拮抗菌和化学物质的抑病机理及果实抗病相关基因的克隆

真菌病害是造成采后新鲜水果损失的一个主要原因。生物拮抗菌能有效地防治果实采后腐烂，降低杀菌剂的用量，从而增加了食品安全性和降低了潜在的环境危害。然而，与化学杀菌剂相比，单独使用生物拮抗菌对果实采后病害的控制效果有时不如化学杀菌剂明显。因此，为了提高拮抗菌的生防效力，有效控制果实的采后病害，本文主要研究了拮抗菌与化学物质使用的防病机理，并从冬枣果实中克隆β-1，3-葡聚糖酶基因并对其特性进行了初步分析。研究结果表明： 1. 酵母菌Cryptococcus laurentii和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis能够有效的防治冬枣果实采后青霉病和黑霉病的发生，而且C. laurentii对病害的防治效果比B. subtilis好。拮抗菌的抑病效果与使用浓度成正比。在接种C. laurentii的伤口上再接种病原菌可以显著刺激酵母菌的生长。然而，在接种B. subtilis的伤口上接种病原菌则不增加拮抗细菌的群体数量。 2. 不同酵母拮抗菌对四种杀菌剂（Deccozil，Sportak，Iprodine和Stroby）的敏感程度不同。其中，R. glutinis对Deccozil，Iprodione和Stroby最敏感。将低剂量的杀菌剂与酵母菌配合能显著增强酵母菌对采后病菌的抑制作用。C. laurentii与100 µl/L的Stroby配合能完全抑制青霉和黑霉病菌的孢子萌发。2%（w/v）的碳酸氢钠（SBC）与C. laurentii或T. pullulans配合使用显著抑制采后病菌(Penicillium expansum或Alternaria alternata)的孢子萌发和芽管伸长。SBC显著增强拮抗菌对梨果实采后青霉病和黑霉病的防治能力。C. laurentii对采后病害的防治效果好于T. pullulans的防治效果。 3. C. laurentii和B. subtilis对冬枣果实抗病性的诱导与接种距离和接种时间密切相关。距接种拮抗菌近的部位，抗性诱导就越强。酵母菌诱导果实的这种抗病性与诱导果实几丁质酶，β-1，3-葡聚糖酶， PAL，POD和PPO活性有关。 4. 采前喷施2 mM的水杨酸（SA）和0.2 mM的茉莉酸甲酯（MeJA）显著降低甜樱桃果实采后褐腐病的病斑直径， 并能诱导甜樱桃果实β-1，3-葡聚糖酶， PAL， POD和PPO活性以及乙烯含量的增加。采前处理对果实抗病性的诱导效果要好于采后处理。采前和采后SA或MeJA处理，贮藏于25C的甜樱桃果实β-1，3-葡聚糖酶和PAL活性显著高于贮藏于0C的甜樱桃果实的酶活性。2 mM的SA显著抑制了Monilinia fructicola的孢子萌发和菌丝扩展;而0.2 mM的MeJA则对M. fructicola几乎没有抑制作用。在贮藏早期，MeJA对果实β-1，3-葡聚糖酶和PAL活性的诱导作用要强于SA的诱导作用。 5. 1 × 108CFU/ml的C. laurentii，以及5 × 107CFU/ml的C. laurentii与0.2 mM的MeJA 配合使用均可诱导桃果实的抗性，并显著降低果实青霉病和褐腐病的病斑直径。0.2 mM的MeJA能促进C. laurentii生长，抑制P. expansum的菌丝扩展， 但对M. fructicola基本没有抑制作用。在25和0C，MeJA和C. laurentii单独或配合使用都诱导了桃果实几丁质酶，β-1，3-葡聚糖酶，PAL和POD活性的升高。这些抗病相关酶活性的升高可能与病斑扩展的程度是直接相关的。 6. 通过设计简并引物，采用降落PCR，扩增出β-1，3-葡聚糖酶基因的同源片段，分别克隆到两个彼此间同源性很低的β-1，3-葡聚糖酶的cDNA全长（Glu-1和Glu-2）。RT-PCR结果表明，Glu-1基因的表达受酵母拮抗菌C. laurentii处理所诱导，这一结果与酵母拮抗菌诱导果实β-1，3-葡聚糖酶活性的增加相呼应;而Glu-2基因的表达则不受C. laurentii处理所诱导。

