稻属Oryza officinalis复合体基因组研究－兼论基因组原位杂交的原理和方法

稻属（Oryza L.）属于禾本科稻族（Oryzeae Dumortier）。本属包括AA，BB，BBCC，CC，CCDD，EE，FF，GG，HHJJ和HHKK十个基因组，二十余种。其中Oryza officinalis复合体包括BB，BBCC，CC，CCDD和EE五个基因组，九个种。众多的学者对该复合体进行了广泛深入的研究，为后续研究奠定了坚实的基础。然而，迄今为止，多倍体物种形成问题许多没有解决，基因组间的关系尚未完全阐明，甚至有些多倍体物种的基因组组成仍未确认。 本文评述了Oryza officinalis复合体中基因组研究的历史和现状，用基因组原位杂位（GISH）的方法，对该复合体四倍体物种的基因组组成作了验证;对B，C，D和E四个基因组间的关系进行了研究。同时对基因组原位杂交的方法，原位杂交鉴定多倍体基因组的组成以及研究基因组间关系的方法作了一些探讨。其主要研究结果如下： 一. 原杂交方法的研究：1）染色体制片：比较研究了不同的制片方法，发现压片法适用于大染色体的材料;将酶解/空气干燥法（Fukui et al., 1992）加以改进后，特别适宜于小染色体植物材料的制片。2）根尖储存时间和条件对原位杂交的影响：发现在-20 ℃的酒精（70%）中储存8个月以内的根尖材料，可用于原位杂交;而在-20 ℃的固定液中储藏18个月的根尖，DNA降解严重，不能用于GISH。3）探针标记：比较了随机引物法、缺口平移法和两步标记法（先用随机引物标记后，再用缺口平移法进行标记的方法）的优缺点。结果显示两步标记法是最佳标记方法。 二. GISH鉴定异源多倍体的方法：用两个异源四倍体Oryza minuta和Scilla sinensis (2n = 34)做染色体制片，进行原位杂交实验，结果表明：1）用二倍体亲本基因组之一做探针而不用封阻DNA， 可以鉴别Oryza minuta而不能鉴别Scilla sinensis中的基因组。2）用一个二倍体亲本做探针而用另一个做封阻，能够区分Scilla sinensis的两个基因组;但过量的封阻DNA将可以造成一些实验假象。3）同时用两个亲本的DNA做探针，不仅能够有效分辨不同的基因组，还能够根据交叉杂交程度推测基因组间的分化程度，是鉴别异源多倍体最有效的方法。 三. GISH鉴定稻属四倍体的基因组组成：1）Oryza minuta, O. punctata和O. malampuzhaensis的基因组的组成都为BBCC。2）Oryza minuta中B基因组和二倍体O. punctata中的B基因组之间存在着明显的基因组内分化。3）O. alta是一个异源多倍体，其基因组组成为CCDD。但C和D之间的分化不彻底，可以认为它不是一个严格意义上的异源多倍体。 四. GISH研究B，C，D和E基因组间的关系：1）B基因组和C基因组之间的关系最远;E和C之间的分化同E和B之间的分化程度接近，但E和C之间的分化比E和D之间的分化要小一些;C和D之间的分化不彻底，关系最近。

稻属系统学若干问题的探讨

稻属（OryzaL���）是禾本科稻族(Oryzeae)中最大，也是分布最广的属，由于其包括亚洲栽培稻这一世界第一大粮食作物，对该属各方面的研究都相当多，系统与进化植物学研究也是如此。然而，由于该属分布跨及亚、非、美、澳各洲热带、亚热带地区，材料不易得到，故研究常缺乏系统性，属和属内一些种的界限仍然存在争议，属下组间特别是几个孤立类群间的系统发育关系也一直不很清楚，稻属与近缘类群间系统发育关系研究也很有限。