拟南芥bre突变体分析及小麦ver203F基因表达模式研究

第一部分 茎尖分生组织的中央部位是由干细胞组成，维持干细胞的动态平衡对于植物器官启动显得尤为重要。在拟南芥花序分生组织和花分生组织中分别有WUS/CLV和(WUS+LFY)/AG两个负反馈调节环控制着这一平衡，保证了花序分生组织的非决定性和花分生组织的决定性。 本文用T-DNA激活标签技术得到功能增强突变体bre，序列分析表明BRE就是干细胞特征基因WUSCHEL。定量RT-PCR表明在突变体的茎节间WUS大量表达，证实在WUS基因的调控区插入的4个35S增强子使WUS表达增强。突变体bre生长发育缓慢，茎弯曲，花器官数目改变，心皮发育加快。尤为突出的是在茎皮层直接分化出花分生组织。这些表型可能与WUS的表达增强有关。这说明WUS功能是多效的，除了在分生组织中决定干细胞命运、促进CLV和AG的表达外，还可能与生长素极性运输以及花分生组织特征基因的表达有关。 第二部分 春化作用是促进植物从营养生长向生殖生长转变的有效途径之一，作者所在实验室曾经分离到多个小麦春化相关基因。为研究春化期间它们在不同组织或不同细胞内的表达模式，首先建立并完善了RNA组织原位杂交系统。以春化相关基因ver203F为模板，采用地高辛为标记分子，借助体外转录制备RNA探针，分析了小麦胚芽和幼苗中ver203F的表达模式。结果表明：春化前和脱春化的胚芽中不表达ver203F，春化处理14天以上的胚芽幼叶表达ver203F,而且主要定位在叶的边缘分生组织细胞内，叶维管束和表皮组织未检测到转录物，胚芽鞘和茎尖分生组织中不表达。幼苗的侧芽中的幼叶有相同的表达模式。茉莉酸可以诱导ver203F的表达。．说明春化时的低温信号可能由幼叶接收，并有可能涉及到茉莉酸介导的信号转导途径。

水稻花发育相关基因RA68和OsUBP1的分离与功能分析

　　　　　　　　　　　　　　　　　第一部分 利用减法杂交和RACEs从水稻中克隆了一个编码含有脯氨酸和苏氨酸丰富结构域多肽的cDNA,其相应的基因被命名为RA68。RA68由3个外显子和2个内含子组成，编码的蛋白由219个氨基酸残基组成。该蛋白由一个21个氨基酸残基组成的信号肽，一个亲水性的N－端结构域和一个疏水性的C－端结构域组成。 N端结构域是一段嵌合PTPTSYG motif的富含脯氨酸和苏氨酸的序列。 Southern杂交和序列分析结果表明RA68在水稻基因组中以单拷贝存在，定位于第2号染色体。Northern杂交结果表明RA68在幼芽和花中表达量较高，在根和叶中不表达。原位杂交分析结果表明：在幼苗期RA68 主要在幼芽胚芽鞘的内外层细胞和幼叶原基的表层细胞中表达;转入生殖生长期后，在花序分生组织、枝梗原基顶端、花器官原基、大孢子囊和花粉粒中表达。用GFP作报告基因，用洋葱表皮细胞进行的瞬间表达测试结果显示RA68蛋白定位于细胞核中。转反义RA68水稻植株抽穗期比对照野生型延迟30天左右。这些结果表明RA68可能是水稻花分生组织特征基因，在成花转变过程中起作用。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第二部分 通过RACE和RT-PCR方法分离了水稻OsUBP1基因，其推测编码蛋白含有UBP结构域（Cys Box和His Box）和TopⅥA结构域。RT-PCR分析结果表明OsUBP1在转录过程中通过可变剪接产生多个不同的转录本，这些转录本在叶、根、颖花和幼芽中存在着时空调节表达模式，每种组织中的转录本是不一样的。这些转录本内含子剪切位点除了经典的GT-AG外，还有GC-AG、CT-AC、TT-GA、GT-GA和CT-GA。由于发生了GC-AG的可变剪切产生了OsUBP1的重要功能结构域Cys Box。水稻OsUBP1基因和OsSPO11-1基因位于11号染色体的同一基因座位上。原位杂交分析表明，在花中OsUBP1 mRNA 主要在药壁绒毡层、花粉粒、大孢子囊和颖花底部维管束中表达。转反义OsUBP1植株大多不能正常结实，这说明OsUBP1可能参与水稻的育性调节。 关键词

