Stejnulxin, a novel snake C-type lectin-like protein from Trimeresurus stejnegeri venom is a potent platelet agonist acting specifically via GPVl

Stejnulxin, a novel snake C-type lectin-like protein with potent platelet activating activity, was purified and characterized from Trimeresurus stejnegeri venom. Under non-reducing conditions, it migrated on a SDS-polyacrylamide gel with an apparent molecular mass of 120 kDa. On reduction, it separated into three polypeptide subunits with apparent molecular masses of 16 kDa (alpha), 20 kDa (beta(1)) and 22 kDa (beta(2)), respectively. The complete amino acid sequences of its subunits were deduced from cloned cDNAs. The N-terminal sequencing and cDNA cloning indicated that beta(1) and beta(2) subunits of stejnulxin have identical amino acid sequences and each contains two N-glycosylation sites. Accordingly, the molecular mass difference between 1 and 2 is caused by glycosylation heterogenity. The subunit amino acid sequences of stejnulxin are similar to those of convulxin, with sequence identities of 52.6% and 66.4% for the U. and beta, respectively. Stejnulxin induced human platelet aggregation in a dose-dependent manner. Antibodies against UNA inhibited the aggregation response to stejnulxin, indicating that activation of alpha(IIb)beta(3) and binding of fibrinogen are involved in stejnulxin-induced platelet aggregation. Antibodies against GPIbalpha or alpha(2)beta(1) as well as echicetin or rhodocetin had no significant effect on stejnulxin-induced platelet aggregation. However, platelet activation induced by stejnulxin was blocked by anti-GPVI antibodies. In addition, stejnulxin induced a tyrosine phosphorylation profile in platelets that resembled that produced by convulxin. Biotinylated stejnulxin bound specifically to platelet membrane GPVI.

大蹼铃蟾皮肤膜联蛋白Ⅱ相关蛋白的分离纯化及活性

通过阴离子交换、凝胶过滤和阳离子交换层析, 从大蹼铃蟾皮肤中纯化到一个表观分子量为33 kDa 的单链蛋白。N - 末端序列比较分析显示, 该蛋白与来自非洲爪蟾、红色原鸡和人膜联蛋白Ⅱ的N - 末端序列 相同的氨基酸分别占70 %、64 %和56 %。该蛋白具有以钙依赖的方式抑制专一性血小板膜糖蛋白Ⅵ受体激动剂 ———Stejnulxin 诱导洗涤人血小板聚集的生物学功能, 最大抑制率达48 %。结合其N - 末端序列BLAST 搜索结 果及其活性的钙依赖性, 推测该蛋白是与膜联蛋白Ⅱ相关的一类蛋白质。

Bm-TFF2, a trefoil factor protein with platelet activation activity from frog Bombina maxima skin secretions

In mammals, trefoil factor family (TFF) proteins are involved in mucosal maintenance and repair, and they are also implicated in tumor suppression and cancer progression. A novel two domain TFF protein from frog Bombina maxima skin secretions (Bm-TFF2) has been purified and cloned. It activated human platelets in a dose-dependent manner and activation of integrin a(11b)beta(3) was involved. Aspirin and apyrase did not largely reduce platelet response to Bm-TFF2 (a 30% inhibition), indicating that the aggregation is not substantially dependent on ADP and thromboxane A2 autocrine feedback. Elimination of external Ca2+ with EGTA did not influence the platelet aggregation induced by Bm-TFF2, meanwhile a strong calcium signal (cytoplasmic Ca2+ release) was detected, suggesting that activation of phospholipase C (PLC) is involved. Subsequent immunoblotting revealed that, unlike in platelets activated by stejnulxin (a glycoprotein VI agonist), PLC gamma 2 was not phosphorylated in platelets activated by Bm-TFF2. FITC-labeled Bm-TFF2 bound to platelet membranes. Bm-TFF2 is the first TFF protein reported to possess human platelet activation activity. (c) 2005 Elsevier Inc. All rights reserved.

