毛细管电泳电化学发光的药物及生物分析研究

本论文主要研究了毛细管电泳电化学发光分离检测技术在药物及生物分析中的应用，包括以下五个方面的内容： 1. 利用毛细管电泳电化学发光连用技术分离检测临床药物丙吡胺，详细考察了影响分离和检测的各种因素，在优化的实验条件下，此方法的检测限达到2.5×10-8 mol L-1 (S/N = 3)，优于已报导的各种检测方法。该方法简单快速、高效灵敏。采取一种简单易行的液液萃取预处理，可成功用于实际加标尿样的分析。2. 发展了手性毛细管电泳电化学发光连用技术，成功实现了实际加标血浆中外消旋丙吡胺药物的手性分离。该工作首次将毛细管电泳手性分离与电化学发光检测结合起来，有一定的创新意义。与传统手性分离模式不同的是，该“非传统”手性分离模式中的毛细管进样端和出口端的缓冲溶液在种类、组成、离子强度及pH值等参数上均存在差异，不仅达到了理想的分离效果，同时实现了高灵敏的检测。3. 研究了毛细管电泳电化学发光连用技术中出现的诱导峰的成因，考察了影响诱导峰峰强度和峰位置的各种因素，提出了一种合理的机理进行成因解释。诱导峰的出现不是由于化学络合作用，而是分离缓冲溶液和注入的样品中的某些组分在动态电泳过程中所发生的物理作用导致的。4. 合成了钌配合物的电化学发光探针，基于亲和素修饰电极和蛋白质的电化学发光标记和生物素化的双重标记，实现了蛋白质的定量检测。利用碳纳米管对蛋白质强的吸附作用以及在缩合试剂存在的条件下羧酸功能化的碳纳米管可与蛋白质共价键和的双重特点，使亲和素固定到玻碳电极上；经生物素化和电化学发光探针双重标记的蛋白质分子（BSA）通过亲和素-生物素特异性相互作用结合到电极表面，在TPA存在的条件下并施加合适的扫描电位，所得到的ECL强度与蛋白质浓度在一定范围内成线性关系，从而实现蛋白质的定量测定。此普适性的方法也可成功用于溶菌酶的定量检测。5. 基于适配子的“三明治”模式和DNA的电化学发光标记，发展了一种新型的电化学发光适配子传感器，结合金纳米放大效应和巧妙的自组装过程设计，实现了凝血酶的灵敏、经济实效的检测。首先，金纳米溶胶标记的捕获适配子1固定到ITO电极上，结合上目标分子凝血酶后，另一种标记有电化学发光探针的探针适配子2也与凝血酶产生强的特异性相互作用，从而结合到电极表面上。在给定的条件下，所得ECL信号与目标分子凝血酶浓度相关，进行ECL检测，所得到的信号-浓度曲线很好地满足“三明治”反应模式的特点，检测限约为10nM。特异性考察说明此电化学发光适配子传感器对于alfa-凝血酶有着极好的选择性，而对bata，gamma-凝血酶基本无响应。

荧光假单胞菌抗铜基因簇的表达调控及其致病性分析

CopRS/CopABCD是细菌用以维持铜内环境稳定的一个系统，虽然已在荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)中发现了CopRS/CopABCD系统的同源物，但其潜在的功能还未知。本实验在一个鱼类致病菌P. fluorescens(TSS)中鉴定到了一个基因簇，由copR、copS、copC和copD组成，但缺乏copAB。copR、copS、copC和copD基因的敲除实验发现copRSCD基因簇与TSS抗铜性相关，而且copRS操纵子和copCD操纵子在转录水平上受亚抑制水平的铜诱导。双元调控系统中的调控蛋白CopR不仅激活copCD表达，而且还激活copRS的表达。凝胶滞缓实验显示CopR能直接与copCD和copRS的启动子区域结合。干扰copR的正常表达不仅影响细菌的生长，而且还影响到细菌生物膜的形成、对鱼的侵染力和在组织中的存活力。本实验还筛选到一个CopR的突变体C104，该突变体因缺失N端的信号接受域而成为一个具有组成性活性的调控蛋白，C104在TSS中表达时导致菌株的毒力降低。本实验所发现的P. fluorescens CopR与细菌致病力之间的关系以前未见报道。