Why do Chinese alligators (Alligator sinensis) form bellowing choruses: A playback approach

Crocodilians are quite vocal relative to other reptile groups, and the alligators are among the most vocal of the crocodilians. The Chinese alligator, Alligator sinensis, is usually solitary but engages in bellowing choruses in certain waters during the mating season. This paper reports the organization of Chinese alligator's bellowing choruses based upon field observations and playback experiments. Alligators of both genders engaged in the choruses, remaining immobile throughout and inclining toward bellowing synchronously (i.e., starting and finishing at about the same time). The choruses lasted about 10 min with abrupt onset and offset. Moreover, playback experiments revealed that both male and female alligators responded equally to bellowing stimuli from the same and opposite sexes and that none of the tested alligators approached the loudspeaker in spite of playback of male or female stimuli. These suggest that Chinese alligators. may not bellow to compete for or attract mates during the choruses. Instead, when their ecological behaviors, namely, dispersed inhabitation, multi-copulation, restricted mating season, etc., are considered, we hypothesize that they may synchronize bellows to enhance group detectability for assembling individuals into certain waters for subsequent copulations. (C) 2009 Acoustical Society of America. [DOI: 10.1121/1.3203667]

Response Specificity to Advertisement Vocalization in the Chinese Alligator (Alligator sinensis)

Stringency in the identification of conspecific call properties is essential among sympatric species to ensure conspecific mating, as the risk of improper recognition and heterospecific mating is high. In this study we investigated the basic signal structure required for intraspecies communication in the Chinese alligator (Alligator sinensis), a species that has no relatives living in sympatry, by playback of signals modified in the temporal (truncating original bellows with first 1/4, 1/2, 3/4 or last 1/4, 1/2, 3/4 portion) or frequency domain (with low- or high-pass filters at frequencies 100, 250, 500 and 1000 Hz), or by reversal of natural bellows. The playback experiments revealed that relatively large modifications in bellow temporal or frequency structure failed to impair Chinese alligators' bellowing behavior; even reversed bellows effectively evoked a positive response. In general, the first half of the bellow in temporal domain and frequencies below 500 Hz were critical for behavioral induction, while the last half of the bellow in temporal domain and frequencies above 500 Hz failed to produce a single positive response, implying a potential functional signal redundancy. The observed high tolerance to bellow variations in Chinese alligators may be an evolutionary adaptation to (1) the acoustic constraints of propagation imposed by dense vegetative habitats; or (2) a lack of selection pressure due to the low risk of incorrect conspecific recognition and heterospecific mating.

