产SEB金黄色葡萄球菌α-溶血毒素基因缺失菌株的构建

构建产肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB)的金黄色葡萄球菌α-溶血毒素(α-hemolysin,α-HL)缺失菌株。首先构建用于α-HL基因敲除的同源重组质粒pMHL-α,经金黄色葡萄球菌RN4220修饰后再通过原生质体转入金黄色葡萄球菌SM-01。含重组质粒pMHL-α的金黄色葡萄球菌SM-01在42℃诱导条件下培养多代,最终筛选出α-溶血毒素基因缺失菌株。经序列分析和血平板溶血实验结果证明最终获得产SEB金黄色葡萄球菌α-HL缺失菌株。为野生型金黄色葡萄球菌的体内遗传操作及构建产超抗原药物金黄色葡萄球菌基因工程菌株提供了一定的理论基础和方法。

金黄色葡萄球菌肠毒素C2的结构特征与生物学功能研究

通过PCR技术对Staphylococcal enterotoxin C2(SEC2)的氨基端和羧基端部位进行删除突变。研究结果显示删除羧基端77个氨基酸对SEC2超抗原和致热活性没有显著影响，但更进一步的删除导致SEC2活性显著降低。而少量氨基端残基删除则可导致SEC2超抗原活性显著降低，说明SEC2超抗原活性主要集中于其氨基端部位。以上研究结果也表明SEC2分子的完整性并不是其超抗原活性所必需的。 对二硫环及Zn结合位点配位组氨酸残基在SEC2分子中的生物学功能进行研究。以定点突变技术构建SEC2二硫环突变蛋白，从而干扰二硫键的形成。研究结果表明干扰二硫环形成对SEC2的超抗原、催吐和致热等活性均有显著影响，说明二硫环在维持SEC2生物学活性方面具有重要作用。此外，针对Zn结合位点配位组氨酸残基的研究结果显示突变118位和122位组氨酸后对SEC2的超抗原活性没有有显著影响，而47位组氨酸的突变导致SEC2分子的超抗原活性显著降低。动物实验结果显示分别突变118位和122位组氨酸残基后均导致SEC2分子催吐及热源活性显著降低，而47位组氨酸突变仍具有较高的催吐和致热活性。说明Zn结合位点配位组氨酸残基在SEC2的催吐、致热和超抗原活性中扮演了重要的作用，并进一步揭示肠毒素诱导的超抗原和致热活性之间没有明显的相关性。 以Leu及Glu分别替代20和22位氨基酸残基后SEC2超抗原活性有显著提高，并将具有减毒作用的组氨酸位点突变引入上述活性增强的SEC2突变，从而构建减毒突变蛋白。结果显示引入118和122位组氨酸双突变后突变蛋白保留了与SEC2相当的超抗原和抗肿瘤活性，但与SEC2相比致热活性有显著下降，为减毒SEC2超抗原药物的开发提供了可能性。 为探索金黄色葡萄球菌的体内基因突变方法，本研究对金黄色葡萄球菌基因组中的α-溶血毒素基因进行敲除。首先构建同源重组质粒pMHL-α，经金黄色葡萄球菌RN4220修饰后再通过原生质体转入金黄色葡萄球菌SM-01。含重组质粒pMHL-α的金黄色葡萄球菌SM-01在42℃诱导条件下培养多代，最终筛选出α-溶血毒素基因缺失菌株。经序列分析和血平板溶血实验结果证实最终获得产SEB金黄色葡萄球菌α-HL缺失菌株。为构建产减毒肠毒素的金黄色葡萄球菌基因工程菌株提供了一定的理论基础和方法。

