5 resultados para PRR
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Resumo:
本论文结合功能研究和进化遗传学方法对动物天然免疫(innate immunity)相关分子的进化历程进行深入研究。受体对病原微生物的识别是天然免疫系统发挥功能的基础。作为模式识别受体(pattern recognition receptor, PRR),果蝇肽聚糖识别蛋白SD(PGRP-SD)在识别革兰氏阳性细菌的过程中发挥了重要作用。针对已有的黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)群体数据,我们发现PGRP-SD在群体中存在2类高频的等位基因(分别为等位基因1和等位基因2)。以D. simulans为外群,我们追溯了黑腹果蝇2类等位基因上氨基酸的变化。这些氨基酸的结构特征和在蛋白质上所处的位置提示这2类等位基因在功能方面可能存在分化。通过功能研究的方法,我们发现在黑腹果蝇中该基因功能方面发生了显著的变化。等位基因2在有微生物时能激活天然免疫反应,但等位基因1的转基因果蝇成虫只要有外伤即便没有微生物的情况下即能激发天然免疫反应,而带有等位基因2果蝇成虫则不具有该功能。这一结果提示我们,发生在该等位基因上的氨基酸变化导致了其识别功能的变化。与推导的祖先基因相比,等位基因1发生了一个氨基酸的变化,因此导致其功能从识别细菌细胞壁组分肽聚糖转变为一未知的自身组分,即从病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP)识别受体转变为损伤相关识别模式(damage-associated molecular pattern, DAMP)识别受体。通过这一功能变化, 果蝇成虫可以通过仅识别自身损伤即可激活相应的免疫反应,对后续可能侵入的微生物进行杀伤。已有研究结果显示,微生物在进化过程中已经形成针对DAMP和PAMP规避策略。上述2类等位基因的同时存在能使黑腹果蝇同时具备两个机制,更加充分地抵抗病原微生物的入侵。结合功能研究和针对自然群体的群体遗传学分析,我们认为在黑腹果蝇群体中以高频共存的2类PGRP-SD等位基因可能可能受到了平衡选择(balancing selection)作用。上述工作主要研究了天然免疫系统识别受体的进化。而本论文的另一部分则主要针对天然免疫系统的效应分子(effector)进行了研究。作为重要的效应分子,抗菌肽在杀菌方面发挥着最为直接的作用。因此,研究抗菌肽的进化对于探索天然免疫系统的进化具有重要意义。本研究以两栖类动物大蹼铃蟾抗菌肽基因家族为例,通过对分别来自2个大蹼铃蟾个体的皮肤cDNA文库进行测序,我们鉴别出56个不同的抗菌肽cDNA序列。每一个cDNA均编码2个不同的抗菌肽,maximin 和maximin H。基于针对这些cDNA序列的分析,我们发现2类抗菌肽编码序列的非同义替代率均高于同义替代率,呈现高度分化的特征。但是,在信号肽和其它非抗菌肽编码区域并没有发现这种情况。这一结果提示抗菌肽可能受到超显性选择(overdominent selection, 即平衡选择)的影响。同时,我们分别从皮肤和肝脏克隆基因了7个抗菌肽的基因组编码序列并进行了测序。这些从不同组织获得的抗菌肽在各个编码序列中均存在序列的差异的同时呈现了相同的结构。这一结果提示不同抗菌肽间的差异不太可能来自于体细胞突变而是快速序列进化的结果。通过构建来自于同一个体的抗菌肽的不同编码区的基因树,我们发现结构域重排(domain shuffling)和/或基因转换(gene conversion)在这些抗菌肽的进化历程中发挥作用。
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Peptidoglycan recognition protein (PGRP) specifically binds to peptidoglycan and plays a crucial role in the innate immune responses as a pattern recognition receptor (PRR). The cDNA of a short type PGRP was cloned from scallop Chlamys farreri (named CfPGRP-SI) by homology cloning with degenerate primers, and confirmed by virtual Northern blots. The full length of CfPGRP-SI cDNA was 1073 bp in length, including a 5 ' untranslated region (UTR) of 59 bp, a 3 ' UTR of 255 bp, and an open reading frame (ORF) of 759 bp encoding a polypeptide of 252 amino acids with an estimated molecular mass of 27.88 kDa and a predicted isoelectric point of 8.69. BLAST analysis revealed that CfPGRP-S1 shared high identities with other known PGRPs. A conserved PGRP domain and three zinc-binding sites were present at its C-terminus. The temporal