The experimental research of R-phycoerythrin subunits on cancer treatment: A new photosensitizer in PDT

The mouse tumor cell 5180 and human liver carcinoma cell SMC 7721 cells were first treated with R-PE and its subunits (alpha, beta, gamma subunits), then irradiated with Argon laser (496 nm, 28.8 J/cm(2)). Survival rate was measured by MTT method. In order to compare the phototoxicity in normal cells, the mouse marrow cells were treated with photofrin II and beta-subunit, irradiated with 45 J/cm(2) of light; survival rate was also measured by MTT method. The result showed that R-PE subunits had better PDT effect on s180 cells than R-PE and lower phototoxicity in marrow cells than photofrin II Flow cytometric analysis showed that PDT results in a growth inhibition and a G(0)-G(1) cell cycle arrest in SMC 7721 cells. The tumor cells inhibited by PDT in vivo were morphologically observed by TEM, the tumor cell death was daze to the occlusion of tumor blood vessels and inducement of cell programmed death in nuclei. Therefore, with the advantage in special fluorescence activity, loth molecular weight, good light absorbent character and weak phototoxicity, R-PE subunit is art attractive option for improving the selectivity of PDT.

高效液相色谱法分离测定Fe(Ⅱ)和络合物Fe(Ⅱ)-PDT的两种几何异构体

铁在自然界中广泛分布，其环境和生态效应主要取决于它们的理化性质、形态、溶解性以及与溶解有机质的结合程度。氧化还原性敏感元素铁在自然界主要以Fe(Ⅱ) 和Fe(Ⅲ)两种价态存在。铁在水环境中的地球化学循环作用主要通过其自身的各种价态之间转化以及与周围其他物质(微量元素,营养盐,有机质)之间的相互作用来实现的。不同形态的铁具有不同的理化性质，其环境效应和生物有效性都是不同，不同形态的铁还可对其他重金属在水体中的循环迁移、赋存形态和生物有效性等均产生不同程度的一定的影响。因此，为铁的环境地球化学行为提供更为准确的信息，就必须进行铁的形态分析，由于Fe(Ⅱ)的氧化还原敏感性，故对铁进行形态分析的前提就是准确测定Fe(Ⅱ)的含量，用普通分光光度法测定Fe(Ⅱ)特别是低含量的Fe(Ⅱ)时，结果的不准确性以及高检出限等缺点都严重制约了准确测定环境中Fe(Ⅱ)的含量。为克服用普通分光光度法测定Fe(Ⅱ)时易受样品溶液其他组分的基体干扰以及灵敏度低等缺点，我们采用了用3-(2-吡啶基)-5,6-二苯基-1,2,4-三嗪（PDT）作为柱前衍生试剂，反相离子对高效液相色谱法来测定Fe(Ⅱ)。由于络合物Fe(II)-PDT存在两种几何异构体，故在建立反相离子对高效液相色谱法来测定Fe(Ⅱ)的同时，我们进一步研究了PDT及Fe(II)-PDT的两种几何异构体色谱分离与测定的实验研究，取得了如下进展： 1．研究了有机萃取分光光度法测定Fe(Ⅱ)，实验中发现加入离子对试剂四溴酚酞乙酯钾(TPBE-K)，由于TPBE和Fe(Ⅱ)-PDT络合物生成三元离子缔合物，导致最大特征吸收波长红移，由555nm增加至610nm，三元离子缔合物[Fe(PDT)3] [TBPE]2的摩尔吸收系数由2.4×104 l•mol-1•cm-1增加至1.9×105 l•mol-1•cm-1，显著改善了方法的灵敏度，降低了检出限，在Fe(Ⅱ)含量为0~0.3μg/ml范围内，方法的线性关系良好，线性方程为y＝0.3582x＋0.01，R2＝0.9974，检出限为0.96ng/ml(S/N＝3)，达到ng/ml水平，成功应用于测定泉水及表层湖水的Fe(Ⅱ)及总铁含量。 