S中PhyA的相对含量增加38.5%;而农垦58只增加18.5%。显然，在较长的暗期条件下（SD），农垦58S中PhyA的合成比农垦58快。SD处理下大量增加的PhyA可能和农垦58S的育性恢复有关。 上述结果也说明：在同一品种甚至不同品种的植株间，PhyA水平均易受光周期影响而剧烈变化。 为了进一步验证农垦58S中PhyA较快积累的推论，比较了农垦58s和农垦58幼苗（三叶期）在一延长暗期(24h)中PhyA的积累时程。和育性转换敏感期的植株相似，农垦58S幼苗中PhyA积累速度快于农垦58。在暗期开始6h后，这种差异更明显。这一结果证实了过去的假设：甲基化水平低的农垦58PhyA基因可能比农垦58PhyA基因更活跃地表达。 PhyA和PhyB同时存在于水稻叶片中。为了探讨PhyB是否参与农垦58S雄性不育的调节，在育性转换敏感期每日光期结束、暗期开始开始前进行短暂的FR照射实验(即end-of- dayFR irradiations)。EOD FR反应应由PhyB介导。和SD下的对照相比，经过10次EODFR处理(EOD FR+SD)的农垦58S植株抽穗和开花期都相应地推迟2天，而花粉败育率和种子结实率都没有变化。 EODFR处理抑制了农垦58的开花，但花粉育性几乎不受影响。 综上所述，可能是PhyA而不是PhyB参与调节农垦58S的雄性不育。 另外，本文采用免疫印迹(Immunoblotting or Western blotting)比较了农垦58S和农垦58黄化苗(3天龄)中PhyA的相对含量(PartⅡ)。 结果表明，RPA可以专一性地检测两品种中120KD多肽。该肽在照射R或FR后对内源蛋白酶水解的敏感性不同，照射FR后，该肽易降解产生116KD的片段;照射R后，相对较稳定。因此，上述120KD多肽是水稻PhyA。未观察到农垦58S和农垦58的PhyA在免疫原性、分子量及内源蛋白酶解水解带型有差异。定量分析表明农垦58s黄化苗中PhyA的相对含量比农垦58多40%。这一结果和上述光周期处理的结果是相辅相成的。由于干种子、以及吸涨36h以前的水稻胚中均检测不PhyA的存在，因此两品种间PhyA含量的差异是PhyA蛋白重新合成的结果。 活体低温(80K)荧光光谱分析表明：农垦58黄化苗（3天龄）具有典型光敏色素(主要为PhyA）的荧光发射，其最大波长为683.8nm，而农垦58S以及由其转育来的培矮64s都缺少明显的光敏色素峰。显然，农垦58S和农垦58的PhyA荧光光谱特性有所不同。这一差异是否和雄性不育有关仍待深入研究。 本文第三部分比较了农垦58S和农垦58黄化苗（6天龄）最初转到白光下(4h)合成叶绿素的情况。无论是短暂红光(R)处理或对照，农垦58幼苗合成叶绿素的量（在白光下4h）都多于农垦58S。由于R促进叶绿素合成的效果可被随后的远红光照射(FR)逆转，因此水稻幼苗中叶绿素合成是在光敏色素的控制下。FR逆转性在农垦58S中似乎更完全。连续FR（12h最有效）促进叶绿素合成的效果在农垦58S中更明显，但叶绿素合成的量（在白光下4h）仍是农垦58多。然而，对于自然光周期下生长的幼苗（2-4叶期），农垦58S的叶绿素含量明显高于农垦58。文中讨论了这种差异的可能原因。

Cyt b-559 链Arg18和Ser24的定点突变及其对PSII功能的影响

Cyt b-559是光系统II反应中心的成分之一，它由亚基和亚基组成的。在Cyt b-559中，血红素辅基与两个亚基中的组氨酸连接成有功能的蛋白，并维持PSII的功能稳定性。前人曾将与血红素相连的His突变，导致Cyt b-559功能和PSII稳定性的丧失。基于此研究，本文采用定点突变技术，将亚基中与His23位置最近的上游氨基酸Arg18分别用Gly和Glu取代，下游氨基酸Ser24用Phe取代，获得了衣藻Cyt b-559的突变体。对突变体的分析，有以下新结果：突变体都能进行光合自养，但无论在异养培养基上还是自养培养基上，和对照相比，其生长速度非常缓慢; PSII的活性分析，表明PSII的放氧活性为野生衣藻细胞的50%～80%， Fv/Fm 的荧光参数为40%～70%;对突变体进行强光（1000μE•m-2•s-1）照射，10min后，其放氧活性都降低为0，而野生型衣藻还保持35%的活性;提取类囊体膜蛋白，进行SDS-PAGE电泳和Western-blotting分析，显示突变体的膜蛋白与对照无显著差异。这些结果说明对围绕血红素环境的固有氨基酸的改变，虽然并没有明显影响类囊体膜蛋白的表达和组成，但是却影响了衣藻细胞的生长和PSII的活性，增加了衣藻细胞对强光的敏感性，降低了衣藻细胞自身的光保护能力。这说明靠近血红素配位环境的氨基酸Arg和Ser，尤其是Arg，对Cyt b-559的功能维持不可缺少，对于维持PSII的活性也很重要。

