HIV-1核衣壳蛋白NCp7抑制剂体外筛选方法的建立

目的 表达HIV-1核衣壳蛋白(nucleocapside protein p7,NCp7),并建立抑制剂筛选方法.方法 从pBRU2/ADP202质粒经PCR得到HIV-1 NCp7编码序列,克隆到pet28a 质粒中构建HIV-1 NCp7表达载体.阳性克隆转染E.coli BL21 DE3,以IPTG诱导,细胞裂解液经Q Sepharose H.P和SP Sepharose H.P纯化后纯度达到90%以上.将具有锌离子逐出活性的H2O2和2,2'-联硫基二吡啶(2,2'-dithiodipyridine,AT-2)与NCp7作用,用锌离子特异的荧光染料检测.用该方法检测KIZ-CM系列化合物.结果 可以检测H2O2和AT-2的锌离子逐出活性,经该方法筛选,KIZ-CM 10,18,19等化合物具有一定的锌离子逐出活性.结论 在国内首次建立了HIV-1 NCp7锌离子逐出方法,该方法可以用于NCp7抑制剂的筛选.

HIV-1核衣壳蛋白NCp7的功能及其抑制剂研究进展

NCp7在HIV-1生活周期中多个步骤发挥重要的核酸分子伴侣作用.抑制NCp7的功能可阻断HIV-1复制.NCp7含有两个高度保守的锌指结构,对NCp7的功能起决定性作用.锌指结构突变将导致HIV-1丧失感染能力.NCp7抑制剂可望成为下一代不容易产生耐药突变的抗HIV-1药物.本文就NCp7抑制剂目前的研究进展作简略综述.

Anti-HIV-1 Activities of Hemslecins A and B

目的:研究从药用植物金佛山雪胆分离的雪胆素A和雪胆素B两个三萜类化合物的体外抗HIV活性.方法:应用合胞体抑制实验、p24抗原产生的抑制实验、慢性感染细胞和正常细胞间的细胞融合抑制实验等技术检测化合物的体外抗HIV-l活性;利用HIV-l逆转录酶、蛋白酶抑制实验,NCp7锌离子逐出实验探讨化合物的作用机制.结果:雪胆素A和雪胆素B在体外有较好的抑制HIV-l活性,其活性主要表现为:(1)抑制HIV-l诱导合胞体形成,EC50值分别为3.09 μg·mL-1和2.53μg·mL-1;(2)抑制HIV- 急性感染的C8106细胞p24抗原产生,EC50值分别为3.97μg·mL-1和18.90μg·mL-1;(3)抑制HIV-1 慢性感染H9与正常C8166细胞间融合,EC50分别为1.76μg·mL-1和11.95μg·mL-1.雪胆素A和雪胆素B对HIV-l逆转录酶、蛋白酶、NCp7锌离子逐出均没有抑制作用.雪胆素A对HIV-1整合酶有微弱的结合活性,而雪胆素B对HIV-1整合酶没有结合活性.在共培养实验中,雪胆素A和雪胆素B预处理C8166细胞组比未经预处理细胞组能够更有效的抑制HIV-l活性.结论:化合物雪胆素A和雪胆素B体外有较好的抗HIV-1活性,可能主要作用于HIV-1病毒进入细胞阶段.

二种抗HIV-1 药物筛选模型的建立及β-咔啉类化合物抗HIV 活性研究

艾滋病的流行严重威胁着人类健康和全球经济的发展，在某些国家已经造成 严重的经济问题和社会问题。由于尚无安全有效的艾滋病疫苗问世，药物治疗仍 是目前防治艾滋病的主要途径。二十多种抗HIV 药物的临床使用以及HAART 疗 法的应用，艾滋病患者的死亡率呈一定的下降趋势。然而，目前使用的抗HIV 药物能够抑制患者体内病毒的复制，但不能完全清除病毒。耐药病毒株的出现和 流行更降低了药物治疗的成功率。为此需要不断研究开发作用于新靶点或具有不 同作用机制的药物。 药物筛选是药物开发中的重要环节，其关键在于建立适合的药物筛选方法。 传统药物筛选费时费力，近年来逐渐被高通量药物筛选方法所代替。本研究中， 我们在大肠杆菌中表达并纯化了HIV-1 蛋白酶，获得了纯度和活性较高的蛋白 酶。利用荧光标记的蛋白酶底物在体外检测化合物对蛋白酶活性的影响，建立了 适于高通量筛选蛋白酶抑制剂的体外筛选方法。通过对大量样本的筛选，发现一 些具有蛋白酶抑制活性的化合物和粗提物。本研究还表达纯化了HIV-1 核衣壳蛋 白NCp7。利用锌离子特异性的荧光染料，建立了相应的高通量筛选方法。该方 法能够筛选出通过逐出NCp7 结合的锌离子而抑制该蛋白功能的化合物。这两种 体外筛选方法的建立大大提高了药物筛选的效率，降低了工作强度，为进一步的 研究打下了基础。 在药物开发过程中，常常通过对已知有效的化合物进行结构修饰以提高药物 活性并降低细胞毒性，改善药物疗效。在先前的药物筛选中，我们发现从高等真 菌中提取的β-咔啉类化合物flazin, 具有一定的抗HIV 活性。通过对flazin 的结 构修饰， 我们发现了治疗指数更高的化合物。本研究对其中两个， dehydroxymethylflazinamide 和flazinamide，进行了更深入的抗HIV 活性研究。 dehydroxymethylflazinamide 和flazinamide 抑制HIV-1IIIB 感染诱导的合胞体形 成的EC50 分别为0.31 μM 和 0.38 μM。 与flazin(EC50 为2.37 μM）相比较， 抗HIV 活性提高了约6-7 倍。这两个化合物对C8166 细胞的半致死浓度(CC50) 分别为27.34μM和118.64μM。Dehydroxymethylflazinamide 的细胞毒性与flazin (CC50 为28.71μM）相似，而flazinamide 的细胞毒性降低了约4 倍左右。与flazin 相比，通过结构修饰，Dehydroxymethylflazinamide 治疗指数从12.1 提高到 88.19，而flazinamide 治疗指数从12.1 提高到312.2。研究还发现，这两个化 合物对临床分离株HIV-1KM018 以及实验株HIV-2ROD、HIV-2CBL-20 也有良好的抑 制效果。 我们对dehydroxymethylflazinamide 和flazinamide 的作用机制也进行了初 步探讨。二者均能有效抑制HIV-1IIIB, HIV-2ROD and HIV-2CBL-20 病毒的细胞间传 播，而不能抑制HIV-1IIB 慢性感染的H9 细胞中病毒复制，说明该化合物可能主 要作用于病毒生活周期的早期阶段； 进一步的研究表明， dehydroxymethylflazinamide 对HIV-1IIIB 进入阶段有很强的抑制活性，说明进入 阶段是该化合物的主要作用靶点；而flazinamide 对直接杀病毒、病毒吸附及进 入均没有显著的抑制效果，该化合物的作用机制还需进一步研究。对酶靶点作用 研究表明，两个化合物对HIV-1 逆转录酶仅有微弱抑制活性说明该酶可能不是作 用靶点；dehydroxymethylflazinamide 对HIV-1 蛋白酶有抑制活性但半效浓度 （EC50）较高,说明该酶可能是化合物的次要靶点。而flazinamide 在体外与重组 的整合酶有较强的结合活性，暗示该化合物可能对整合酶有一定的抑制作用。以 上结果还说明，虽然两个化合物具有类似的结构，但它们可能是通过完全不同的 机制来抑制HIV 的复制.