MADS-box基因在单子叶植物花发育中的功能研究

第一部分 水稻E类MADS-box 基因在花发育中的功能分析 MADS-box 基因是一个大的转录因子家族，在花发育过程中起重要作用。根据对双子叶模式植物拟南芥、金鱼草和矮牵牛遗传突变体的研究，提出了花发育的ABCDE模型。该模型认为：A、B、C、D、E代表了5类功能不同的花器官特征基因，单独或联合控制花器官的发育。A类基因控制萼片的发育;A、B和E类基因控制花瓣的发育;B、C和E类基因控制雄蕊的发育;C和E类基因控制心皮的发育;D类基因控制胚珠的发育;A和C类基因相互抑制。在这5类基因中，E类基因的功能较为复杂，它不仅是花器官特征基因，而且具有花分生组织决定性（Floral meristem determinency）。在单子叶植物中，E类基因的功能发生了很大的分化。水稻是单子叶植物的模式植物，水稻中至少有5个E类基因，分别是OsMADS1、OsMADS5、OsMADS7、OsMADS8和OsMADS34，在这5个E类基因中，除了对OsMADS1基因有较深入的研究外，对其它几个E类基因的功能了解甚少。我们在现有的研究基础上，根据对双子叶植物中E类基因的研究结果，以OsMADS8基因为出发点，利用组织原位杂交，RNAi技术对水稻中的E类基因进行了深入的研究。结果表明：OsMADS8/7基因早在花序枝梗分生组织原基就有转录，随着小穗的生长发育，逐渐集中在小穗分生组织原基，小花分生组织原基，浆片、雄蕊和心皮中表达;在胚珠形成时，内外珠被有很强的杂交信号，而且在幼胚和胚乳中也有表达。OsMADS5在幼花时期，四轮花器官均有表达，在小穗发育后期及受精后的表达方式与OsMADS8/7基因相同。OsMADS8基因被抑制后，转基因植株没有任何表型变化，说明很可能有其它E类基因弥补了OsMADS8基因的功能缺失;当同时抑制其它E类基因的表达时，转基因植株抽穗期明显延长，四轮花器官的发育均受到影响：稃片类似叶片状;浆片转变为稃片类的结构;雄蕊没有花粉;心皮具有了稃片的特点;没有胚珠结构的形成，同时失去了花分生组织决定性，在心皮的部位产生了新的花器官或花分生组织逆转为花序分生组织。说明水稻四轮花器官及胚珠的正常发育需要E类基因的参与，但其功能与双子叶植物如拟南芥，西红柿、矮牵牛等直系同源基因相比已经发生变化;水稻中的E类基因在维持花分生组织特征性方面起重要作用;另外对抽穗期有影响。 第二部分 玉米MADS-box基因ZAG2转录调控区的研究 基因的时空表达受基因中的顺式作用元件及其反式作用因子调控。顺式作用元件由位于基因编码区上游的启动子区域和位置不确定的增强子区域组成。顺式作用元件对基因表达的开启至关重要。MADS-box 基因编码一类控制花器官发育的转录因子，在花的发育过程中顺序表达。MADS-box 基因突变，花器官发生同源异型转换。研究MADS-box 基因的调控序列可以进一步揭示影响基因时空表达的内外因素。ZAG2是玉米MADS-box 基因中的D类基因，控制胚珠的发育，在胚珠和心皮的内表面特异表达。ZAG2基因有7个外显子和6个内含子。我们从玉米基因组分离到了ZAG2基因翻译起始点上游3040bp的序列，并利用5’-RACE方法鉴定出了转录起始点的位置。序列比较发现，在 5’-UTR内有一个1299bp的内含子，这个内含子可能对基因的表达有调控作用，因此构建了两个与GUS基因融合的表达载体：一个是pZAG2-1::GUS，包括翻译起始点以上所有的调控序列;另一个是pZAG2-2::GUS，去掉了5’-UTR中的内含子序列，转化水稻。结果这两个构建都没有使GUS基因在正确的位置表达。pZAG2-1::GUS构建在心皮基部类似花托的部位及稃片顶端着色，pZAG2-2::GUS构建在内外稃片沿稃脉的部位有很强的着色，说明翻译起始点上游的调控序列不足以使基因正常表达。两个构建着色方式不同，可能pZAG2-1::GUS构建在5’-UTR部分含有抑制ZAG2基因在稃片表达的顺式元件，或者启用了在5’-UTR中的转录起始点，因为在5’-UTR的内含子中也有一个很典型的TATA-box。我们推测，在ZAG2基因编码区的第一内含子可能存在另外一些使基因正常表达的增强元件，需要进一步的序列缺失实验加以验证。