2．将3-(2-吡啶基)-5,6-二苯基-1,2,4-三嗪(PDT)作为衍生显色络合试剂应用于分光光度法来测定Fe(Ⅱ)已得到较为充分的报道。在上述研究基础上，首次研究了将PDT作为柱前衍生络合试剂，应用于反相离子对高效液相色谱法来测定Fe(Ⅱ)，不仅克服了常规络合衍生分光光度法过量络合剂干扰试验结果的缺点，而且进一步优化选择了检测波长，由于HPLC的应用，突破了在分光光度法中只能在可见波长范围内选择检测波长为555nm，将检测波长选择在Fe(Ⅱ)-PDT吸收更强烈的紫外区295nm处，使得灵敏度得到了显著提高。在Fe(Ⅱ)浓度为0～3.5×10-6mol/l时，峰面积A和峰高H均和标准溶液的浓度C(×10-7mol/l)的线性关系良好,线性回归方程分别为：A=7.4951x-0.0785(R2=0.9999) 和H=0.5126x- 0.0915(R2=0.9997)，方法的检测限为0.35ng/ml (S/N＝3)。本方法测定Fe(Ⅱ)时，不需复杂的前处理步骤，如固相萃取、有机溶液萃取等，直接柱前衍生HPLC方法测定，方便、快速且灵敏度高，低于众多分光光度报道的检出限水准7～170ng/ml范围。 3．由于络合物Fe(II)-PDT存在面式和经式两种几何异构体，故在建立起反相离子对高效液相色谱法来测定Fe(Ⅱ)新方法的同时，进一步研究了PDT及Fe(II)-PDT的两种几何异构体色谱分离及测定实验研究，关于这方面的试验研究，目前来说还没有相关的研究报道，所以将反相离子对高效液相色谱法应用到分离及测定PDT及Fe(II)-PDT的两种几何异构体中，这也是本论文的第二个创新之处。在本实验中，所用的色谱固定相为普通的反相键合C8柱，但由于优化选择了最佳流动相条件，使得PDT及Fe(II)-PDT的两种几何异构体直接在C8柱上得到完全的基线分离。讨论了流动相中有机改性剂乙腈不同比例、不同种类的离子对试剂(高氯酸钠和十二烷基硫酸钠)及不同浓度对PDT和Fe(II)-PDT两种几何异构体的色谱行为的影响。根据不同试验条件下，对所获得的色谱参数(容量因子、分离度、选择性因子、保留时间等)进行了较为深入的分析，据此探讨了色谱分离异构体过程的机理。 4．在上述实验的基础之上，引入更能灵活的调节洗脱强度和被分离物质分离度的三元流动相(乙腈/甲醇/水=20/50/30)，优化选择了三元流动相中有机改性剂的比例以及离子对试剂的种类及浓度，使得异构体的分离度和选择性因子均得到满意结果。对一系列不同浓度的Fe(II)-PDT异构体分离，面式和经式异构体的面积和浓度之间的线性关系在4~25×10-7mol/l范围内良好，线性关系分别为：y = 3.6333x - 2.3378(R2 = 0.9957，经式异构体)，y = 1.8219x - 1.0783(R2 = 0.9964, 面式异构体)。面式和经式异构体的检测限分别为4.28ng/ml和3.44ng/ml (S/N＝3)。 5．进一步研究发现Fe(II)-PDT的两种几何异构体之间存在相互转化的动态平衡，故根据异构体含量随时间的变化就可以探讨在转变过程中的动力学和热力学参数。用高效液相色谱法研究了异构体转变过程中色谱峰高和面积随时间的变化，并依此首次得出了两种几何异构体相互转化可逆过程中的热力学和动力学参数，如熵变、焓变、自由能变化、反应速率常数等，对两种几何异构体之间的动力学转变平衡机理进行合理的解释提供了有益的参考。各不同温度下(30℃，35℃，40℃，45℃)，反应时间在3倍半衰期以内，两种几何异构体之间的相互转变平衡均符合动力学一级反应。各不同温度下Xeln[(Xe-X0)/Xe-X)]随时间变化的线性关系良好，分别为：y=0.0821x+0.7288(R2=0.9911,T=45℃)；y = 0.0486x + 0.598(R2 = 0.9987, T=40℃); y = 0.0216x + 0.5861(R2 = 0.9987, T=35℃)；y = 0.0124x + 0.591(R2 = 0.9988, T=30℃)。 首次将PDT作为柱前衍生络合试剂，应用于反相离子对高效液相色谱法来测定环境中的Fe(Ⅱ)，且无需复杂的样品前处理过程(固相萃取，有机溶液萃取等浓缩富积过程)，克服了普通分光光度法检测限高、易受样品基体效应的干扰等缺点；在建立起的高效液相色谱法测定Fe(Ⅱ)的基础上，进一步对络合物Fe(II)-PDT的两种几何异构体色谱分离及动力学转变实验研究，则是对建立起的反相离子对高效液相色谱法测定Fe(Ⅱ)试验研究基础上的进一步延伸和扩展，是对测定Fe(Ⅱ)的高效液相色谱法的机理的进一步认识和探讨。PDT作为柱前衍生络合试剂首次应用于高效液相色谱测定Fe(Ⅱ)为铁的环境地球化学工作者提供了一种灵敏度高的测定Fe(Ⅱ) 的新途径，为环境样品中Fe(Ⅱ)含量的准确测定提供保证，对铁的环境地球化学研究，如铁形态分析、铁的水-沉积物界面行为等提供更翔实可靠的信息。

