不同地域卵黄萤荧光素酶基因的克隆与序列分析

为了比较不同地域萤火虫荧光素酶基因的进化关系,通过GenBank中已知的荧光素酶基因保守区段设计引物,利用5'-RACE(rapid-amplification of cDNA ends)和3'-RACE技术克隆了来自云南省文山州和西双版纳州的同种卵黄萤荧光素酶基因cDNA和全基因序列.来自不同地域的2种卵黄萤荧光素酶在基因序列上存在3个不同碱基位点,但是它们编码的荧光素酶只存在1个不同的氨基酸.卵黄萤荧光素酶基因全长(从起始密码子到终止密码子)1998 bp,包含7个外显子,6个内含子,其cDNA序列共1976 bp,包含102 bp 5'UTR(untranslated region)、1635 bp的荧光素酶基因开放阅读框和239 bp的3'UTR序列.卵黄萤荧光素酶基因的开放阅读框编码1个544个氨基酸的蛋白质,比同属的其它几种荧光素酶少4个氨基酸.来自2个不同地域的卵黄萤荧光素酶在进化上是比较保守的,它们与北美萤火虫Photinus pyralis荧光素酶在碱基序列上分别有62.9%和63%相似性.

卵黄萤荧光素再生酶基因的克隆与序列分析

目的 克隆和分析荧光素再生酶基因(LRE).方法 通过GeneBank中已知的荧光素再生酶基因保守区段设计引物,利用5'RACE(rapid-amplification of cDNA ends)和3'RACE技术克隆了来自云南省两双版纳州的卵黄萤(Luciola ovalis)荧光素再生酶基因cDNA和全基因序列.通过GeneBank、National Center for Bioteclmology Information和ProDom at the ExPASy Server软件和数据库进行序列分析.结果 卵黄萤荧光素再牛酶的cDNA序列和基因序列存在2个不同碱基位点,但是它们编码的荧光素再生酶是相同的.卵黄萤荧光素再生酶基因全长(从起始密码子到终止密码子)为1131 bp,包含5个外显子4个内含子,其cDNA 序列为1008 bp,包含924bp的荧光素酶基因开放阅读框和84 bp的3'UTR序列.卵黄萤荧光素酶基因的开放阅读框编码1个307个氨基酸的蛋白质.它与北美萤火虫(Photinus pyralis)荧光素再生酶在碱基序列和氨基酸序列上分别有61.8%和53.3%的相似性.结论 成功地克隆了荧光素再生酶的cDNA和基因序列,为其在基因工程中的应用奠定了基础.