果实对酵母拮抗菌和外源水杨酸诱导的抗病性应答机理

用生物和非生物因子来进行采后病害的防治，是一个非常有效的方法。诱导抗性作为控制果蔬采后病害的生物技术，已成为该领域的一个研究热点。然而诱导抗性的机制非常复杂，涉及到寄主、病原菌、激发子之间的相互作用关系。本研究主要利用酵母拮抗菌Pichia membranefaciens和SA处理果实，观察其抗性诱导表达和对采后青霉病菌（Penicillium expansum）的抑制作用，并从蛋白质组学水平上对诱导抗性的机理进行了分析。研究结果表明： 1、酵母拮抗菌P. membranefaciens (5 × 107 cells·ml-1)和SA(0.5 mM)处理采后甜樱桃果实，能够明显地降低病害的发病率和病斑直径。酵母菌和SA处理影响到了果实抗氧化酶的活性，同时还改变了POD同工酶谱和甜樱桃果实的总蛋白含量，并诱导了新的蛋白质条带产生。用光学显微镜和扫描电子显微镜技术观察发现，在in vitro条件下P. membranefaciens能够紧密地结合与病原菌的菌丝，而在in vivo条件下这种结合较为松散。 2、借鉴其它模式植物的方法，我们建立了一整套适用于多汁类植物材料的蛋白质组学研究方法。对于芒果，桃，甜樱桃、苹果以及冬枣等果实，都取得了重复性非常好的2-D图谱。我们应用该技术进一步研究了P. membranefaciens (1 × 108 cells·ml-1)以及SA (0.5 mM)处理对桃果实蛋白质组的诱导影响。结果显示，两种激发子处理都能够诱导桃果实产生抗性，从而减轻青霉病引起的腐烂。在诱导处理1 d以后，酵母拮抗菌和SA分别诱导22和16个蛋白的差异表达。质谱鉴定的蛋白属于6大类：代谢，防御反应，转录，能量途径以及细胞结构。有6个蛋白受到两种激发子的共同调控。其中，4种蛋白(包括glutathione peroxidase, polyphenol oxidase precursor, catalase和methionine sulfoxide reductase) 属于抗氧化蛋白，涉及到活性氧代谢。另2个蛋白（Major allergen Pru av 1和peroxidase）是病程相关蛋白，直接参与植物的防御反应。同时一些磷酸化酶和转录因子也受到两种激发子的调节从而参与果实的抗病反应。酶学测定和Northern杂交的结果表明，拮抗菌与SA处理均能影响过氧化氢酶活性及其基因的表达。 3、采前用较高浓度SA (2 mM) 短时间（10s）处理不同成熟期的甜樱桃果实，能够明显降低果实青霉病的病斑直径，并能减轻较低成熟度果实的发病率。在没有接菌的情况下，SA诱导了33个差异表达的蛋白，其中用质谱鉴定出了26个。而在接种病原菌的情况下，SA诱导了19个差异表达的蛋白，并鉴定出了其中的12个。这些蛋白分别涉及到代谢、防御反应、转录、能量途径、信号转导等过程。在没有接种病原菌的情况下，SA处理诱导了Putative DnaJ heat shock protein, PR1-like protein, Peroxidase, Major allergen Pru av 1 (Pru a 1)和Catalase等与抗病有关的蛋白。而在接种病原菌的情况下，诱导了PR1-like protein, Peroxidase和Catalase蛋白的差异表达。通过酶活性测定以及对细胞学定位的研究，我们发现在没有接种病原菌的情况下，POD的活性受到SA的诱导。但是在接种病原菌以后，诱导效果不明显。