expression of QPGRP-S1 gene in healthy, Vibrio anguillarum-challenged and Micrococcus lysodeikticus-challenged scallops was measured by RT-PCR analysis. The expression of CfPGRP-S1 was upregulated initially in the first 12 h or 24 h either by M. lysodeikticus or V. anguillarum challenge and reached the maximum level at 24 h or 36 h, then dropped progressively, and recovered to the original level as the stimulation decreased at 72 h. There was no significant difference between V. anguillarum and M. lysodeikticus challenge. The results indicated that the CfPGRP-S1 was a constitutive and inducible acute-phase protein which was involved in the immune response against bacterial infection. (c) 2007 Elsevier Ltd. All rights reserved.
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Lipopolysaccharide and beta-1, 3-glucan binding protein (LGBP) is a kind of pattern recognition receptor, which can recognize and bind LPS and beta-1, 3-glucan, and plays curial roles in the innate immune defense against Gram-negative bacteria and fungi. In this study, the functions of LGBP from Zhikong scallop Chlamys farreri performed in innate immunity were analyzed. Firstly, the mRNA expression of CfLGBP in hemocytes toward three typical PAMPS stimulation was examined by realtime PCR. It was up-regulated extremely (P < 0.01) post stimulation of LPS and beta-glucan, and also exhibited a moderate up-regulation (P < 0.01) after PGN injection. Further PAMPs binding assay with the polyclonal antibody specific for CfLGBP proved that the recombinant CfLGBP (designated as rCfLGBP) could bind not only LPS and beta-glucan, but also PGN in vitro. More importantly, rCfLGBP exhibited obvious agglutination activity towards Gram-negative bacteria Escherichia coil, Gram-positive bacteria Bacillus subtilis and fungi Pichia pastoris. Taking the results of immunofluorescence assay into account, which displayed CfLGBP was expressed specifically in the immune cells (hemocytes) and vulnerable organ (gill and mantle), we believed that LGBP in C farreri, serving as a multi-functional PRR, not only involved in the immune response against Gram-negative and fungi as LGBP in other invertebrates, but also played significant role in the event of anti-Gram-positive bacteria infection. As the first functional research of LGBP in mollusks, our study provided new implication into the innate immune defense mechanisms of C. farreri and mollusks. (C) 2010 Elsevier Ltd. All rights reserved.