拟南芥功能获得突变体sef的研究

植物顶端分生组织中干细胞数量的维持对于侧生器官的发生至关重要。在干细胞的基因调控网络中WUSCHEL (WUS) 是一个关键成员，围绕该基因形成两个反馈调节环，控制分生组织中干细胞群的平衡。 　　论文分析了用激活标签法 (activation tagging) 获得的突变体sef (stem-ecotopic-flowers)，其最大的表型特点是花序轴上产生异位花和幼苗下胚轴增长。本论文就此两个表型产生的机理进行了探索，以期了解WUS基因的新功能。 　　对sef的表型观察发现异位分生组织不仅在花序轴上出现，而且也出现在叶柄、叶片、托叶叶腋内、花梗、花梗腋内以及花器官上。组织切片结果表明花序轴上的异位分生组织起源于已经分化的皮层细胞。对突变体的分子鉴定证明T-DNA是以单拷贝插入到WUS起始密码子上游810 bp处。对插入位点上下游各10 kb的4个基因在花序轴中的表达水平进行了分析，结果表明只有WUS基因的表达量升高，说明增强子只对WUS基因发挥了激活作用，暗示了WUS基因过表达与异位花之间存在某种联系。转35S::WUS的拟南芥幼苗下胚轴与根部出现异位的生长点;WUS被诱导表达的突变体pga6-1花序轴上出现异位花芽，证实sef的表型是由WUS超表达所导致。利用组织原位杂交和RT-PCR分析了WUS、CLAVATA3 (CLV3)、LEAFY (LFY) 与AGAMOUS (AG) 在异位分生组织中的表达模式与表达水平，结果表明WUS、CLV3、LFY、AG在花序轴表皮以下皮层中异位表达。这些结果表明WUS能激活CLV3异位表达，从而在已经分化的皮层中重新产生具有分生组织特征的细胞，同时WUS异位激活AG的表达并使LFY也在这些异位的分生组织中表达，这些分生组织发育方向被LFY与AG所决定，最终发育为异位花器官。 　　sef突变体另外一个突出的表型是幼苗的下胚轴增长。对幼苗期下胚轴以及胚胎4个时期的胚干细胞数进行统计，结果表明下胚轴与胚干细胞数目都呈现出sef比野生型多而wus-1比野生型少的趋势，因此sef幼苗下胚轴增长是由于细胞数目改变引起的。进一步分析发现这种区别是由于胚胎早期（授粉后1~3天）胚干细胞分裂速率的差异所造成的。利用基因芯片杂交分析突变体的基因表达谱，结果发现许多与细胞分裂相关的基因在sef中表达水平升高。RT-PCR证实这些基因在胚胎时期的表达水平升高，说明胚胎早期胚干细胞分裂速率的不同导致了幼苗下胚轴的异常。 　　综上所述，我们的研究结果揭示了sef异常表型的产生的可能机制。在已经分化的皮层中激活标签介导的WUS超表达激活干细胞标志基因之一CLV3和花器官基因AG，并使LFY异位表达，重新产生具有分生组织特征的细胞，这些分生组织的发育方向被LFY和AG所决定，最终发育为异位花。在sef的早期胚胎中，WUS表达增强使细胞分裂相关基因表达水平升高、细胞分裂增快，说明WUS与细胞周期相关基因的调控存在某些联系。 　　本论文的创新之处在于首次提出WUS表达增强能在分化的组织中产生具有分生组织特征的细胞以及WUS调控细胞分裂的结论。 　　