为此，本文在以前学者研究的基础上，综合评述了目前稻属各分类系统，指出了目前普遍接受的观点和存在分歧，同时对稻属系统作了一些必要的修订;通过l7种野生稻的核型分析和通过原位杂交技术在稻属尝试性的应用，从染色体水平探讨了稻属与近缘类群间的关系以及稻属内物种间的关系;通过对lO个属28种稻族植物cp DNA上的trnK基因的限制性内切酶位点的分析，并综合其它证据，对稻属与近缘属间关系进行初步的探讨。主要的结论如下： 一、 17种野生稻核型研究表明： 1）所有种的间期核属染色中心型(chromocentertype)，染色中心较少或多，形状规则或不规则，散布于全核;前期染色体固缩特性属于近基型(proximal type)，2）Sect.Oryza所有种的核型很相似，均为n=5m+5sm+2t，其中第四对和第十对为st染色体，第十对为随体染色体，Sect. Brachyantha和SeCt. Padia的核型与前者有一定的差异，表现在随体染色体的位置和染色体的大小。0. brachyantha的核型特点并不支持将该种置于Sect. Oryza的观点。 对携带BC和CD基因组的四个种的核型分析表明，其染色体组成并非是二倍体染色体组成的叠加，说明其形成后发生了二倍化的分化，综合各方面证据， 我们支持携带BC基因组的两个四倍体种属双系起源， 而携带CD基因组的四倍体之起源与亚洲携带C基因组的物种有关的观点。3）对国内8个居群的药用野生稻（0．officinalis）核型研究表明，所有居群均为二倍体，未发现以前学者所报道的四倍体类型。药用野生稻为一多型种，通过初步的形态学比较分析，我们认为斯里兰卡分布的根茎野生稻O.rhizomatis很可能是药用野生稻这一多型种适应于季节性干旱环境的一个生态型。4）以前学者认为稻属可能源于x一5的次级多倍化，我们不支持这一观点，从整个稻族所有属以及近缘的稻亚科其它三族的染色体基数来考虑，我们认为其祖先类群更可能的染色体基数为x-6。 二、原位杂交结果：1）确定了13个种的45s rDNA的位点数，其中所有携带A基因组的物种除亚洲栽培稻和O_ rufipogon之位点数有1和2的分化外，其余种皆为一个位点;B基因组也含一个位点，C基因组的两个种各含3个位点， BC基因组的两个种均具三个位点，E基因组含二个位点，携带CD基因组的稻种分别携带3和5个位点，其中位点有大小之分;2)利用C基因组作探针，B基因组作封阻DNA，在四倍体CD（O.latifolia）的染色体制片中确立了带C基因组的染色体。 三、用PCR-RFLP技术对稻族lO个属28个种的trnK基因的酶切位点变异进行了分析，发现：(1) trnK基因PCR扩增产物长度约为2575bp，没有明显的长度变异，l7种内切酶处理，共得到72个酶切位点，占整个trnk基因全长的13.98%，72个酶切位点中52个为突变位点，33个为信息位点，利用52个突变位点，构建了28个种的树系图。(2)分支分析表明，稻族的lO个属共分为两组，一组为O.ryza和Porteresia，一组为其余的8个属;该结果明显不同于经典的族内划分。根据稻族各属现在的分布格局，认为稻族是禾本科早期分化过程中产生的类群，由于生境的相似，趋同演化和网状进化事件可能比较频繁，稻族的亚族划分可能存在一些不合理的成分。Porteresia coarctata, Rhynchoryza subulata，Leersia perieri三种以前曾被置于稻属，根据分支图，后两种位于分枝图的第二支，与稻属各种分化较大，而P．coarctata与稻属聚在一起，说明两者在锻汰基因的变异式样是相似的。综合各方面资料，我们认为P. coarctata可能是稻属适应于海滩耐盐环境的一个特化的类群。 (3)稻属的Sect. Oryza所包括的两个系Ser.Oryza与Ser.Latifolia仅在一个酶切位点上有差异，说明其间关系非常密切，Sect. Padia中的两个系Ser. Meyerianae和Ser.Ridleyianae与Sect.Oryza所包括的两个系Ser. Oryza与Ser. Latifolia有明显分化，两个孤立类群O brachytrntha f770．scl71echteri与Ser. Ridleyi聚在一起。 这一结果与Vaughan(1994)将两孤立种和O.ridteyi复合体同置于其系统中的Sect. Ridleyanae是吻合的。