国萤火虫的系统分类与进化研究

萤火虫因具有生物荧光现象而众所周知。狭义的萤火虫仅指萤科昆虫，而广义的萤火虫则包括萤科和雌光萤科昆虫。萤科和雌光萤科在分类上隶属于节肢动物门、昆虫纲、鞘翅目、多食亚目、软鞘类昆虫。萤火虫主要生活在热带和亚热带地区，广布于除南极洲以外的各大洲。中国地跨热带、亚热带地区，具有潜在的物种多样性，但在中国，尤其在大陆地区，对萤火虫的研究相对较少。为了更好的保护和应用中国的萤火虫，本文对中国萤火虫的系统分类和进化进行了初步研究。 本文先简单概述了自然界的发光生物类群、生物发光的原理、生物荧光的生物学意义及应用，之后，从以下几个方面对萤火虫的研究概况作了概述：首先，介绍了萤科的分类地位、形态特征、分类历史与现状，并根据文献初步总结了当前萤科分类中使用的属名、各属的物种数及地理分布概况；其次，介绍了雌光萤科的分类地位、形态特征及分类概况；第三，从宏观和微观两方面介绍了萤火虫的系统发育与进化研究概况。 根据对标本检视及对文献归纳整理的初步结果，中国萤科昆虫隶属于5亚科(Lampyrinae, Amydetinae, Luciolinae, Ototretinae, Psilocladinae)、13属(Lampyris, Diaphanes, Pyrocoelia, Lucidotopsis, Lucidina, Pristolycus, Lamprigera, Vesta, Luciola, Curtos, Drilaster, Stenocladius, Cyphonocerus)、116种，其中包括1个新种、10个中国新记录种。Lampyrinae 亚科包括7个属：Lampyris仅包括1种；Diaphanes包括18种，其中1个新种，3个中国新记录种；Pyrocoelia包括23种，其中2个中国新记录种；Lucidotopsis包括2种；Lucidina包括5种；Pristolycus包括6种，其中3个中国新记录种；Lamprigera包括3种。Amydetinae 亚科包括1个属即Vesta，该属在中国分布5种，其中1个中国新记录种。Luciolinae亚科包括2个属：Luciola包括28种，其中1个中国新记录种；Curtos包括9种。Ototretinae亚科包括2个属：Drilaster包括10种；Stenocladius包括2种。Psilocladinae亚科在中国仅分布1个属即Cyphonocerus，该属在中国仅分布3种。新种Diaphanes pectinealis的发现对Pyrocoelia和Diaphanes两个相似属的界定提出了新的挑战，因此，当前萤科昆虫分类学研究中，对这两个属的系统修订是急需的，这也表明中国萤科分类的研究对完善萤科的分类系统具有重要意义。 中国雌光萤科仅包括1个属即雌光萤属，该属主要分布于东洋区，已知种类32种，中国分布16种。为了更好了解这类特殊的发光甲虫，根据文献和对标本的检视，对雌光萤属的32种作了简要介绍，并根据文献编制了种检索表。 为了更好的探讨萤火虫的系统发育关系，本文对采自云南的18种萤科昆虫进行线粒体16S基因的部分测序，加上来自GenBank的已知同源序列，采用贝叶斯法、邻接法和最大简约法构建了包括日本、韩国和中国萤科的5个亚科、12个属共45个种50个种群及近缘科雌光萤科的1个种的系统发育树。根据所构建的系统发育树得出如下结论：萤科不是单系；Amydetinae亚科是萤科中相对原始的亚科，推测Lamprigera属（其亚科分类地位有争议，当前放在Lampyrinae）与Amydetinae有近缘关系；由于Pristolycus sagulatus （当前放在Lampyrinae，但其亚科分类地位也有争议）出现在Luciolinae中，Luciolinae的单系概念仍是一个有争议的课题；在Luciolinae中，Curtos 和Hotaria均为单系，但形态学和分子数据依然表明萤科最大的属Luciola不是单系，对这个属的再分是必需的；由于一些在亚科分类上有争议的属如Lamprigera和Pristolycus目前均放在Lampyrinae，因此，Lampyrinae是否是单系有待于这些属的分类工作的进一步完善；在Lampyrinae中，Lucidina 是单系；Pyrocoelia 和 Diaphanes均不是单系，但Pyrocoelia+Diaphanes是很好的单系。 本文首次讨论了Diaphanes属在萤科中的系统发育地位。结合形态学和行为学的观察，确立了采自云南高黎贡山的1个具有Pyrocoelia 和Diaphanes两个属的某些镶嵌特征但具有特殊的触角结构的1个特殊种即Diaphanes pectinealis的分属及新种地位。这一新种的发现对Pyrocoelia 和 Diaphanes两个属的界定提出了挑战。结合形态学、行为学和交配体系的概念，在萤科分类中应该对受性选择的特征如触角予以更多的关注。

中国两种萤火虫荧光素酶基因的分子克隆表达及其序列分析

本文通过5’-RACE和3’-RACE方法克隆了西双版纳地区的卵黄萤Luciola ovalis和端黑萤Luciola terminalis两种荧光素酶基因。两个荧光素酶基因被连接到pET-15b载体上并在BL21(DE3)菌株中表达。L. ovalis荧光素酶基因的开放阅读框有1635个碱基，编码一个544个氨基酸的蛋白。L. terminalis荧光素酶基因有一个1647bp的开放阅读框，编码一个548个氨基酸的蛋白。它们的氨基酸序列和北美萤火虫(Photinus pyralis)的氨基酸序列分别有65.3%和65.9%的相似性，而彼此之间又有73.5%的相似性。两种在大肠杆菌中表达的荧光素酶均有很高的活性，它们的最大发光波长分别是566 nm和563 nm。同时表达的四种荧光素酶(L. ovalis、L. terminalis、Hotaria parvula和Pyrocoelia miyako)在不同pH下活性变化很大，四种荧光素酶在pH 6.5-7.5之间有比较高的活性，其中L. ovalis和P. miyako两种荧光素酶在pH 7.0时活性最高，而另两种在pH 7.5时活性最高。当pH大于8.0时，这四种荧光素酶的活性都散失很快，可见它们对pH变化非常敏感。序列分析和结构模拟发现，荧光素酶活性位点周围有六个非常保守的结构域，这六个保守区域包含了大多数在催化发光反应中与底物荧光素和ATP结合的氨基酸。L. terminalis萤火虫荧光素酶的三级结构与L. cruciata荧光素酶晶体结构非常相似，而L. ovalis荧光素酶的三级结构在AMP结合位点附近有两个偏离的环。