果实成熟衰老与抗病性的调控机制研究

　　果实为开花植物所特有的发育器官，在种子的成熟和传播过程中发挥着重要作用。同时，肉质果实中含有丰富的营养物质，包括纤维素、维生素、抗氧化剂等，成为人们饮食的重要组成部分。由于果实的成熟衰老和抗病性直接影响果品的质量和市场价值，因此，研究果实成熟衰老和抗病性的调控机制具有重要的理论意义和应用前景。本文主要利用蛋白质组学的方法，探讨外源化学物质抑制果实成熟衰老和诱导抗病性的调控机制。 1. 硅对果实的抗病性诱导：用硅酸钠（1%）处理采后的甜樱桃果实，再接种褐腐病原菌（Molinilia fracticola），置于20C下，观测贮藏期间果实的发病率，并分析硅处理后诱导的主要蛋白质及调控机制。研究结果表明：硅酸钠处理可显著抑制贮藏期间褐腐病的发生，其抑病机理与硅诱导PR-蛋白的表达，提高果实的抗氧化水平，减轻由病原菌侵染造成的氧化胁迫相关。同时，硅处理还能保护细胞骨架结构，有利于增强果实对病原菌入侵的抵抗力。 2. 水杨酸对果实的抗病性诱导：用水杨酸（SA，2mM）在果园处理三种成熟度的甜樱桃果实，然后接种青霉病原菌（Penicillium expansum）观察其发病情况，并取样分析参与抗病性应答的主要蛋白质及调控机制。试验结果表明：SA处理能显著降低青霉病的发病率和抑制病斑扩展，而且SA对低成熟度甜樱桃果实的抗性诱导效果更好。在八成熟的果实中，有5个热激蛋白和4个脱氢酶蛋白被SA诱导，这些蛋白参与了糖酵解和三羧酸循环。抗氧化蛋白和PR蛋白主要参与较低成熟度果实的抗性应答，而热激蛋白和脱氢酶在较高成熟度果实的抗性应答中更明显，SA诱导的抗性与代谢途径相关。 　　3. 草酸对果实的抗性诱导：用5mM的草酸处理冬枣果实后，接种青霉菌（P. expansum），观察果实发病情况，测定果实相关的生理指标，分析参与果实抗性应答的主要蛋白质及调控机制。结果表明：草酸能明显延缓冬枣果实的衰老，提高果实对青霉菌的抗性。草酸处理能抑制果实乙烯的释放量和呼吸强度，延缓叶绿素的降解，减少乙醇积累。利用蛋白质组学的研究方法证实了在25个参与了草酸处理应答的蛋白中，胱硫醚-β-合酶结构域包含蛋白（CBB domain-containing protein）和3个与光合作用相关蛋白[二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase activase, chloroplast precursor），二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基结合蛋白（RuBisCO large subunit-binding protein subunit beta, chloroplast precursor），植物光系统Ⅱ放氧复合蛋白2（PSII oxygen-evolving complex protein 2）]的表达量上调，乙醇脱氢酶的表达量出现下调。草酸处理还提高了与乙烯合成前体相关蛋白的表达，抑制了ACC合成酶的活性。草酸提高果实抗病的机制与延缓果实成熟衰老和保持果实抗性有关。 4. 果实衰老的调控机制：采用高氧（100%）和低氧（2-3%）处理苹果果实，观察果实衰老的进程，并基于蛋白质组学的研究方法，探讨苹果果实衰老与线粒体蛋白质组的关系。结果表明，在苹果衰老过程中有22个蛋白的表达量发生变化，这些蛋白主要参与了三羧酸循环，电子传递，碳代谢和胁迫应答。高氧处理能诱导氧化胁迫，加速了果实的衰老。质谱鉴定结果证明：在高氧胁迫下，超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD）和线粒体外膜通道蛋白（porin) 的表达量降低，MnSOD的活性受到抑制，由此提高了线粒体中超氧阴离子的含量，增加了蛋白质的氧化损伤。 此外，高氧处理改变了porin的功能，导致了线粒体膜的透势发生变化，从而引起外膜损伤。由此阐明了活性氧在果实的成熟衰老调控中的重要作用。