稻属的分子系统学研究

稻属（Oryza L���属于禾本科的稻族，主要分布于世界的热带和亚热带地区。一般认为稻属包括20个左右的野生种和2个栽培种，我国有4-5种。迄今为止，对于稻属中种的数目和划分;稻属中所包括的种类是否为一单系类群;各基因组之闻的关系和起源以及稻属的起源等等，学术界仍然存有争议。本文评述了稻属分子系统学研究的进展，研究中存在的问题以及对未来稻属系统学研究的展望。针对稻属的分子系统学研究中所存在的问题，运用核糖体DNA转录间隔区序列测定、随机扩增多态性DNA（RAD）和SSR-anchoredPCR等分子生物学的手段对稻属中全部23个种的来自中国和世界不同地区的材料开展了分子系统学的研究。所得主要结果如下： 1．对产于中国的三种野生稻和栽培稻的二个亚种的核糖体DNA第一转录间隔区进行了序列测定。 DNA序列分别用PAUP程序进行分支分析和用MEGA程序中的UPGMA和Neighbor-joining进行聚类分析，结果表明核糖体DNA转录间隔区序列适合于进行稻属的分子系统学研究。 2．用荧光自动测序法和人工同位素测序法测定了稻属23个种和4个外类群的转录间隔区的序列。所有的DNA序列用Clustal V程序排阵后，再用PAUP程序进行分支分析。结果表明： A．稻属中的23个种组成四个主要分支，分别相当于Vaughan(1989)的四个种复合体。 B．所有AA基因组的种都在一个分支中。除了O.meridionalis与其它种的关系相对较远外，AA基因组种间有一定程度的分化，但不大。 C．尽管BB、BBCC、CC、CCDD和EE基因组的种都在一个分支中，但它们之间的分化是较为明显的。O.australiensis与该分支中的其它种的关系相对较远。以上两个分支的关系较为密切，它们组成一个自然类群，是稻属的核心部分。 D．O.ridleyi与O.longiglumis非常近缘，它们组成一个分支。 E．O.meyeriana与O．granulata有非常密切的关系。O.brachyantha与O.meyeriana近缘，而与AA基因组的关系较远。O,schlechter/与Leersia hexandra近缘，而与稻属中其它种的关系较远。作为外类群的Porteresia coarctata与稻属的a brachyantha非常近缘，这有可能说明将它作稻属中的一员的观点是正确的。 3．用RAPD和ISSR技术对稻属23介种的36份材料以及Porteresia coar ctata和Leersia hexandra各1份材料进行PCR扩增。16个10-mer RAPD随机引物共扩增出368个多态条带，5个锚定SSR引物共扩增出1 16个多态条带。RAPD和ISSR扩增出的多态条带合在同一数据矩阵中，用NTSYS-pc程序进行聚类分析。得出的结果与ITS序列分支分析的结果相似。 A.从表征图上亦可区分出四个群。所有的AA基因组的种聚在一起，O.nivara与O.rufipogon的关系密切，两个种的界限不清楚，所以认为它们是一个种：O.rufipogon.。 B.分布于中国的O.officinalis与O.minuta非常近缘，而菲律宾的四倍体O.officinalis则与同是基因组的O.eichingeri和O.rhizomatis关系密切。EE基因组的O.australiensis与Officinalis群保持一种松散的联系。 C。具FF基因组的O.brachyantha与O.schlechteri近缘，它们与Porteresiacoarctata和Leersia hexandra关系的密切程度要大于它们与稻属其它种的关系。 D。最后讨论了RAPD和ISSR用予植物属内的系统发育研究存在的问题。本研究结果说明RAPD和ISSR适合于进行属内近缘种亲缘关系的研究。