盐胁迫对螺旋藻光合作用影响的研究

盐胁迫是限制高等植物和藻类生长和产量的主要环境因子之一。PSII对环境胁迫的响应被认为是光合作用适应逆境过程中最重要的一个环节。尽管盐胁迫对PSII的影响已进行了大量的研究，但有关盐胁迫对PSII作用方式和位点的研究仍存在着争议。我们主要研究了盐胁迫对螺旋藻PSII结构和功能的影响，以探讨盐胁迫对PSII的作用方式和位点以及该藻细胞PSII对盐胁迫的适应机理。主要研究结果如下： 1． 用0、0.2、0.4、0.6、0.8M NaCl处理螺旋藻细胞12小时。随盐浓度的增加，螺旋藻细胞的Chla、carotenoid、PC、APC及蛋白含量均呈下降趋势，说明盐胁迫抑制了上述色素及蛋白的合成或加速了它们的降解，从而影响了螺旋藻的光合作用。 2． 随盐浓度的增加，螺旋藻细胞光合放氧活性和PS II电子传递活性显著降低，表明盐胁迫引起藻细胞PS II活性的下降。 3． 通过放氧活性、热致发光（TL）、多相荧光瞬态上升动力学曲线的测定以及Western 杂交，来探讨盐胁迫对螺旋藻细胞PS II供体侧电子传递及OEC33蛋白含量的影响。结果显示：随盐浓度的增加，螺旋藻细胞光合放氧活性和PS II电子传递活性下降;TL B-band和Q-band强度降低，在0-0.6M NaCl下，B-band的周期性振荡清楚，最大值出现在第二次和第六次闪光，而在0.8M NaCl时，S态振荡基本上消失，S 态氧化还原循环受阻;Fm， J、I和P相荧光水平降低。以上结果都表明盐胁迫使PS II的放氧侧受损伤。且随盐浓度的增加，盐分引起螺旋藻细胞外周蛋白OEC33的降解，在蓝藻中首次提出放氧机构的S态循环受阻，放氧活性降低。 4． 通过OJIP曲线的测定以及JIP-test、闪光诱导的可变荧光衰减动力学、热致发光（TL）的分析，我们研究了盐胁迫对螺旋藻细胞PS II受体侧的影响。结果显示： JIP-test的参数Ψo和φEo随盐浓度的增加而下降,显示QA-到QB 电子传递受阻;可变荧光衰减动力学快相组分半衰期延长，所占总可变荧光百分比下降，表明QA-到QB 电子转移变慢，中相组分半衰期延长、所占百分比下降，说明空的QB位点对PQ的结合减慢，有可能PQ分子对QB位点的结合能力下降;TL B-band和Q-band的峰温度出现了位移，可能QA、QB的氧化还原电势发生了改变。以上结果表明，盐胁迫伤害了PSII受体侧的电子传递。 5． 首次运用闪光诱导下的叶绿素荧光上升及其衰减动力学来研究盐胁迫对PS II受体侧的影响。 6． 盐胁迫下，PS II供体侧和受体侧电子传递受抑制，有活性的PSII反应中心数量下降，说明盐胁迫对螺旋藻细胞PSII的伤害也可能是多位点的作用方式。此外，盐胁迫下，藻细胞放氧活性的下降快于受体侧QA 到QB电子传递所占百分比的下降，有可能PS II放氧侧先受损伤，然后是反应中心和受体侧。上述结果表明盐胁迫下PSII活性的降低是由于PSII供体侧和受体侧电子传递的抑制，有活性的PSII反应中心的减少。 7． 借助螺旋藻类囊体膜的Western杂交分析，来研究盐胁迫对螺旋藻类囊体膜PSII相关蛋白的影响。结果表明，上述PSII活性的抑制是由于类囊体膜蛋白的损失。主要与PSII反应中心CP43、CP47和OEC33蛋白含量的下降有关。 8． PS II机构对盐胁迫的适应涉及以下几个方面：降低吸收横截面，（PC/chla，APC/chla比值的降低）;光系统II光化学反应的改变，通过关闭的PS II反应中心比例的增加，使得PS II机构免于过多激发能的伤害而得以保护;提高了剩余的有活性反应中心的耗能效率（DIo/RC增加）;保持有活性反应中心高的激发能转化效率，比如，TRo/RC保持不变;另外，随盐浓度的增加，由藻胆体向光系统I的能量传递增加，避免过量激发能对 PSII的伤害，使螺旋藻细胞适应盐胁迫环境。

