甘薯体细胞胚胎发生和原生质体培养及转化的研究

甘薯[Ipomoea batatm L.]胚性愈伤组织的诱导、生长及分化，受遗传背景、外植体来源、激素配比等多种因素的影响。以徐薯l8叶片为外植体，在Ms附加2mg／l2.4-D的培养基上，诱导、筛选出三种类型的愈伤组织（I型、Ⅱ型、IV型），虽然其来源和培养条件相同，但在外部形态、内部结构、分化途径、分化能力、同工酶酶谱、可溶性蛋白质组成以及DNA分子结构方面，都有显著差异。I型愈伤组织在Ms无激素培养基上分化出体细胞胚，其过氧化物酶及脂酶同工酶与Ⅱ型愈伤组织和lV型愈伤组织相比，酶带的数目、深浅不同，而与胚状体相类似，可以作为不回类型愈伤组织及其分化途径的生理指标。SDS-PAGE电泳分析表明：三种愈伤组织的总蛋白组成也有显著差异。I型愈伤组织与Ⅱ型愈伤组织相比，无论是酶带的数目，还是酶带的扫描高度，都占绝对优势，表明其具有相对较高的蛋白质合成代谢水平。RAPD分析表明，三种类型愈伤组织的遗传基础具有一定差异。在所用的10个随机引物中，引物G3(GAGCCCTCCA)扩增出了显著的多态性，在I型愈伤组织与胚状体中发现两个特异片段，有可能与体细胞胚胎发生过程特异相关。 以I型愈伤组织进行悬浮培养，建立了具有再生能力的胚性悬浮细胞系，并对其鲜重、干重、PCV体积、PH值等生长特性进行了测定，研究了在悬浮培养条件下，2.4-D浓度对体细胞胚胎发生的影响。在MS附加Img/12.4-D的培养基中，细胞呈园球型，细胞质浓厚，细胞核显著，分裂旺盛，转入不含2.4-D的分化培养基中，即可得到大量的游离胚状体：浓度过高（4-8mg／l）或过低（0.5mg/l），都不利于细胞的生长和分化。胞外同工酶研究发现：胞外过氧化物酶水平，随着2.4-D浓度升高、培养时间的延长、细胞生长速度的减缓而降低，随着体胚分化的开始而升高。这种变化趋势表明：2.4-D浓度、过氧化物酶及细胞的生长、分化之间，存在密切联系。蛋白质分析发现，2.4-D的浓度与细胞内可溶性蛋白质组成及含量也密切相关：在无激素培养基中的培养物，其蛋白质电泳图谱与在含有不同浓度2.4-D的培养基中的培养物相比，无论是谱带的数目还是谱带的峰值，都有深刻差异，表明在体胚分化和发育过程中，细胞内进行着旺盛的蛋白质合成代谢。 以胚性悬浮细胞为材料，进行原生质体培养。通过对游离条件的比较研究，发现采用PH值为6.0的E3酶液酶解2小时，可以得到大量具有旺盛活力的原生质体。采用液体浅层一固体平板双层培养方式进行培养，原生质体分裂旺盛，20天后形成肉眼可见的微型愈伤组织，在附加0.5mg/1 2.4-D的继代培养基中，出现根的分化，转入附加0.5mg/12.4-D和Img/16-BA的分化培养基中，有少量不定芽发生，并形成小苗，但无胚状体产生。 以来源于胚性悬浮细胞的原生质体为受体，通过与农杆菌共培养，将苏云金杆菌毒蛋白(Bt)基因导入甘薯细胞，经卡那霉素筛选，得到抗性愈伤组织，并有根的分化。经过PCR检测，证明了Bt基因在甘薯细胞染色体组中的整合。