光动力疗法抑制人免疫缺陷病毒复制的实验研究

通过对人免疫缺陷病毒复制过程的抑制作用研究，探索光动力疗法(PDT)在艾滋病防治中的潜在价值。使 用不同稀释浓度的光敏剂血卟啉单甲醚(HMME)和亚甲蓝(MB)分别与人免疫缺陷病毒HIV一1Ⅲs或宿主细胞 MT4，C8166或H9／HIV-IⅢB孵育2 h。以波长630 nm能量密度0．3 J／cm2的半导体激光进行照射。继续孵育若干 小时后，用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞存活率或合胞体计数，同时收集培养上清液用ELISA法检测HIV-I p24 抗原。结果表明，光动力疗法能显著抑制人免疫缺陷病毒诱导的细胞一细胞融合(HMME-PDT抑制率64．68％， MB-PDT抑制率61．56％)和病毒一细胞融合(HMME—PDT抑制率85％，Mt}PDT抑制率73．64％)，并对游离病毒 有很强的杀伤作用，最高可达到100％。光动力疗法不能抑制慢性感染期和急性感染2 h后病毒的复制过程。可 见光动力疗法对游离病毒和病毒感染诱导的膜融合有显著抑制作用，有可能为艾滋病的防治提供一种新的方法。

Biological effect of R-phycoerythrin-mediated photosensitization on DNA.

R-phycoerythrin (R-PE) is one of important proteins involved in capturing light during photosynthesis in red algae, and it is highly fluorescent, and water-soluble chromophores. In vivo, it can transfer the light energy into photosynthetic center, however, it can deliver the captured light energy captured to the surrounding oxygen in vitro and produce reactive oxygen species such as singlet oxygen, which is toxic to tumor cells. R-PE was added to the culture medium of tumor cells, subsequently with irradiation of 488 nm, Argon laser of 25.6 J/cm(2). The result by MTT assay showed that the survival rate decreased with the increase of R-PE concentration from 1 to 100 mg/L. The result from H-3-TdR incorporation demonstrated that the synthesis of DNA reduced when the concentration of R-PE increased from 0.01 to 0.32 mg/L. Besides, pUC18 DNA showed a conversion from supercoiled into linear conformation. The conclusion comes that R-PE mediated PDT can influence the conformation of DNA, and it may be one of the mechanisms of R-PE mediated photodynamic therapy.