抗氧化剂对大豆下胚轴GUS基因瞬时表达率的影响

大豆是我国最重要的油料作物之一，在我国的农业乃至幽民经济中占有重要地位。但是，由于我国人豆品质较差、产量较低，严重地影响着我国的大豆牛产及其在国际市场上的竞争力。农杆菌介导的转基因方法是大豆改良的最简便和最经济的方法之一，然而大豆基因转化效率低一直是大豆基因工程的主要限制因素。本研究以含有GUS报告基因和NPT II筛选基因的农杆菌1301侵染大豆子叶节和下胚轴，并用组织化学定位法测定GUS基因在叶节和下胚轴上瞬时表达，研究了抗氧化剂对提高大豆基因转化效率的影响，为建立大豆高效基因转化体系奠定基础。 以子叶节为外植体，用农杆菌侵染和共培养后进行GUS染色，观察其瞬时表达情况。在培养基中不含抗氧化剂的情况下，子叶节上未发现染色点，仅在下胚轴侧面有极少染色点。而在培养基巾含有抗氧化剂的情况下，外植体上产生了人量GUS染色点，其中大部分位于下胚轴处，子叶节部位几乎很少被染色。这说明下胚轴比f叶节更容易接受外源基因。本论文分别以子叶节和下胚轴为外植体进行研究。 以子叶节为外植体，在抗氧化剂作用下用农杆菌侵染，诱导丛生芽，在含有潮霉素的筛选培养基上培养，以筛选抗性苗。实验只得到一株抗性幼苗。 为了进一步研究抗氧化剂对GUS暴凶在下胚轴中瞬时表达的影响，我们特别以下胚轴为外植体，测定了多种条件下的瞬时表达率情况。 我们研究了共培养时间对大豆下胚轴基因瞬时表达率的影响，通过确定合适的共培养时间以获得最佳转化率。在共培养2天后，GUS基因的表达率是8%，但是在3天后，GUS基因瞬时表达率大幅度上升，达到23.4%。随后两天GUS基因瞬时表达率没有太大变化，因此，大豆下胚轴的GUS基因瞬时表达的最适共培养时间为3天。 农杆菌再悬浮液稀释浓度对大豆下胚轴GUS基因瞬时表达也有较大影响：再悬浮培养基与农杆菌菌液等体积时，GUS基因瞬时表达率最高，随稀释浓度提高，转化效率降低。这说明随农杆菌菌液浓度提高，侵染几率增加，从而提高了GUS基因的瞬时表达率。 很多研究表明大豆基因转化存在很大的品种问差异，我们选择了四种基因型差异较大的品种在上述最佳条件下分别测定了GUS基因瞬时表达率，但没有发现品种之间存在显著差异，说明抗氧化剂在大豆下胚轴基因转化中具有品种普遍适用性。 上述研究结果表明抗氧化剂能够大大促进GUS基因在下胚轴的瞬时表达，这对于今后开展大豆基因组研究和品质改良工作具有一定意义。

Cytogenetic Effects of Low Doses of Energetic Carbon Ions on Rice After Exposures of Dry Seeds, Wet Seeds and Seedlings

In order to investigate the biological effects of heavy ion radiation at low closes and the different radiosensitivities of growing and non-growing plants. rice at different lift stages (dry seed, wet seed and seedling) were exposed to carbon ions at closes of 0 02, 0.2, 2 and 20 Gy. Radiobiological effects on survival, root growth and mitotic activity, as well as the induction of chromosome aberrations in root meristem. were observed The results show that radiation exposure induces a stimulatory response at lower close and an inhibitory response at higher dose on the mitotic activity of wet seeds and seedlings Cytogenetic damages are induced in both seeds and seedlings by carbon ion radiation at doses as low as 0.02 Gy Compared with seedlings. seeds are more resistant to the lethal damage and the growth rate damage by high doses of carbon ions, but are more sensitive to cytogenetic damage by low closes of irradiation Different types of radiation induced chromosome aberrations are observed between seeds and seedlings. Based on these results, the relationships between low close heavy ion-induced biological effects and the biological materials are discussed.

Breaking seasonal limitation: year-round sporogenesis in the brown alga Laminaria saccharina by blocking the transport of putative sporulation inhibitors

Year-round induction of sporogenesis of Laminaria saccharina was performed by mechanically blocking the transport of the putative sporulation inhibitors produced by the blade meristem and culturing the plants in constant short days. Sporogenesis was successfully induced by removal of the blade meristem, either by cultivating distal blade fragments or by performing a transverse cut in the frond. The earliest sorus formation after artificial induction was 10 days. The age of the sporophytes used for induction was 6-11 months or 2 years in tank-grown or field-collected sporophytes, respectively. Zoospores were successfully released in all cases. Thus, by year-round artificial induction of sporogenesis, (1) sporeling production of L. saccharina and thereafter sporophyte cultivation could be achieved without seasonal limitation, and (2) the life cycle of L. saccharina (from spore to spore) could be completed within 8 months under controlled conditions. (C) 2004 Elsevier B.V. All rights reserved.

Floral organogenesis and development of two taxa of the Solanaceae - Anisodus tanguticus and Atropa belladonna

Floral organogenesis and development of two Solanaceae species, Anisodus tanguticus and Atropa belladonna, were studied by using scanning electron microscopy (SEM) as part of a project on systematics and evolution in the tribe Hyoscyameae. These two species share the following common characters of floral organ initiation and development: (1) initiation of the floral organs in the two species follows Hofmeister's rule; (2) the mode of corolla tube development belongs to the "late sympetaly" type, namely, petals are initiated separately and later become joined by fusion of their basal meristem, then rise together and form a corolla tube; (3) primordia of the floral appendages are initiated in a pentamerous pattern and acropetal order: sepals are initiated first, followed by the petals and stamens, and finally the carpels. The whorl of five stamen primordia forms almost simultaneously and originates opposite the sepal primordia, but initiation of the sepal primordia shows different modes in the two species. The sepal primordia of Anisodus tanguticus have simultaneously whorled initiation, while those of Atropa belladonna have helical initiation. The systematic significance of the present results in the genera Anisodus and Atropa is discussed in this paper.