药用野生稻复合体（稻属）的分子系统发育与进化研究

稻属（Oryza L.）隶属于禾本科（Gramineae）Ehrhartoideae亚科的稻族（Oryzeae），包括两个栽培种（亚洲栽培稻O. sativa和非洲栽培稻O. glaberrima）和大约20多个野生种，广布于热带亚洲、非洲、大洋洲、中美洲和南美洲。药用野生稻复合体（O. officinalis complex）是稻属中最大、也是最复杂的一个复合体，共包括9个种，含有5种染色体组类型（B、C、BC、CD 和E）。作为栽培稻品质改良的重要基因库，药用野生稻复合体在稻属中具有重要的地位。但是，相似的形态和重叠的地理分布使部分物种的分类和鉴定一直较为困难;种内染色体组构成和倍性的不同更增加了分类鉴定的复杂性。这种情况阻碍了对这些野生稻遗传优势的有效利用。另外，由于物种间断分布和缺乏明确的二倍体亲本等原因，药用野生稻复合体内的异源多倍体起源一直存在争议。本文通过细胞核乙醇脱氢酶基因（Adh）和nrDNA的内转录间隔区（ITS）限制性片段长度多态性（RFLP）分析;叶绿体matK 基因、trnL 内含子和trnL-trnF 基因间隔区、核基因Adh和GPA1以及核糖体DNA ITS片段等序列比较的方法，对药用野生稻复合体中染色体组和物种的鉴定、种间系统发育关系，以及异源多倍体CCDD物种的起源和多倍体ITS的分子进化等进行了研究。主要研究结果如下： 1． 利用核Adh 基因限制性片段长度多态性，检测了来自国际水稻研究所基因库的64份药用野生稻复合体的样品。结果证明，所有O. rhizomatis样品都是含C染色体组的二倍体，所有O. minuta样品都是含BC 染色体组的四倍体。但是，种子库中鉴定为O. officinalis、O. punctata和O. eichingeri的样品中，同时都发现了含C染色体组的二倍体和含BC染色体组的四倍体。四倍体的O. officinalis只在印度分布，而且曾被描述为另一个种O. malampuzhaensis。 四倍体的O. punctata，也被一些学者称为O. schweinfurthiana，被发现和其二倍体一样分布广泛。值得注意的是，有两个曾被作为O. officinalis 四倍体的样品实际上是含有CD染色体组的物种O. latifolia。我们的结果增进了对国际水稻研究所种子库中部分野生稻样品染色体组构成的理解, 纠正了以往对药用野生稻复合体样品的错误鉴定，为今后进一步研究和利用这部分资源提供了种质编目的重要基础。 2． 对稻属中代表不同地理分布区的、含CD染色体组的11个样品（包括77个克隆）的ITS片段进行了测序。基于这些ITS序列的限制性片段长度多态性，提出一个快速而可靠的区分稻属CD 染色体组物种的方法。这个方法的具体步骤是：（1）利用通用引物扩增ITS 片段;（2）利用限制性内切酶FokI和/或DraⅢ消化PCR扩增产物;（3）用1%的琼脂糖胶电泳并根据消化产物的片段长度多态性来区分不同物种。 3． 利用包括两个叶绿体片段（matK和 trnL-trnF）、nrDNA内转录间隔区（ITS）和三个核基因（Adh1、Adh2和GPA1）的同源序列分析，探讨了药用野生稻复合体中二倍体物种和它们所代表的染色体组之间的系统发育关系。独立和合并的基因系统发育树都显示了一致的结果，即C染色体组和B染色体组的亲缘关系要比它们和E染色体组的近。