干旱和复水条件下转基因甘薯的光合特性

以转铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因甘薯(TS)及未转基因甘薯(NT)为实验材料,研究在旱后复水条件下转基因甘薯及未转基因甘薯抗氧化酶活性和光合特性变化。结果显示,连续36 h胁迫条件下,TS和NT的SOD活性都先降低后升高,但TS的SOD活性始终高于NT。胁迫至24 h时,TS的SOD活性约为NT的1.2倍,复水后二者SOD活性都下降。持续胁迫,TS的APX活性先升高后降低,NT与之相反,复水后TS和NT的APX活性都是先升高后降低,复水12 h,TS的APX活性是NT的1.5倍。水分胁迫条件下TS的膜质受伤害程度要轻于NT,胁迫24 h,复水12 h,NT的MDA含量均约为TS的1.2倍。胁迫12 h,TS和NT净光合速率都下降,继续胁迫,TS净光合速率开始上升,NT几乎保持不变,胁迫36 h,TS的净光合速率约为NT的1.5倍。复水后二者净光合速率都开始上升,复水12 h,TS净光合速率约为NT的3倍。胁迫时TS、NT胞间CO2浓度(Ci)都逐渐增大,胁迫36 h时NT胞间CO2浓度显著高于TS,是其1.4倍。实验结果表明,同时转入SOD、APX抗氧化基因后,在...

影响圆叶牵牛(Ipomoea purpurea)花中花青素含量的因子研究

表型是基因型和环境共同作用的结果，环境对物种进化起到了至关重要的作用。虽然人们已经知道环境因子会影响植物花青素的最终含量，但这样的影响是如何在自然环境中进行的仍是未知。较之以前泛泛研究经济作物或模式植物的花青素总含量与人工环境变量的关系的工作，本文探讨环境变化对半野生的圆叶牵牛自然状态下不同基因型植株、不同花青素的影响。 65株取自全国各地包括3种颜色8种基因型的圆叶牵牛被分别种到了温室和室外，温室32株，室外35株，用高效液相 (HPLC) 的方法检测盛花期 (07年9月-10月) 圆叶牵牛花中花青素的含量，同时每天分早中晚采集3次温室和室外的环境数据-照度、紫外线强度、温度、湿度。记录每朵花着生高度、朝向、当天植株开花数、植株根茎、植株生长天数等个体信息。 通过保留时间、紫外-可见吸收光谱数据、质谱数据以及参考文献确定了圆叶牵牛花瓣中主要的5种花青素，包括三个矢车菊素 (CY) 和两个天竺葵素 (PG)，根据它们所含的咖啡酸和葡萄糖基的个数将它们简写成CY3C4G、CY2C4G、CY3C5G、PG2C4G、PG3C5G。CY2C4G和CY3C4G仅在蓝紫色花中大量存在，PG2C4G及PG3C5G仅在粉色花中大量存在，CY3C5G在两种颜色的圆叶牵牛花中均有存在。 温室和室外的四个环境因子有显著差异，平均照度室外为温室的3.06倍，平均紫外线强度为温室的5.39倍。Z 检验表明，蓝紫色花中的CY3C5G在温室内外没有显著差异 (P=0.3070)，而温室内的CY2C4G (P<0.0001) 和CY3C4G (P<0.0001) 含量明显的低于室外，粉花中CY3C5G和PG3C5G在温室 (P=0.4533) 和室外 (P=0.9577) 没有显著差异，PG2C4G在温室内含量明显 (P=0.0003) 低于室外。 通过Kruskal- Wallis 检验,不同基因型植株各种花青素的相对含量显著不同 (P<0.0001)。室外不同基因型植株的花青素绝对含量显著不同 (P<0.0001)。温室不同基因型植株中，CY2C4G (P=0.0224) 和CY3C4G (P=0.0017) 的绝对含量显著不同，显著性比室外的低些。CY3C5G不同基因型的绝对含量有差异，但是差异不显著 (P=0.0633)。基因型对植株中各个花青素相对含量的影响是尤其显著的，基因型对于花青素绝对含量的影响，可能是基因型直接作用和不同基因型对环境差异的不同响应两方面造成的，所以在环境变异稍大的条件下，基因型更加能显示出它对花青素的含量的影响。 植株的生长天数与粉色圆叶牵牛的PG2C4G、PG3C5G以及蓝紫色圆叶牵牛的三个花青素呈一定的正相关，当天开花数对粉色花的PG3C5G以及蓝紫色花的三个花青素呈负相关，花的朝向 (北-东-南-西-北 对应数值为0-90-180-90-0)，对粉花的PG2C4G以及蓝紫花的CY2C4G和CY3C4G 呈正相关，植株大小对粉花的PG2C4G、PG3C5G以及蓝紫花的CY3C5G呈负相关。花所着生的高度对两种颜色花的影响是不同的，与蓝紫花的三个花色素呈负相关，对于粉色的PG2C4G、CY3C5G呈正相关。