眼镜王蛇泛素融合蛋白和核糖体蛋白L30的分子克隆与分析及大蹼铃蟾膜联蛋白A2样蛋白的纯化与活性研究

本论文分为两个部分。第一部分利用分子生物学手段对广西产眼镜王蛇（OPhiophagushannah）泛素融合蛋白基因和核糖体蛋白L30基因进行了克隆及分析；第二部分利用生物化学手段对大蹼铃蟾（Bombinamaxima）膜联蛋白A2样蛋白进行了初步研究。首先，从广西产眼镜王蛇毒腺中抽提总RNA，经mRNA纯化后构建眼镜王蛇毒腺。DNA文库，得到大概1.8*105个独立的克隆。从所构建的cDNA文库中，我们随机筛选200个克隆测序，得到两个在进化上高度保守的基因：泛素融合蛋白基因（GenBahk登录号为AF297036）和核糖体蛋白L30基因（GenBank登录号是AF297033）。前者cDNA的开放阅读框为387bp，后者为348bp。前者编码128个氨基酸残基组成的泛素融合蛋白前体；后者编码1巧个氨基酸残基组成的核糖体蛋白L30前体。由cDNA序列推导出的氨基酸序列分析表明，泛素融合蛋白前体包括N-末端的泛素结构域（76个氨基酸残基）和C-末端的核糖体蛋白L40结构域（52个氨基酸残基）。该蛋白为一高碱性蛋白，C末端含有一个"锌指"结构域。与16个物种比较的结果表明，眼镜王蛇与脊椎动物的泛素融合蛋白氨基酸序列相似度较高，具有高度的保守性。我们克隆到的眼镜王蛇泛素融合蛋白基因和核糖体蛋白L30基因为泛素家族和核糖体家族提供新的序列信息，有助于深入研究泛素蛋白和核糖体蛋白的结构、功能以及与其他物种的类似分子之间的相互关系。其次，通过阴离子交换，凝胶过滤和阳离子交换层析我们从大蹼铃蟾皮肤匀浆物中纯化了一个表观分子量为33000Da的单链蛋白，N-末端序列比较分析显示它与脊椎动物膜联蛋白AZ亚群有较高的同源性，与来自非洲爪蟾、红色原鸡和人膜联蛋白AZ序列的annexin核心的第一个重复区结构域序列一致性分别为78.9％、89％和68％，因此命名为大蹼铃蟾膜联蛋白AZ样蛋白（BAllLP）。BAllLP具有钙依赖性的抑制专一性血小板膜受体GPVI激动剂一Stejnulxin诱导人血小板聚集的生物学功能。