三个含C染色体组的二倍体中，O. officinalis 和O. rhizomatis表现出较近的亲缘关系。值得注意的是，在O. eichingeri种内，尽管基于多基因的数据支持来自斯里兰卡的样品和来自非洲的样品聚成一个分支，但是较低的支持率表明, 两个地区的样品之间存在着较高的遗传分化。 4． 稻属中含CD染色体组的物种特产于拉丁美洲，包括O. alta、 O. grandiglumis 和O. latifolia。由于具有相同的染色体组类型、相似的形态特征和重叠的地理分布，这3个物种间的系统发育关系一直存在争论。另外，因为美洲大陆上没有含C和D染色体组的二倍体物种存在，对这些含CD染色体组物种的可能起源也有不同的假设被提出。使这个问题更具挑战性的是，尽管开展了世界范围的收集，至今仍没有找到含D 染色体组的二倍体物种。在本研究中，代表含C、CD和E染色体组以及含G染色体组的外类群共7个物种，共15份样品的2个叶绿体片段（matK和trnL-trnF）和3个核基因（Adh1，Adh2 和 GPA1）部分片段被测序。基于简约法、距离法和最大似然法的系统发育分析都充分支持含CD染色体组的物种起源于一次杂交事件的推论，并且显示，在物种形成时，含C染色体组的物种（O. officinalis 或O. rhizomatis 而非O. eichingeri）可能承担了母本，而含E染色体组的物种（O. australiensis）则可能承担了父本。另外，CCDD物种间非常一致的系统发育关系表明，非常大的分歧存在于 O. latifolia 和其它两个种（O. alta和O. grandiglumis）之间，这个结果倾向于将后两个种处理为同种或同种下不同分类群。 5． 基于178个克隆序列比较，探讨了ITS在稻属多倍体中的致同进化及其系统学意义。研究发现稻属异源四倍体的ITS存在不同形式的进化方式：首先，非洲BBCC四倍体O. eichingeri和O. punctata 的ITS片段同时保留了双亲拷贝，而且系统发育研究表明，二倍体的O. eichingeri和O. punctata 可能是这两个四倍体的直接祖先;其次，亚洲四倍体O. malampuzhaensis和O. minuta 的ITS仅定向保留母本ITS拷贝;另外，美洲CCDD四倍体的ITS序列发生了双向致同进化，即O. alta和O. grandiglumis的ITS位点一致化成C染色体组类型，而O. latifolia一致化成 D/E 染色体组类型。我们的研究进一步表明在利用ITS片段进行系统发育分析时，特别是涉及异源多倍体时必须慎重。 6． 利用栽培稻的微卫星引物，对含B/C染色体组的6个物种，157个体的SSR位点进行扩增。结果在这些亲缘关系稍远的野生稻中得到7个SSR位点，其中5个位点表现出多态性。比较BB、CC和BBCC物种SSR位点的每位点平均等位基因数A、多态位点百分率P和期望杂合度He ，3项指标发现，四倍体物种的遗传多样性，总体上要高于二倍体物种;二倍体物种内部，O. officnalis的遗传变异最大。另外，以遗传相关性为标准，讨论了B/C染色体组物种间的系统发育关系，同时推测了现存二倍体物种和4个BBCC四倍体物种的遗传关系。

稻属C染色体组物种的群体遗传学和物种形成研究