酵母拮抗菌和外源水杨酸对核果类果实抗病相关基因的诱导表达

在果实采后贮藏过程中，病原真菌的侵染会引起果实腐烂，造成巨大的经济损失。利用生物和非生物因子诱导果实抗病性，已经成为采后病害防治领域的一个研究热点。本文主要利用RT-PCR和RACE技术克隆果实抗病相关基因，通过分子杂交和蛋白羰基化免疫检测技术，研究了外源SA和酵母拮抗菌诱导果实抗病性机理，结果表明： 1. 通过优化RNA提取方法，能从含有多糖的冬枣、葡萄、甜樱桃、桃、番茄等果实中提取到质量较好的RNA，用于RT-PCR和Northern杂交。 2. 采用RT-PCR和RACE方法，从甜樱桃果实克隆了两个抗氧化相关基因CAT2（Genbank：EF165590）和GPX（Genbank：EF165591）和两个PR基因GLU-1（Genbank：EF177487）和GLU-3（Genbank：EF177488)。其中CAT2全长cDNA序列为1479 bp，编码492个氨基酸；GPX全长cDNA序列为513 bp，编码170个氨基酸；GLU-1全长cDNA序列为1050 bp，编码349个氨基酸；GLU-3部分cDNA序列为454 bp，编码141个氨基酸。 3. 酵母拮抗菌Pichia membranaefaciens处理不同成熟度的甜樱桃果实，能显著降低果实贮藏期间青霉病（Penicillium expansum）的发生，并且对低成熟度果实的病害防治效果更为明显。酵母拮抗菌的抑病机理与减轻了甜樱桃果实蛋白羰基化程度，诱导了果实抗氧化酶基因（CAT和GPX）和PR基因（GLU-1）的表达和提高了抗氧化酶（CAT和GPX）和β-1,3-葡聚糖酶的活性有关。 4. 四种酵母拮抗菌P. membranaefaciens, Cryptococcus laurentii, Candida guilliermondii和Rhodotorula glutinis处理桃果实，可显著降低贮藏期间的褐腐病（Monilinia fructicola）。这是由于酵母拮抗菌能抑制病原菌侵染造成的氧化胁迫和蛋白羰基化。此外，酵母拮抗菌处理还能显著诱导CAT、POD、几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶活性及相应基因的表达。 5. 水杨酸（SA，2 mM）处理采后不同成熟度的甜樱桃果实，能显著降低青霉病的危害。其抑病机理与SA处理能减轻P. expansum侵染引起的果实蛋白羰基化程度，显著提高CAT、GPX和β-1,3-葡聚糖酶基因的表达和相关的酶的活性有关。而2 mM的SA处理对P. expansum的生长没有直接抑制作用。 6. 水杨酸（SA，2 mM）与P. membranaefaciens（1×108 CFU/ml）配合处理能显著降低低温贮藏期间桃果实的褐腐病，并能提高几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶和POD的活性和相关基因的表达。另外，2 mM的SA对拮抗菌P. membranaefaciens的生长没有影响，但能够抑制病原菌M. fructicola的孢子萌发和菌丝扩展。

离子辐照生防菌BJ1突变菌株选育及其诱导抗性机制的研究

目的： 利用重离子辐照技术选育出对农作物具有更好防病促生作用的突变生防菌株，探讨利用突变株诱导黄瓜对枯萎病菌产生抗病性的作用机制。 材料与方法： 采用兰州重离子研究装置(HIRFL)加速的碳离子束辐照生防菌BJ1，测定抑菌能力、抑菌谱，确定对该菌株最适宜的离子辐照参数，选育突变菌株。对突变株进行室内盆栽和田间防病促生试验。对原菌株和突变株进行16SrDNA和生理生化反应鉴定，确定分类地位。以突变株为对象进行诱导黄瓜对枯萎病菌产生抗病性的实验。 结果与结论： 1.重离子辐照生防菌BJ1的存活曲线随剂量的增加，呈先降后升再降的马鞍型变化，但是由于离子的能量不同也存在差异，表现为在相同的剂量下，能量越低其能量沉积效应即传能线密度（LET）越大，致死率越高。诱变效果随LET的不同也不尽相同，高LET时的突变株不但有更广的抑菌谱而且抑菌活性较对照也有比较大的提高，在存活率较高的条件下，低剂量就可以得到较多的突变体，有利于筛选优良的正突变体； 2.对于生防菌BJ1最适宜的12C6+辐照参数应选择剂量在200-400Gy，LET为60keV/m范围可筛选获得抑菌活性较高的菌株； 3.通过12C辐照结合抑菌试验最终获得了突变菌株154，该突变株通过20代的移植能够稳定遗传； 4.利用突变株154对黄瓜枯萎病菌进行室内盆栽促生试验，结果表明突变株154能够使促进黄瓜幼苗的生长发育，同时提高了黄瓜植株的抗病性，在对黄瓜枯萎病的防治效果上经154处理的达到了70.34%，高于原菌株和农药防治的效果； 5.传统的生理生化特征结合16SrDNA同源性比对的方法，对菌株BJ1及其突变株154的鉴定结果表明二者均属枯草芽孢杆菌，亲缘关系近，但是突变株154生化测定不同于原菌株，表现为抗菌物质的产量较高； 6.BJ1、154都可在番茄、当归和黄芪的根部有效的定殖，适应根部的生长环境， 并且154的定殖能力稍强； 7.BJ1、154防治当归麻口病效果较好，防治效果最好的是154的20倍液浸苗，防效为82.6%；BJ1的20倍液浸苗与154的10倍液浸苗对麻口病防治效果差别不大，防效分别为78.3%、75.62%；其余处理防效低于62%。 8.BJ1和154处理黄瓜幼苗后，植物体内一系列与抗病性有关的保护酶的活性均有不同程度的提高，因而可认为这些酶活性的改变与生防菌诱导的黄瓜对枯萎病的抗性可能有一定的相关性

Radio-resistance induced by nitric oxide to heavy ion irradiation in A172 human glioma cells