GPIb is involved in platelet aggregation induced by mucetin, a snake C-type lectin protein from Chinese habu (Trimeresurus mucrosquamatus) venom

Mucetin (Trimeresurus mucrosquamatus venom activator, TMVA) is a potent platelet activator purified from Chinese habu (Trimeresurus mucrosquamatus) venom. It belongs to the snake venom heterodimeric C-type lectin family and exists in several multimeric forms. We now show that binding to platelet glycoprotein (GP) lb is involved in mucetin-induced platelet aggregation. Antibodies against GPIb as well as the GPIb-blocking C-type lectin echicetin inhibited mucetin-induced platelet aggregation. Binding of GPIb was confirmed by affinity chromatography and Western blotting. Antibodies against GPVI inhibited convulxin- but not mucetin-induced aggregation. Signalling by mucetin involved rapid tyrosine phosphorylation of a number of proteins including Syk, Src, LAT and PLCgamma2. Mucetininduced phosphorylation of the Fcgamma chain of platelet was greatly promoted by inhibition of alpha(llb)beta(3) by the peptidomimetic EMD 132338, suggesting that phosphatases downstream Of alpha(llb)beta(3) activation are involved in dephosphorylation of Fcgamma. Unlike other multimeric snake C-type lectins that act via GPIb and only agglutinate platelets, mucetin activates alpha(llb)beta(3). Inhibition Of alpha(llb)beta(3) strongly reduced the aggregation response to mucetin, indicating that activation Of alpha(llb)beta(3) and binding of fibrinogen are involved in mucetin-induced platelet aggregation. Apyrase and aspirin also inhibit platelet aggregation induced by mucetin, suggesting that ADP and thromboxaneA(2) are involved in autocrine feedback. Sequence and structural comparison with closely related members of this protein family point to features that may be responsible for the functional differences.

Characterization of acid-sensing ion channels in dorsal horn neurons of rat spinal cord

Acid-sensing ion channels (ASICs) are ligand-gated cation channels activated by extracellular protons. In periphery, they contribute to sensory transmission, including that of nociception and pain. Here we characterized ASIC-like currents in dorsal horn neurons of the rat spinal cord and their functional modulation in pathological conditions. Reverse transcriptase-nested PCR and Western blotting showed that three ASIC isoforms, ASIC1a, ASIC2a, and ASIC2b, are expressed at a high level in dorsal horn neurons. Electrophysiological and pharmacological properties of the proton-gated currents suggest that homomeric ASIC1a and/or heteromeric ASIC1a + 2b channels are responsible for the proton-induced currents in the majority of dorsal horn neurons. Acidification-induced action potentials in these neurons were compatible in a pH-dependent manner with the pH dependence of ASIC-like current. Furthermore, peripheral complete Freund's adjuvant-induced inflammation resulted in increased expression of both ASIC1a and ASIC2a in dorsal horn. These results support the idea that the ASICs of dorsal horn neurons participate in central sensory transmission/modulation under physiological conditions and may play important roles in inflammation-related persistent pain.

Nuclear matrix of the most primitive eukaryote Archezoa

Accumulating evidence suggests that unicellular Archezoa are the most primitive eukaryotes and their nuclei are of significance to the study of evolution of the eukaryotic nucleus. Nuclear matrix is an ubiquitous important structure of eukaryotic nucleus; its evolution is certainly one of the most important parts of the evolution of nucleus. To study the evolution of nuclear matrix, nuclear matrices of Archezoa are investigated. Giardia lamblia cells are extracted sequentially. Both embedment-free section EM and whole mount cell EM of the extracted cells show that, like higher eukaryotes, this species has a residual nuclear matrix in its nucleus and rich intermediate filaments in its cytoplasm, and the two networks connect with each other to form a united network. But its nuclear matrix does not have nucleolar matrix and its lamina is not as typical as that of higher eukaryotes; Western blotting shows that lamina of Giardia and two other Archezoa Entamoeba invadens and Trichomonas vaginali all contain only one polypeptide each which reacts with a mammalia anti-lamin polyclonal serum and is similar to lamin B (67 ku) of mammlia in molecular weight. According to the results and references, it is suggested that nuclear matrix is an early acquisition of the eukaryotic nucleus, and it and the "eukaryotic chromatin" as a whole must have originated very early in the process of evolution of eukaryotic cell, and their origin should be an important prerequisite of the origin of eukaryotic nucleus; in the iamin (gene) family, B-type lamins (gene) should be the ancestral type and that A-type lamins (gene) might derive therefrom.