植物近缘物种系统发育和物种形成过程一直以来都是植物进化生物学研究中最基本的问题之一，是人们理解自然界物种多样性产生和变化的前提。近缘物种间通常形态相似，遗传和分子水平的分化很小且常受诸如渐渗杂交、谱系分选、种内重组等微观进化事件的影响，导致植物近缘物种间系统发育和物种形成过程研究极为困难。在过去十多年中，生物技术的革新和理论方法的发展极大地推动了进化生物学研究，促进了人们对一些重要模式生物与其近缘种间的系统发育关系和物种分化过程的认识，如人、果蝇、线虫、拟南芥和玉米等。然而，迄今在植物中，许多重要类群及其近缘种的系统发育和物种形成过程研究仍不多见，包括在具有特殊重要性的栽培作物中，如稻属（Oryza L.）。由于属内包含有重要粮食作物水稻，稻属向来都是禾本科内备受关注的一个类群。本研究中，我们通过多基因序列的方法，探讨了稻属C染色体组三个近缘二倍体物种的系统发育和物种形成过程，主要研究结果如下。 为选择适宜的实验策略和保证序列数据的真实性，我们利用不同聚合酶扩增自交的栽培稻Oryza sativa ssp. japonica和异交的O. longistaminata不同类型的基因片段，采用克隆测序的方法，评估聚合酶链式扩增反应（PCR）中产生的非真实变异的状况。我们使用exTaq、exTaq和Pfu混和酶和PfuUltraTM酶三种不同聚合酶扩增了Adh1、GPA1和Waxy三个基因片段。在检测到的非真实变异中，PCR 错误的类型主要为单碱基变异和不同等位基因间重组，其中以单碱基变异为主，且突变类型以转换占绝大多数。比较不同酶扩增错误的结果表明，高保真PfuUltraTM酶对PCR反应错误有显著的改善，在扩增产物的单克隆中几乎检测不到PCR噪音，错误率仅为0.0001%，而exTaq和混和酶的错误率分别为0.096%和0.073%。从不同物种比较结果来看，exTaq酶和Pfu酶混用时在自交的O. sativa ssp. japonica内对PCR错误也表现明显的改善，但在异交的O. longistaminata中改善效应不太明显。在三个不同基因位点上，PCR扩增错误出现频率随扩增区域增长而变大。在PfuUltraTM酶的扩增产物中发现重组最少，exTaq和混和酶重组较多，且混和酶对重组改善效果不明显。基于不同聚合酶扩增错误对比研究结果，我们认为，由于能保证序列变异的真实性且不遗漏等位基因，核基因的克隆测序较宜于分离杂合个体中不同的等位基因。 基于随机挑取4个叶绿体和10个核基因位点，利用12份Oryza officinalis、8份O. eichingeri和4份O. rhizomatis材料，对稻属C染色体组三个近缘二倍体物种的系统发育关系作了深入分析。利用不同的系统发育分析方法对单基因位点序列和合并序列数据作了分析，结果表明，稻属C染色体组三个近缘种间呈多歧分支。因此，三个二倍体C染色体组物种可能经快速辐射分化形成。在不同核基因和叶绿体基因的系统发育树中各分支枝长均很短，也表明C染色体组的三个物种可能在较短时期内分化出。不同基因间拓扑结构不一致主要受谱系随机分选的影响。此外，C染色体组不同物种间的种间渐渗和不同等位基因重组对系统发育树的冲突也有影响。值得注意的是，C染色体组三个物种的辐射分化不排除由于相邻两次物种形成事件间隔时间太近、目前数据量不够而无法分辨的可能。在本研究中，我们发现，对于系统发育重建困难的类群，利用等位基因构建物种谱系树有助于挖掘不同基因间结果不一致的因素。 基于10个随机选取的核基因序列数据，利用物种水平的取样方式和群体遗传学分析方法，我们研究了稻属C染色体组三个近缘物种O. officinalis、O. eichingeri和O. rhizomatis的核苷酸多态性，并根据多态性水平和式样，推测了三个近缘种分化的历史。结果表明，在C染色体组的三个近缘种中，仅分布于斯里兰卡的O. rhizomatis的核苷酸多态性水平相对最低（θsil = 0.0038），而间断分布于非洲和斯里兰卡的O. eichingeri最高（θsil = 0.0057）。与被子植物其他类群相比，稻属C染色体组三个物种的核苷酸多态性水平显得较低，O. eichingeri的核苷酸多态性仅约为玉米及其近缘野生种的23-46%和拟南芥的35%。