大蹼铃蟾(Bombina maxima)皮肤新型血小板活性蛋白及信号转导的研究

通过对两栖类动物大蹼铃蟾（B朋b了na勿日对朋）皮肤分泌物及匀浆物的分离，纯化，从其碱性组分中得到了全新的三叶因子多肤（BIn－－TFFZ）和膜联蛋白H相关蛋白（BAIIRP），它们分别具有诱导或抑制人血小板活化的全新功能。以血小板膜糖蛋白GPVI受体激动剂stejnulxin为对照，研究了Bm一TFFZ活化人血小板的信号传导途径。哺乳动物的三叶因子（TFF）蛋白的主要功能在于通过修复粘膜损伤，维持粘膜层的完整。它们在肿瘤抑制及癌症侵润方面也有一定程度的作用。我们从两栖类动物大蹼铃蟾皮肤分泌物分离，纯化而得到了一个全新的三叶因子多肤（Bm一TFFZ）。它是单亚基蛋白，表观分子量为13000，并具有全新的诱导人血小板活化的功能，我们研究了其诱导人血小板活化的活性的量效关系。它对血小板的激活涉及血小板整合素a：Ibp3的活化，Bm一TFFZ可诱导经阿斯匹林及三磷酸腺昔"双磷酸酶（Apyrase）处理的血小板的聚集，表明B，TFFZ的活性不依赖于血小板的ADP及血栓嗯烷A2（TXAZ）的自泌正反馈。F工TC标记的B爪一TFFZ蛋白能与血小板膜结合。通过专一性药理学抑制剂的研究，我们初步排除了Bm一TFFZ蛋白作用于血小板膜已知的G一蛋白偶联受体（如ADP，TXAZ及血小板活化因子受体）的可能性。以血小板GPVI激动剂stejnulxin为对照，我们仔细研究了Bm一TFFZ蛋白刺激血小板后的信号传导分子事件，发现其酪氨酸磷酸化图谱明显不同于血小板GPVI激动剂5tejnu1X如，尤其是磷脂酶CYZ并不磷酸化。因此，我们认为Bm一TFFZ蛋白激活血小板的信号传导通路是活化磷脂酶C，并刺激胞内钙离子的释放，活化血小板伪：。p3，进而导致血小板的聚集。从Bm－－TFFZ蛋白的cDNA克隆序列推知它由104个氨基酸组成，含有两个三叶因子结构域，与人TFFZ和非洲爪蟾xPZ序列中相同的氨基酸分别占28％及34％。为了确定两栖类的三叶因子蛋白具有诱导人血小板活化的功能，我们仔细地研究了整个分离纯化过程中所有组份的血小板聚集活性并比较了它们的相对活性差异。Bm一TFFZ是第一个来自两栖类动物的血小板激动剂，也是我们第一个报道的具有诱导血小板聚集活性的三叶因子多肤。·我们还通过阴离子交换，凝胶过滤和阳离子交换层析，从大蹼铃蟾皮肤匀浆物中纯化了一个表观分子量为33kD。的单链蛋白。N一末端序列比较分析显示，该·蛋白与来自非洲爪蟾、红色原鸡和人膜联蛋白H的N一末端序列相同的氨基酸分别占70％、64％和56％。该蛋白具有以钙依赖的方式抑制专一性血小板膜糖蛋白VI（GPVI）受体激动剂-Stejnu1Xin诱导洗涤人血小板聚集的生物学功能，最大抑制率达48％。结合其N一末端序列搜索结果及其活性的钙依赖性，推测该蛋白是与膜联蛋白H相关的一类蛋白质。

固斑蝰蛇毒C-型凝集素样蛋白Dabocetin及L-氨基酸氧化酶DRS-LAO的研究

本论文研究了从圆斑蛙蛇泰国亚种（Daboia russellii siamensis）蛇毒中纯化的C一型凝集素样蛋白Dabocetin和L一氨基酸氧化酶DRS一AO的理化性质、生物学活性和分子克隆。Dabocetin是分子量约为28扔。的异二聚体蛋白，它由分子量约为15.0kDa和14．5kDa的两个同源亚基以和p共价结合形成。N－末端氨基酸序列比较显示，Dabocetin与目前已知的蛇毒c一型凝集素样蛋白有很高的同源性。即使在终浓度达50．0。叫而时，Dabocetin也不能直接诱导血小板聚集。此外，在终浓度为40.00μg/ml时，Dabocetin几乎不能抑制由AdP，TMVA和stejnulxin诱导的血小板聚集。但是，Dabocetin呈剂量依赖地抑制瑞斯托霉素诱导的血小板凝集，其半数抑制率ICS。值为10.80ug/ml。流式细胞仪分析表明，Dabocetin显著抑制单克隆抗体522与GPIba的结合，提示Dabocetin很可能是一个GPIb结合蛋白。从圆斑蛙蛇的毒腺中克隆到了7个编码不同蛇毒C一型凝集素样蛋白亚基的七DNA（命名为DRs一1至DRs一7）。其中，DRsLS编码Dabocetin的a亚基，DRS一6编码Dabocetin的p亚基。DRs一1和DRS一2很可能是圆斑蛙蛇毒腺中表达的X因子激活剂的两条轻链LCZ和LCI的山NA。DRS一3，DRS毛4和DRSL7可能是圆斑蛙蛇毒腺中表达的C一型凝集素样蛋白p亚基的。NA。DRsLAO是一个新的L一氨基酸氧化酶，比活力为1．98U加噶。十二烷基磺酸钠一聚丙烯酞氨凝胶电泳（SDs-PAGE）分析显示，该酶在还原和非还原条件下均呈现一条蛋白带，表观分子量约为58kDa。N-末端氨基酸序列比较显示，DRS一AO与目前已知的蛇毒L一氨基酸氧化酶有很高的同源性。该酶的最适底物为L一亮氨酸，最适pH为8．8。DRs一Ao呈剂量依赖地抑制扔P和仆IvA诱导的血小板聚集，其半数抑制率ICS。值分别为32.8μg/ml和32.3μg/ml。DRS-LAO对金黄色葡萄球菌（灯Cc25923）和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有较强的抗菌作用。DRs一AO对金黄色葡萄球菌必Tcc25923）的最低抑菌浓度卿C）和最低杀菌浓度耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的孤CS。和呱Cg。值分别为18．。林留时和36.0μg/ml；DRSLAo对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的MBC50和MBCg。值分别为36.0μg/ml和72.0μg/ml。通过对DRS一AO的分子克隆，得到了编码DRS-AO的部分cDNA序列。