To investigate effects of nitric oxide on cellular radio-sensitivity, three human glioma cell lines, i.e. A172, A172 transfected green fluorescence protein (EGFP) gene (EA172) and A172 transfected inducible nitric oxide synthesis (iNOS) gene (iA72), were irradiated by C-12(6+) ions to 0, 1 or My. Productions of nitric oxide and glutathione (GSH) in A172, EA172 and iA172 were determined by chemical methods, cell cycle was analyzed by flow cytometry at the 24th hour after irradiation, and survival fraction of the cells was measured by colorimetric MTT assay at the 5th day after irradiation. The results showed that the concentrations of nitric oxide and GSH in iA172 were significantly higher than in A172 and EA172; the G(2)/M stage arrest induced by the C-12(6+) ion irradiation was observed in A172 and EA172 but not in iA172 at the 24th hour after exposure; and the survival fraction of iA172 was higher than that of EA172 and iA172. Data suggest that the radio-sensitivity of the A172 was reduced after the iNOS gene transfection. The increase of GSH production and the change of cellular signals such as the cell cycle control induced by nitric oxide may be involved in this radio-resistance.

Improved Analysis Method for Wave-Induced Pipeline Stability on Sandy Seabed

The existing Det Norske Veritas DNV Recommended Practice RP E305 for pipeline on-bottom stability is mainly based on the pipe–soil interaction model reported by Wagner et al. in 1987, and the wake model reported by Lambrakos et al. in 1987, to calculate the soil resistance and the hydrodynamic forces upon pipeline, respectively. Unlike the methods in the DNV Practice, in this paper, an improved analysis method is proposed for the on-bottom stability of a submarine pipeline, which is based on the relationships between Um/ gD 0.5 and Ws / D2 for various restraint conditions obtained by the hydrodynamic loading experiments, taking into account the coupling effects between wave, pipeline, and sandy seabed. The analysis procedure is illustrated with a detailed flow chart. A comparison is made between the submerged weights of pipeline predicted with the DNV Practice and those with the new method. The proposed analysis method may provide a helpful tool for the engineering practice of pipeline on-bottom stability design.

On The Thermally Induced Interfacial Delamination Of A Segmented Coating

The thermally induced interfacial delamination problem of a segmented coating is investigated using finite element method (FEM). The coating-substrate system, modeled as a coated semi-infinite medium with periodic segmentation cracks within coating, is assumed to be exposed to convective cooling from surface. The failure criterion based on the interfacial fracture toughness is adopted, in which the energy release rate for an interface crack is considered to be the driving force for interfacial delamination extension. The results confirm that a segmented coating has higher delamination resistance than an intact one under the same thermal transients, as the segmentation crack spacing is smaller than a critical value. Based on dimensional analysis, sensitivity analyses of the crack driving force are also obtained as a function of various dimensionless parameters such as time, convection severity and material constants. These results may provide some helpful references for the integrity of coating-substrate systems under thermal loading. (C) 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.

On The Thermally Induced Cracking Of A Segmented Coating Deposited On The Outer Surface Of A Hollow Cylinder

In this work, the thermally induced cracking behavior of a segmented coating has been investigated. The geometry under consideration is a hollow cylinder with a segmented coating deposited onto its outer surface. The segmentation cracks are modeled as a periodic array of axial edge cracks. The finite element method is utilized to obtain the solution of the multiple crack problem and the Thermal Stress Intensity Factors (TSIFs) are calculated. Based on dimensional analysis, the main parameters affecting TSIFs are identified. It has been found that the TSIF is a monotonically increasing function of segmentation crack spacing. This result confirms that a segmented coating exhibits much higher thermal shock resistance than an intact counterpart, if only the segmentation crack spacing is narrow enough. The dependence of TSIF on some other parameters, such as normalized time, segmentation crack depth, convection severity as well as material constants, has also been discussed. (C) 2008 Elsevier B.V. All rights reserved.

Modified porous silica antireflective coatings with laser damage resistance for Ti:sapphire

Porous SiO2 antireflective (AR) coatings are prepared from the colloidal silica solution modified with methyltriethoxysilane (MTES) based on the sol-gel route. The viscosity of modified silica suspensions changes but their stability keeps when MTES is introduced. The refractive indices of modified coatings vary little after bake treatment from 100 to 150 Celsius. The modified silica coatings on Ti:sapphire crystal, owning good homogeneity, display prominent antireflective effect within the laser output waveband (750-850 nm) of Ti:sapphire lasers, with average transmission above 98.6%, and own laser induced damage thresholds (LIDTs) of more than 2.2 J/cm2 at 800 nm with the pulse duration of 300 ps.