栉孔扇贝凝集素家族基因研究

栉孔扇贝是我国北方重要的贝类养殖品种。自1997年以来爆发的栉孔扇贝大规模死亡，给地区经济造成了重大损失并且已经严重威胁扇贝养殖业的健康发展。然而，到目前为止，对扇贝免疫防御的分子机理了解还很少，深入研究扇贝免疫应答的分子机制是认识和了解病害发生和实现病害控制的关键问题之一。本研究采用了EST大规模测序结合cDNA锚定扩增的方法，从栉孔扇贝cDNA文库中克隆到五个C－型凝集素基因，并对其中部分基因进行了深入研究。 C－型凝集素CFLec－1的基因全长1785bp，其中含有5’非翻译区66bp，随后是666bp的开放阅读框；最后一条非常长的3’非翻译区1040bp，其中包含多个多聚腺甘酸加尾信号和polyA尾巴。栉孔扇贝CFLec－1编码221个氨基酸的蛋白，其N末端为15个氨基酸的信号肽。CFLec－1的成熟肽为206个氨基酸，其等电点为5.12，计算分子量为23.49kDa。SMART程序分析显示，C末端130氨基酸是一个标准的长型C－型凝集素结构域，其中四个半光胺酸（Cys104，Cys177，Cys193，Cys202）形成的两对二硫键维持了C－型凝集素的空间结构，而位于N末端的两个二硫键（Cys74，Cys85）构成了长型C－型凝集素结构域特有的一对额外二硫键。同源性分析表明，CFLec－1的C－型凝集素结构域与红原鸡的甘露糖受体中的C－型凝集素结构域有47％的相似度，与大西洋鲑的C－型凝集素受体C有31％的相似度。通过与其他同源的C－型凝集素结构域序列比对，发现了可能的糖结合位点EPD基域（Glu169-Pro170-Asp171）。通过RT－PCR研究CFLec－1在扇贝不同组织中的分布后发现，在健康扇贝中，CFLec－1在性腺中有中等程度的表达，在腮中有少量表达，在血淋巴和外套膜中有微量表达。经热处死的鳗弧菌刺激后，CFLec－1在几乎所有检测组织中的表达量都有明显的提高，其中，血淋巴中的表达量变化最为显著。这些结果说明CFLec－1是组成/诱导型基因，并且可能参与了黏膜防御。通过RT－PCR分析了CFLec－1在血淋巴中的表达特征后发现，在革兰氏阳性菌溶壁微球菌和革兰氏阴性菌鳗弧菌刺激后，CFLec－1的表达均显著高于对照组，并且成明显的随时间变化趋势。在大肠杆菌中表达的重组CFLec－1可以凝集革兰氏阴性菌大肠杆菌JM109，且凝集过程需要钙离子的参与。重组CFLec－1对大肠杆菌JM109有较弱的抑菌活性，对溶壁微球菌有明显的抑菌活性，对鳗弧菌没有抑菌活性。这一结果说明，CFLec－1可能不仅参与对入侵微生物的识别过程，而且可能作为效应分子起到了直接杀灭入侵微生物的作用。 CFLec-2的cDNA全长为708bp，其5’UTR为59bp。3’UTR为217bp。 CFLec-2的开放阅读框为432bp，编码160个氨基酸残基,其中包含5’信号肽17个残基。CFLec-2的编码区中含有一个C-型凝集素结构域。利用本研究中构建的原核表达载体，CFLec-2的成熟肽在大肠杆菌中被成功表达。 mCFLec-1的cDNA全长为2257bp，5’UTR17bp，3’UTR为713bp。mCFLec-1的开放阅读框为1527bp，编码508个氨基酸残基，其中包含17个氨基酸残基的信号肽序列。mCFLec-1的编码区含有三个串联的C-型凝集素结构域。利用本研究中构建的原核表达载体，mCFLec-2的成熟肽在大肠杆菌中被成功表达。 mCFLec-2的cDNA全长2086bp。其5’UTR长为18bp，3’UTR长为238bp。开放阅读框均为1776bp，编码609个氨基酸残基，其中包含N末端由18个氨基酸构成的信号肽。mCFLec-2的编码区包含四个C-型凝集素结构域。mCFlec-3的cDNA全长1897bp，其5’UTR和编码区与mCFLec-2几乎完全相同，只有个别碱基的差异。mCFlec-3的3’UTR为49bp。 本研究从扇贝机体本身的免疫机制入手，深入探讨其免疫机理，为进一步研究信号传导，了解扇贝先天性免疫的机制，为制定合理的研制策略提供坚实的理论基础；丰富和发展海水无脊椎动物免疫学的内容，为控制养殖生物疾病提供了新的思路；进一步通过高低等生物之间功能类似分子的同源性比对，为解释和阐明先天免疫这种已经存在数十亿年，从低等生物开始到人类仍旧保留且更加完善的免疫系统的奥秘和本质提供证据。