姚虻成功从宿主获得血餐的分子机制初探

在长期的吸血进化过程中，吸血节肢动物在唾液腺中形成了一系列有助于适应吸 血生存的活性物质，这些物质包括血管舒张分子、血小板聚集抑制分子、抗凝血分子 和其它相互作用的分子。此外，为了得到洁净的血液和防止在吸血过程中被病原微生 物感染，吸血节肢动物在其唾液腺中形成了许多防御物质以保护自身和宿主，这些物 质包括抗菌肽和蛋白酶抑制剂等。因此，研究吸血节肢动物的唾液腺重要活性物质和 转录体组学有助于弄清其吸血机制。 姚虻（Tabancus yao Macquart）是我国特有的牛虻，其雌性在产卵前需要吸食大 型哺乳动物的血液以促使卵的发育。我们希望通过对姚虻唾液腺重要活性物质和转录 体组学的研究揭示姚虻成功从宿主获得血餐的分子机制，找到具有药用前景的活性物 质和为控制该虫及其传播的疾病的提供理论基础。 首先，我们对其唾液腺匀浆物活性进行了系统分析，发现姚虻唾液腺匀浆物具有 如下活性：有抗金黄色葡萄球菌活性，并且对大肠杆菌、白色念球菌和枯草杆菌都有 效；能够抑制ADP 诱导的洗涤和富血浆血小板的聚集；能够凝集兔红细胞、能够抑制 丝氨酸蛋白酶对小肽底物的水解、具有对纤维蛋白原的水解活性（金属蛋白酶）、具 有过敏原活性、能够促进肥大细胞脱粒和组氨释放；反复检测而没有发现的活性如下： 磷脂酶A2(PLA2)活性、溶血活性、血浆凝固活性、体外抗补体、血管生长促进与抑制 活性、对小鼠脾细胞因子分泌的促进和抑制活性、抗肿瘤细胞HepG2 的生长活性。 以来源姚虻唾液腺的mRNA为材料，我们成功构建了丰度为1ｘ106的姚虻唾液腺 cDNA文库。通过对400个随机克隆的测序，我们得到了编码23种保守蛋白，44种分泌 蛋白和5种功能未知的蛋白。44种分泌蛋白中比较重要的分别是：20种抗原5相关蛋白、 2种α淀粉酶、2种麦芽糖酶、2种attactins抗菌蛋白以及血管舒张肽、过氧化物酶、 抗菌肽、透明质酸酶、mucin样蛋白和脯氨酸丰富蛋白。另外，一些不知道功能的分 泌肽也被发现,这其中包括四个与Hybomitra bimaculata的分泌肽相似性达47-82%的 多肽，这些信息有助于我们发现牛虻唾液腺活性物质和加快从知道部分氨基酸序列的 蛋白的鉴定速度，加快对姚虻从宿主获得血餐的分子机制的诠释速度。 通过分子筛、高压液相色谱等程序，我们从姚虻唾液腺中得到了一个由55 个氨 基酸组成，分子量为6 kDa，含有3 对二硫键的Kunitz 型丝氨基酸蛋白酶抑制剂TYTI。 该抑制剂与Anemonia sulcata 的蛋白酶抑制剂AsKC3 和SA5II 的成熟肽部分的同源 性达66%；并且该抑制剂，对热相对稳定；对凝乳酶、弹性蛋白酶、凝血酶、胰酶等 都有抑制作用，对胰酶的抑制常数为2.586ｘ10-4M 。 