In situ nutrient removal from aquaculture wastewater by aquatic vegetable Ipomoea aquatica on floating beds

Nutrient-rich effluents caused rising concern due to eutrophication of aquatic environment by utilization of a large amount of formula feed. Nutrient removal and water quality were investigated by planting aquatic vegetable on artificial beds in 36-m(2) concrete fishponds. After treatment of 120 days, 30.6% of total nitrogen (TN) and 18.2% of total phosphorus (TP) were removed from the total input nutrients by 6-m(2) aquatic vegetable Ipomoea aquatica. The concentrations of TN, TP, chemical oxygen demand (COD) and chlorophyll a in planted ponds were significantly lower than those in non-planted ponds (P<0.05). Transparency of water in planted ponds was much higher than that of control ponds. No significant differences in the concentration of total ammonia nitrogen (TAN), nitrate nitrogen (NO3-N) and nitrite nitrogen (NO2--N) were found between planted and non-planted ponds. These results suggested that planting aquatic vegetable with one-sixth covered area of the fishponds could efficiently remove nutrient and improve water quality.

Microelements in Potato and Lily Samples Studied by Laser-Induced Breakdown spectroscopy Technology

A LIBS setup was built in the Institute of Modern Physics. In our experiments, LIBS spectra produced by infrared radiation of Nd : YAG nanosecond laser with 100 and 150 mJ pulse energy, respectively, were measured by fiber optic spectrometer in the ranges of 230-430 run and 430-1080 nm with a delay time of 1.7 and gate width of 2 ms for potato and lily samples prepared by vacuum freeze-dried technique. The lines from different metal elements such as K, Ca, Na, Mg, Fe, Al, Mn and Ti, and nonmetal elements such as C, N, O and H, and some molecular spectra from C-2, CaO, and CN were identified according to their wavelengths. The relative content of the six microelements, Ca, Na, K, Fe, Al, and Mg in the samples were analyzed according to their representative line intensities. By comparison we found that there are higher relative content of Ca and Na in lily samples and higher relative content of Mg in potato samples. The experimental results showed that LIBS technique is a fast and effective means for measuring and comparing the contents of microelements in plant samples.

Determination of organophosphorus pesticides in cucumber and potato by stir bar sorptive extraction

Organophosphorus pesticides (OPPs) in vegetables were determined by stir bar sorptive extraction (SBSE) and capillary gas chromatography with thermionic specific detection (TSD). Hydroxy-terminated polydimethylsioxane (PDMS) prepared by sol-gel method was used as extraction phase. The effects of extraction temperature, salting out, extraction time on extraction efficiency were studied. The detection limits of OPPs in water were <= 1.2 ng/l. This method was also applied to the analysis of OPPs in vegetable samples and matrix effect was studied. Linear ranges of OPPs in vegetable samples were 0.05-50 ng/g with detection limits <= 0. 15 ng/g and the repeatability of the method was less than 20% relative standard deviation. (c) 2005 Elsevier B.V. All rights reserved.

圆叶牵牛花青素代谢途径的基因型变异与花色变异的进化生物学研究

基因型变异和表型变异的相互关系问题是尚未解决的生物学基本问题之一，而解决这个问题的一个有效方法是研究基因组中功能相关基因的分子进化和表型效应的相互关系。在本研究中我们利用圆叶牵牛花青素代谢途径（该途径合成了与花色形成有关的色素）来研究表型变异和基因型变异的进化关系，希望探讨两个问题：1、代谢途径上基因多态性在不同位点的表现程度如何? 2、在中国种群中传粉者对花色有无选择? 在对第一个问题的研究中调查了中国圆叶牵牛花青素代谢途径部分结构基因和调控基因的多态性。所研究的结构基因为途径的第一个关键酶基因CHS-D基因和较下游的ANS基因、UF3GT基因，以及调控基因W位点。其次是在温室中进行人工自交以获得所研究基因的纯合体。在对第二个问题的研究中，首先调查了野外圆叶牵牛不同花色的传粉者和传粉几率，其次是分析有色花个体与白花个体中的遗传变异程度。目前的研究结果表明CHS-D位点有3个等位基因，其中在中国的西南部地区发现了1个新的、在已报道的7个等位基因以外的等位基因;较下游的结构酶基因ANS位点存在有5个等位基因（在中国新发现3个等位基因）;UF3GT位点目前只发现有2个已报道的等位基因。在中国的圆叶牵牛中，新发现调控基因W位点上一个有功能的等位基因Ipmyb2，它与已报道的等位基因Ipmyb1的差异主要存在于内含子部分，而与发生缺失（1个6bp的缺失和1个19bp的缺失）后无功能的等位基因ipmyb2（该基因造成白花）存在外显子部分的8个碱基的差异。野外传粉观察结果表明，白花个体与有色花个体受到传粉者介导的选择，传粉者偏爱有色花而歧视白花，而且与在美洲不同，在中国圆叶牵牛的主要授粉者为蛾类而不是蜂类，从野外观察统计的结果看蛾类的传粉效率要高于蜂类。以上结果表明：1）花青素代谢途径上酶基因的位点均有一定程度的多态，其中尤以ANS为最高;调控基因ipmyb2的核苷酸缺失造成该基因停止功能，使其纯合子的个体开白色花。2）授粉者所介导的花色表型选择确实在中国种群中发生，有可能进一步增加花色代谢途径上基因位点的遗传变异。