SECRETORY MONOCLONAL IGA ANTIBODY TO HUMAN SPERM PRODUCED BY GASTROINTESTINAL IMMUNIZATION INHIBITS HUMAN SPERM ACTIVITY AND MOUSE INVITRO FERTILIZATION

BALB/c mice were immunized intragastrically with human sperm. Cells from the Peyer's patches and spleens of the immunized mice were for the preparation of hybridomas secreting antisperm monoclonal IgA (mcIgA). The specific ratio of IgA-secreting cells in Peyer's patches was much higher than that in spleen. The binding site on human sperm of 9 of 19 mcIgA was in the post-acrosomal region using an immunofluorescent assay. Two of eight selected mcIgA caused strong human sperm agglutination and three of them produced significant inhibition of mouse in vitro fertilization. No mcIgA tested caused obvious human sperm immobilization or inhibited mouse in vivo fertilization. In vitro assembly of selected mcIgA in ascites with mouse secretory component (SC) caused no significant changes in effects on sperm function and in vitro fertilization. By use of Western blotting, dimer or higher polymers were demonstrated in all selected mcIgAs and corresponding protein antigens in 6 of 8 selected mcIgAs. These results suggest that human sperm function may be inhibited and fertilization rate reduced by specific secretory IgA to human sperm and that secretory immunity to protein antigens of human sperm could be induced by intragastrointestinal immunization.

Rana grylio virus thymidine kinase gene: an early gene of iridovirus encoding for a cytoplasmic protein

The presence of thymidine kinase (TK) is a feature of many large DNA viruses. Here, a TK gene homologue was cloned and characterized from Rana grylio virus (RGV), a member of family Iridoviridae. RGV TK encodes a protein of 195 aa with a predicted molecular mass of 22.1 kDa. Homologues of the protein were present in all the currently sequenced iridoviruses, and phylogenetic analysis showed that it was much close to cellular TK type 2 (TK2), deoxycytidine kinase (dCK) and deoxyguanosine kinase (dGK). Subsequently, Western blotting revealed TK expression increased with time from 6 h post-infection in RGV-infected cells. Using drug inhibition analysis by protein synthesis inhibitor (cycloheximide) and DNA replication inhibitor (cytosine arabinofuranoside), RGV TK was classified as the early expression gene during in vitro infection. Subcellular localization by TK-GFP fusion protein expression and immunofluorescence staining showed RGV TK was an exclusively cytoplasmic protein in fish cells. Collectively, current data indicate that RGV TK was an early gene of iridovirus which encoded a cytoplasmic protein in fish cells.

In vivo study on the effects of microcystin extracts on the expression profiles of proto-oncogenes (c-fos, c-jun and c-myc) in liver, kidney and testis of male Wistar rats injected i.v. with toxins

Microcystins (MCs) are a potent liver tumor promoter, possessing potent tumor-promoting activity and weak initiating activity. Proto-oncogenes are known to be involved in the tumor-promoting mechanisms of microcystin-LR. However, few data are available on the effects of MCs oil proto-oncogenes in the whole animal. To investigate the effects of MCs on the expression profile of the proto-oncogenes in different organs, male Wistar rats were injected intravenously with microcystin extracts at a dose of 86.7 mu g MC-LR eq/kg bw (MC-LR eq, MC-LR equivalents). mRNA levels of three proto-oncogenes c-fos, c-jun and c-myc in liver, kidney and testis were analyzed using quantitative real-time PCR at several time points post-injection. Significant induction of these genes at transcriptional level was observed in the three organs. In addition, the increase of mRNA expression of all three genes was much higher in liver than in kidney and testis. Meanwhile, the protein levels of c-Fos and c-Jun were investigated by western blotting. Both proteins were induced in the three organs. However, elevations of protein levels were Much lower than those of mRNA levels. These findings suggest that the expression of c-fos, c-jun and c-myc might be one possible mechanism for the tumor-promoting activity and initiating activity of microcystins. (c) 2008 Published by Elsevier Ltd.