通过分子筛、高压液相色谱等程序，我们从姚虻唾液腺中得到了一分子量为7 kDa，由65 个氨基酸组成且含有3 对二硫键的防御素Taymin，它与长角血蜱的防御素的相 似性达43%，但它的第二个半胱氨酸比长角血蜱的半胱氨酸靠前一个氨基酸。该抗菌 肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和白色念球菌的最小抑菌浓度分别是: 160、80、140 和120μg/mL。 通过与分离丝氨酸蛋白酶抑制剂相同的生化分离手段,从姚虻唾液腺中得到一种 红细胞凝集素样活性物质TYML1，其能凝集原始和经胰酶、链霉蛋白酶和弹性蛋白酶 处理的A、B、O 和AB 血型的人、兔、绵羊、大鼠、小鼠、鹌鹑的红细胞, 对链霉蛋 白酶处理的鹌鹑红细胞的凝集效价比正常下降了8 倍；对热、酸、碱处理和蛋白酶降 解稳定；具有Ca2+依赖性，活性能为半乳糖胺和胎球蛋白所完全抑制。 通过分子筛、阴离子交换、高压液相色谱等程序，我们从姚虻唾液腺中分离得到 了一分子量为26 kDa,由234 个氨基酸组成，含有10 个半胱氨酸的血小板聚集抑制剂 Macquaritin-2,它与报道的所有血小板聚集抑制剂均不具有同源性，但是与双翅目昆 虫唾液腺过敏原却有一定的同源性(25%-33%),对其血小板聚集抑制活性研究发现:其 能抑制胰酶、花生四烯酸、Stejnulxin、TMVA、ADP、U46619 等激动剂诱导的血小板 聚集；血小板膜结合试验表明:其能与血小板细胞膜结合,故该血小板聚集抑制剂可能 通过作用血小板上的受体来阻止激动剂诱导血小板聚集。 通过分子筛、阳离子交换、高压液相色谱等程序，我们从姚虻唾液腺中分离得到 分子量为24-30 kDa 的两个血小板聚集抑制剂Macquaritin-3 和Macquaritin-1，它 们的N 端16 个氨基酸分别是V N Y C R L P C R G C D Y H V 和 V A V D Y L G L P G R G Y H V。通过PCR, Macquaritin-3 的核苷酸序列被得到，其推导蛋白的成熟区 和信号肽分别含有232 和23 个氨基酸。利用根据Macquaritin-1 的N 端氨基酸设计 的简并引物扩到含有V A V D Y L G L P 序列的两组核苷酸序列。它们与报道的所有 血小板聚集抑制剂均不具有同源性，但是其与双翅目昆虫的唾液腺抗原5 相关蛋白却 有一定的同源性。将所有血小板抑制剂及其相关序列和通过cDNA 文库筛选得到的抗 原5 相关序列进行分析,发现它们有很高的相似性,这种相似性介于33.3%-93.0%间, 且大部分高于50%。另外，两个血小板聚集抑制剂和一个可能的血小板抑制剂分别处 于这些抗原5 相关蛋白进化树的三个簇中。因此，我们推测这些过抗原5 相关蛋白可 能都具有血小板抑制剂活性。