IL-2基因的突变及其与肠毒素融合基因的克隆和表达

由金黄色葡萄球菌分泌到胞外的单亚基蛋白中有肠毒素A和B。近年来两种毒素在肿瘤治疗研究方面取得了很大进展。白介素-2作为靶向分子，在抗肿瘤的药物中很有应用前景。本文分别对肠毒素A、肠毒素B和白介素-2进行了克隆和表达，并将白介素-2（125Ala）分别与肠毒素A227AI。肠毒素B进行了融合表达。从筛选到的天然金黄色葡萄球菌STSw的基因组中，通过PCR方法扩增出seb基因，同时突变了该基因两端几个稀有密码子。并将其克隆到7ZTS载体上进行表达，表达量占细胞总蛋白的33.5％。以seam基因为模板，通过重叠PCR将其227位天冬氨酸突变为丙氨酸，以降低其毒性。该突变基因重组到7ZTS载体中，并在JM109（DE3）中表达，表达量占细胞总蛋白的51.5％。通过重叠PCR法，对人的IL-2基因进行定点突变。共突变60个碱基，涉及51个氨基酸，其中第125位的半肤氨酸被突变为丙氨酸。该基因在大肠杆菌中表达量占总蛋白的30％。分别对上述三个工程菌的表达条件进行了探索。先制备出融合基因，再对融合基因进行表达，得到两种融合蛋白。它们是以6个甘氨酸和1个苏氨酸为链，将IL一2（125Ala）与肠毒素A227（Ala）、B分别连接起来，即IL-2（125Ala）-SEA227（Ala）和IL-2（125Ala）-SEB二者在大肠杆菌中表达量分别占总蛋白的10％和12％。以上实验结果为将几种蛋白开发成抗肿瘤靶向药物奠定了坚实基础。

IL-2与金黄色葡萄球菌肠毒素A和B融合基因的克隆及表达

目的 :IL - 2与金黄色葡萄球菌肠毒素A和B融合基因的克隆及表达。方法 :分别在金黄色葡萄球菌肠毒素A2 2 7Ala、B基因的两端克隆上两个酶切位点HindⅢ ,KpnⅠ。将IL - 2基因突变 ,设计一段linker使之分别与SEA2 2 7Ala和SEB相连并克隆到PET表达载体中 ,在大肠杆菌DH5α(DE3) -Pass中表达。结果 :表达的蛋白占总蛋白 15 %。结论 :IL - 2与金黄色葡萄球菌肠毒素A和B融合蛋白能在大肠杆菌中有效表达

金黄色葡萄球菌肠毒素B基因的克隆和在大肠杆菌中高效表达

利用PCR方法从金黄色葡萄球菌TSTw基因组DNA中扩增出约 70 0bp的DNA片段 ,将之克隆到pGEM 7Zf(+)载体上并转化大肠杆菌DH5α菌株。重组质粒的测序结果表明克隆到了seb基因 ,它含有 717bp(不包括N端81bp的信号肽编码区 ) ,其核苷酸序列与文献报道完全一致。将其连接于表达载体 7ZTS上 ,转化到大肠杆菌JM10 9(DE3)内。表达的SEB占总蛋白 33.5 %。

Compatibilization effects of block copolymers in high density polyethylene/syndiotactic polystyrene blends

Three triblock copolymers of poly[styrene-b-(ethylene-co-butylene)-b-styrene] (SEBS) of different molecular weights and one diblock copolymer of poly[styrene-b-(ethylene-co-butylene)] (SEB) were used to compatibilize high density polyethylene/syndiotactic polystyrene (HDPE/sPS, 80/20) blend. Morphology observation showed that phase size of the dispersed sPS particles was significantly reduced on addition of all the four copolymers and the interfacial adhesion between the two phases was dramatically enhanced. Tensile strength of the blends increased at lower copolymer content but decreased with increasing copolymer content. The elongation at break of the blends improved and sharply increased with increments of the copolymers. Drop in modulus of the blend was observed on addition of the rubbery copolymers. The mechanical performance of the modified blends is strikingly dependent not only on the interfacial activity of the copolymers but also on the mechanical properties of the copolymers, particularly at the high copolymer concentration. Addition of compatibilizers to HDPE/sPS blend resulted in a significant reduction in crystallinity of both HDPE and sPS. Measurements of Vicat softening temperature of the HDPE/sPS blends show that heat resistance of HDPE is greatly improved upon incorporation of 20 wt% sPS.