C染色体组内三个野生种相对较低的核苷酸多态性水平可能起因于其较小的祖先有效群体。物种形成模型分析表明，O. officinalis和其近缘种从最近共同祖先分化开后可能经历了居群缩减的历史，且自最近共同祖先分开后，三个物种彼此间并无显著的基因交流。基于分子钟粗略估算了C染色体三个物种分化时间，结果表明，三个物种彼此在很短的时期内分开，约0.63-0.68 Myr。同时，O. eichingeri在非洲和斯里兰卡两个地理宗的分异时间约为0.37 Myr，且推测斯里兰卡的O. eichingeri主要由西非经长距离扩散传播到斯里兰卡。

水稻(Oryza sativa L. sspjaponica)成熟与萌发花粉的蛋白质组学研究

花粉是高度退化的两细胞或三细胞生物体。作为雄配子体，花粉储藏了父本的全部遗传信息，并通过与柱头识别、萌发和花粉管极性生长将精子送到雌性的胚囊中，完成双受精作用。由于花粉在植物有性生殖过程中的特殊作用和花粉管极性生长的独特细胞学过程，几十年来一直被作为研究这一系列精细细胞学过程的模式，但是其中关键事件的分子机制并不十分清楚。 我们利用蛋白质组学技术鉴定了水稻成熟花粉三个不同组分（花粉外被蛋白、花粉外被／细胞壁相关和可释放蛋白、花粉内在蛋白）中表达的共322种蛋白质。其中，参与信号转导(10%)、细胞壁重塑和代谢(11%)、蛋白质代谢(14%)以及糖类和能量代谢(25%)的蛋白质被高度代表。并且很多是首次被在成熟花粉中得到鉴定的具有重要功能的蛋白质，包括蛋白激酶、受体激酶相互作用蛋白、GDP解聚抑制因子、含有C2结构域蛋白质和亲环蛋白等参与信号转导的蛋白质，eIF4A、线粒体加工肽酶、UFD1和AAA+ATP酶等参与蛋白质合成、装配和降解的蛋白质，以及逆糖基化多肽、似纤维素合酶OsCsLF7等参与细胞壁重塑和代谢的蛋白质等。生物信息学分析表明，在我们鉴定的蛋白质中有11%的蛋白质功能未知并且不含有任何已知的功能结构域。另外，我们利用从头测序技术鉴定了5种新蛋白质。这些首次在花粉中被鉴定的蛋白质、未知功能蛋白质和新蛋白质在花粉萌发过程中的生物学功能值得进一步研究。 进而，我们利用比较蛋白质组学技术获得了水稻花粉体外萌发过程中差异表达的160个鉴定结果（代表120种蛋白质），生物信息学分析表明它们隶属于13个功能类群。其中，参与细胞壁代谢（占24%，如UDP-葡萄糖焦磷酸化酶和第三类过氧化物酶）、蛋白质代谢（占11%，如eIF4A和20S蛋白酶体的亚基）、细胞骨架动力学（占8%，如肌动蛋白、微管蛋白和profilin）和胁迫反应（占7%，如抗坏血酸过氧化物酶）以及糖类和能量代谢（占24%）的蛋白质被高度代表。共有94个鉴定结果(73种蛋白质)在花粉萌发过程中表达丰度上调，包括几乎全部参与蛋白质代谢的蛋白质，多数参与细胞骨架动态变化和离子转运的蛋白质，以及部分参与糖类和能量代谢的蛋白质等。并且有53个鉴定结果（41种蛋白质）可能在萌发过程中被释放到培养基中（柱头上），可能参与了柱头细胞和花粉管通道细胞细胞壁的松弛和水解（如第三类过氧化物酶家族成员、多聚半乳糖醛酸酶、1，4-beta-木聚糖酶和一些花粉过敏源蛋白），或者参与了花粉．柱头的信号识别过程（如钙网蛋白和含有C2结构域的蛋白）。有8种传统认为是参与糖类和能量代谢的酶可能在萌发过程中被释放到培养基中（柱头上），如烯醇酶、磷酸丙糖异构酶和磷酸甘油酸激酶。 同时，我们发现在鉴定的成熟花粉表达的蛋白质中，有23%的蛋白质以多个同工型的形式存在，并且有29种蛋白质的多个同工型的表达丰度在萌发过程中发生变化。它们主要参与了细胞壁代谢、糖类和能量代谢、细胞骨架、胁迫反应和离子运输等代谢过程。我们利用荧光染色技术，检测到其中14种蛋白质可能被磷酸化或者糖基化修饰。这意味着由于翻译后修饰形成的同工型蛋白质在花粉萌发和花粉管生长过程中具有重要作用。 总之，我们以水稻为模式研究其成熟花粉和萌发花粉的蛋白质表达特征，首次报道了单子叶植物成熟花粉不同组分中表达的蛋白质及其功能类群特征，并且首次报道了被子植物花粉萌发过程中表达丰度变化蛋白质的功能类群特征，为进一步揭示花粉萌发和花粉管生长的分子机制提供了重要的蛋白质水平信息。