花青素代谢途径上结构基因和调控基因的多态性分析

在生物个体中，很多基因位点都存在多个等位基因。这些等位基因存在的生物学意义是什么？是中性突变的结果还是进化选择的结果？本文以花青素代谢途径为平台，以圆叶牵牛为研究对象，试图探讨相关的生物学问题。具体问题是：（1）等位基因的多样性在调控基因和结构基因中是否有所不同？（2）两个等位基因的启动区会有什么不同？ 我们首先在来自新圭亚那、美国和中国的17个圆叶牵牛个体中调查了花青素代谢途径上第一个关键酶基因CHS-D基因和下游的最后一个基因UF3GT，以及三类调控基因MYB1、bHLH1、WDR1的多态性。目前的研究结果表明，CHS-D位点有三个等位基因，其中在中国的西南部地区发现了一个新的等位基因CHS-D-SINO1。下游的结构酶基因UF3GT位点存在3个等位基因，其中的UF3GT-c是我们在新圭亚那的三个个体中所新发现的。调控基因中，MYB1位点存在两个等位基因，其中一个是新发现的。bHLH2位点存在3个等位基因，均为新发现的。WDR1位点也存在三个等位基因，其中两个都是在本实验中新得到的。调控基因和结构基因位点的等位基因数量没有明显差别。 为了进一步了解等位基因的差异，我通过inverse PCR的方法得到了花青素代谢途径上F3H基因的两个等位基因F3H1和F3H3的启动区序列。通过分析发现，F3H1和F3H3的编码区序列相似性达到99%，而启动区序列相似性为79.7%，总体相似性87.1%。可见，这两个等位基因的差异主要集中在启动区。 F3H1启动区包含了16个bHLH蛋白的识别位点；而F3H3启动区包含9个bHLH蛋白的识别位点。其中，两者完全一样的有7处。除bHLH蛋白以外，F3H1和F3H3都分别含有一个MYB蛋白的识别位点，但两者所处的位置不同。这些数据表明这两个等位基因在功能上应该差别不大，但在应答调控基因对其的调节作用上可能有所差别。

植物生产生物可降解塑料PHB的研究：真养产碱杆菌H16的phbB和phbC的基因克隆、植物表达载体构建和转基因马铃薯植株的获得

利用聚合酶链式反应(PCR)技术从Alcaligenes eutrophus H16染色体DNA中扩增并克隆了调控聚-3-羟基丁酸(poly-3-hydroxy-butyrate，PHB)生物合成的两个关键酶基因：依赖NADPH的乙酰乙酰CoA还原酶基因(phbB)和PHB合成酶基因(phbC)。限制性内切酶图谱和核苷酸序列分析证实了克隆结果，并表明克隆的基因与国外所报道的有很高的同源性。经过基因拼接，构建了块茎特异性表达的高等植物表达载体pPSAGB（嵌合phbB）、pBIBGC(嵌合phbC)和pPSAGCB（嵌合phbB和phbC）。并以试管薯(microtuber)为外植体经Agrobacterium介导转化了虎头、京丰、Bintje、Favorita、高原4号和88-5共6个马铃薯品种，获得49个株系。经PCR检测导入phbB的株系共有44个，对其中30个株系进行DNA dot blot分析，结果表明phbC导入呈阳性的株系有20个。深入的鉴定工作还在进行中。