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栉孔扇贝是我国重要的海水养殖品种,自1997年以来陆续爆发的大规模死亡,不仅造成了巨大的经济损失,而且直接威胁到现有产业的生存和发展。本研究通过比较扇贝在连续刺激条件下的不同免疫反应,推测栉孔扇贝中有无免疫致敏和记忆现象,观察短期免疫刺激对扇贝再次遇到相同病原物刺激时死亡率的影响,探讨栉孔扇贝的免疫致敏作用,并对其机制进行初步探讨,以期更好地了解扇贝的免疫防御机制,为扇贝病害防治提供参考。 利用荧光实时定量PCR技术检测了扇贝受到鳗弧菌连续等量刺激后两种重要病原识别受体(PRR)基因的表达。结果显示,在受到连续两次刺激后CfPGRP-S1、LGBP基因的表达量均有不同程度的增加。其中CfPGRP-S1基因在受到第二次刺激后表达量增加的幅度高于第一次,且基因表达显著性增加的时间比第一次提前;LGBP基因在第二次刺激后,表达量显著性增加的时间也比第一次提前。同时,对同批处理的扇贝进行重要免疫指标的检测分析发现两次刺激后吞噬率变化不显著,而第二次刺激后吞噬指数的最大峰值高于第一次,并且最大峰值出现的时间比第一次提前;血淋巴中的抗菌活力和肝胰腺中SOD、MDA含量在两次刺激前后的变化不显著。在脊椎动物中,识别能力和抗菌能力的提高是免疫记忆的两个重要特点,栉孔扇贝在第二次免疫刺激后PRR识别能力的提高和吞噬作用的增强,说明扇贝中可能存在类似脊椎动物免疫记忆的免疫致敏作用。对扇贝进行两次鳗弧菌浸泡刺激,第一次为短期浸泡刺激,第二次为长期浸泡刺激。结果发现,第一次浸泡过的扇贝在遭受相同病原第二次刺激时,在一定时间段内其死亡率比未受第一次刺激的扇贝极显著降低,表明第一次的短期病原刺激增强了扇贝对第二次刺激的抵抗能力。同时比较第二次刺激过程中扇贝免疫指标的变化发现经过短期刺激扇贝的吞噬作用、ACP和AKP活性比未受过刺激的扇贝显著增强,而其他指标包括POL、SOD则差异不显著,说明增强的吞噬作用、ACP和AKP活性与扇贝的死亡率下降有关。研究结果表明栉孔扇贝中存在免疫致敏(immune priming)现象,短期刺激可以提高扇贝的免疫反应能力,增强扇贝机体对相同病原物的抵抗能力。
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对虾病害在世界范围内的广泛传播,给水产养殖和沿海农村经济造成了重大损失。自1993 年对虾白斑病暴发以来,中国明对虾的养殖一直一蹶不振。引起对虾大规模死亡的原因是多方面的,其主要原因是养殖环境恶化、对虾种质退化和抗病力下降。因此,深入开展对虾免疫机制研究,并在此基础上寻找对虾疾病防治的有效方法,改良种质和培育抗病品系,已成为对虾养殖业走可持续发展之路的当务之急。 Toll 样受体(Toll-like receptors, TLRs)家族是进化保守的哺乳动物模式识别蛋白(pattern recognition receptors, PRR),在先天免疫系统中起着非常重要的作用。本研究采用同源克隆和RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术从中国明对虾中克隆到Toll 样受体同源基因,并将其命名为FcToll。它全长4115 bp,3’UTR 包含16 个poly A 尾巴,开放阅读框编码931 个氨基酸的多肽。预测的该多肽包含典型的Toll 样受体结构,分为胞外区、跨膜区和胞内区。其中胞外区有信号肽,有16 个富含亮氨酸的重复序列eucine-rich repeats, LRR),并含有2个LRR-C 末端基序和2 个LRR-N 末端基序;跨膜区是23 个氨基酸的一次跨膜结构域;胞内区是含有139 个氨基酸的TIR 结构域(Toll/Interleukin-1R)。克隆 发现FcToll 的基因组结构包含5 个外显子和4 个内含子。系统发生分析揭示FcToll归属于“昆虫型”的无脊椎动物Toll 样受体家族。组织分布研究发现FcToll 在中国明对虾中是组成型表达的,在淋巴器官中表达量较显著。分别利用不同病原体刺激健康的中国明对虾,Real-time PCR 发现该基因在刺激后表达水平呈现不同的表达谱:灭活鳗弧菌(Vibrio anguillarum)注射后5 小时,该基因表达显著 上调;而WSSV(white spot syndrome virus)注射后该基因表达则迅速下调,感染后23 小时内其表达水平均低于对应时间点的对照组。这就表明FcToll 可能参与中国明对虾的先天免疫防御,尤其可能参与入侵弧菌的免疫应答。