水稻(Oryza sativa L. ssp japonica)幼苗根质膜蛋白质组分析

根质膜具有重要的生物学功能，它参与了根响应脱落酸（ABA）的一系列活动。尽管已经有很多有关ABA影响根的生长和发育的报道，但是在蛋白质组水平上研究参与ABA信号转导及相关活动的质膜蛋白质的报道还未见到。我们期望利用蛋白质组学技术平台研究外源ABA胁迫下水稻根质膜与ABA功能相关的蛋白质组的变化。 本论文通过双向电泳（2DE）结合质谱（MALDI-TOF MS 和 MALDI-TOF/TOF MS）分析的方法鉴定了102个质膜相关蛋白质。这些蛋白质功能涉及到跨膜运输（16.2%）、胁迫反应（14.3%）、物质运输（4.8%）、细胞骨架动态变化（5.7%）、细胞壁重建（3.8%）、碳代谢和能量循环（13.3%）、蛋白质代谢（14.3%）、信号转导（18.1%）和其他功能的蛋白质（4.8%），以及未知功能的蛋白质（2.9%）。其中大约30％的蛋白质以同工型的形式存在。在这些鉴定结果中，有10个斑点（代表10种蛋白质）已被报道为质膜特异的蛋白质;68个蛋白质斑点（代表58种蛋白质）是质膜相关蛋白质。其余54个蛋白质斑点（代表42种蛋白质）是首次在水稻根的质膜囊泡中被鉴定出来。 在ABA处理条件下，我们在2DE胶上发现了15个响应ABA调节的蛋白质斑点。9个上调的蛋白质斑点分别代表以下9种蛋白质：vacuolar proton-ATPase A subunit, vacuolar ATPase B subunit、patatin、 Salt-stress root protein RS1、谷氨酰氨合成酶（Glutamine synthetase，GS）、OSR40c1、H+-exporting ATPase （vacuolar ATPase E subunit）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶I型（glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase, type I，GADPH）和醛缩酶C-1（aldolase C-1）。6个下调的蛋白质斑点分别代表4种蛋白质：endosperm lumenal binding protein、remorin protein、富含脯氨酸蛋白质（glycine-rich protein，GRP）和蔗糖合成酶（sucrose synthase, SuSy）。其中，OSR40c1和endosperm lumenal binding protein与蛋白质合成相关，从它们与ABA的关系中可以看出，ABA可能抑制了细胞的蛋白质合成。而vacuolar proton-ATPase A subunit、vacuolar ATPase B subunit和 H+-exporting ATPase参与了细胞质pH的调控，ABA致使了细胞质pH的上升。甘油醛-3-磷酸脱氢酶I型、醛缩酶C-1和蔗糖合酶参与了细胞壁的生长发育，ABA的作用可能导致了细胞壁生长发育的延迟。ABA促使Patatin上升，其作用可能与质膜膜脂的降解有关。而ABA的刺激也使谷氨酰氨合成酶的表达显著上升，谷氨酰氨合成酶可以去除细胞内有害的游离NH+4。同时还有未知功能的富含脯氨酸蛋白质（glycine-rich protein，GRP）同样受到ABA的诱导，但具体的功能及其与ABA的关系还要进一步的实验证据。