三种两栖类动物皮肤和脑中活性多肽结构、功能与多样性分析

两栖动物是最原始的陆生脊椎动物，分布比较广泛。无尾目两栖动物现有3000 多种，它们皮肤裸露、光滑，为适应广泛的栖息地和生态条件，已进化出各种有效的皮肤防御系统。抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）作为两栖类先天防御系统的重要组成部分，在皮肤分泌液中含量异常丰富。我们以来源于云南省普洱市景东县的铃蟾科微蹼铃蟾（Bombina microdeladigitora）和楚雄州双柏县雨蛙科华西雨蛙（Hyla annectans）为实验材料，对其皮肤分泌液中抗菌肽的分子多样性并对其结构和功能进行研究。微蹼铃蟾皮肤抗菌肽多样性非常丰富，我们从单一个体中克隆得到了64 条编码不同抗菌肽的cDNA 序列，其中有两条序列只编码Maximin 一种抗菌肽，其余 62 条均编码Maximin 和Maximin H 两类抗菌肽。这64 条cDNA 序列共编码44 种Maximins 和30 种Maximin Hs，其中有32 种Maximins 和20 种Maximin Hs 为新鉴定的抗菌肽，其余和铃蟾属其它种中发现的抗菌肽具有相同的序列。除了皮肤外，两栖动物的脑也是抗菌肽的丰富资源库。我们分别从微蹼铃蟾和大蹼铃蟾（B. maxima）脑中得到了大量新的抗菌肽cDNA 序列。其中从微蹼铃蟾脑中克隆到21 条新的cDNA序列，共编码16 种Maximins 和10 种Maximin Hs，其中7 种Maximins 和4 种Maximin Hs 为新鉴定的抗菌肽。从大蹼铃蟾脑中克隆到39 条新的cDNA 序列，编码27 种Maximins 和20 种Maximin Hs，其中16 种 Maximins 和12 种Maximin Hs 为新鉴定的抗菌肽。在以上新鉴定的抗菌肽中，Maximins 均为阳离子抗菌肽，Maximin Hs 中除以前鉴定的Maximin H5 外，尚有十余种阴离子抗菌肽。抗菌肽碱基转换/颠换（R=s/v）分析表明，RMaximin<1 而RMaximin H>1，说明这两种抗菌肽碱基转换和颠换发生的几率并不相同，Maximin 间差异主要由碱基颠换引起，而Maximin H 则主要由碱基转换引起。种间进化分析表明，大蹼铃蟾和微蹼铃蟾的遗传距离较近，而它们与欧洲花铃蟾（B. variegata）的遗传距离均较远。种内各部分遗传距离差异较大。与信号肽和酸性间隔肽相比，成熟肽的遗传距离明显增大，其中Maximin 的进化速度比Maximin H 更快。抗菌肽Maximin 和Maximin H 种内、种间均存在正选择（ω>1），而信号肽和酸性间隔肽在分化过程中没有正选择（ω<1），说明Maximin 和Maximin H 经受着达尔文正选择驱动的快速进化，是抗菌肽多样性产生的根本原因。这与抗菌肽参与最终的生物防御功能，从而增加物种对环境的适应是一致的。功能研究发现，有些微蹼铃蟾Maximins 抗菌肽是多功能分子，不但对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌起抗菌作用，而且还具有很强的抗氧化功能。脑中抗菌肽基因的大量表达也预示着抗菌肽可能在神经信号传导中起一定作用。用基因克隆方法我们从微蹼铃蟾皮肤得到大量缓激肽前体序列，由1-4 个拷贝的Bombinakinin 或1-4 个拷贝的Bombinakinin 和1 个拷贝的Bombinakinin-GAP 组成。这与大蹼铃蟾皮肤中缓激肽前体由1-8 个拷贝的Bombinakinin 或1-8 个拷贝的Bombinakinin 和1 个拷贝的Bombinakinin-GAP 组成有所不同。按同样方法，我们从大蹼铃蟾脑中也得到了三条缓激肽前体序列，其中两条含有6 个 Bombinakinin 拷贝，另一条含2 个Bombinakinin 拷贝。通过比较只含Bombinakinin 和同时含有Bombinakinin 和Bombinakinin-GAP 的前体cDNA 序列后发现， 前者序列中缺失了一段碱基序列TGCGGGTA， 从而导致移码突变， 终止了 Bombinakinin-GAP 的表达。通过生物化学的手段从微蹼铃蟾皮肤分泌液中分离到一种丝氨酸蛋白酶抑制剂BMSI1，与铃蟾属其它种中的胰蛋白酶抑制剂具有很高的相似性。根据已有铃蟾属丝氨酸蛋白酶抑制剂cDNA 序列设计引物，以皮肤cDNA 为模板，扩增丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因序列，结果得到两条不同的序列。这两条前体序列与铃蟾属其它两栖动物皮肤中的丝氨酸蛋白酶抑制剂具有高度相似性（>70%），而且它们都含有10 个半胱氨酸残基。BMSI1 对五种丝氨酸蛋白水解发色底物的抑制活性测定表明，BMSI 1 能抑制胰蛋白酶和凝血酶的水解活性，其K(i)分别为0.02 μM 和0.15 μM。通过随机筛选cDNA 文库的方法，我们从大蹼铃蟾脑中得到了一条完整的 Somatostatin（SST）序列，根据该序列，我们在大蹼铃蟾和微蹼铃蟾脑cDNA 文库中筛选到两条变异体序列SST-L(Leu11-SST-14)和SST-R(Arg14-SST-14)。功能研究表明，这两种变异体具有和SST 相似的生物学功能，可抑制肿瘤细胞增殖、抑制细胞因子释放以及具有一定的镇痛作用。从大蹼铃蟾和微蹼铃蟾脑中得到了阿片肽前体POMC 和Proenkephalin 的 cDNA 序列，序列比对发现与东方铃蟾具有较高的同源性。从华西雨蛙皮肤cDNA 中克隆得到两类活性多肽，命名为Annins。其中一类为抗菌肽类似肽，共11 条序列，编码单一的成熟肽序列，其信号肽与雨蛙科信号肽具有很高的同源性，但酸性间隔肽和成熟肽相差较大。其成熟肽由15-17 个氨基酸残基组成，活性分析表明无抗菌和抗氧化作用，但在较高浓度时对部分细菌和多种细胞有促进生长作用，推测可能在使伤口快速愈合方面起重要作用；另一类编码具有2 个拷贝的成熟肽序列，成熟肽由5 个氨基酸残基组成，具有一定的镇痛活性，其镇痛机理可能是拮抗bradykinin 作用。

雨蛙皮肤分泌液中两种活性蛋白结构和功能的研究

在本研究中我们首次从雨蛙皮肤分泌液中分离得到了一种神经毒素（命名为Anntoxin）和一种干细胞自我更新支持因子（命名为AnSF）。随后，我们通过构建雨蛙皮肤cDNA 文库，利用特异引物筛选到Anntoxin 和AnSF 的cDNA 编码序列，前者的Gene Bank 登录号为FJ598043，后者还在等待分配登录号。Anntoxin 具有60 个氨基酸，是一种Kunitz 类型的丝氨酸蛋白酶抑制剂，构建Anntoxin 的3D-NMR 溶液结构，证实Anntoxin 不同于有三对二硫键（键组合模式：1-6，2-4，3-5）的Kunitz 类型丝氨酸蛋白酶抑制剂，它只有两对二硫键（组合模式：1-4，2-3）。AnSF 具有123 个氨基酸，在C 端具有和Calmadolin 同源的两个EF 手指结构，能够支持人类胚胎干细胞（hESC）和猴神经干细胞（rNSC）的自我更新。为了进行Anntoxin 的生物活性和结构分析，我们在体外成功表达了 Anntoxin，获得了大量的重组Anntoxin（rAnntoxin）。经过生物活性分析， rAnntoxin 和天然分离到的Anntoxin 生物活性相当，都具有很强的胰蛋白酶抑制剂活性。Anntoxin 是一种Kunitz 类型的丝氨酸蛋白酶抑制剂，和来源于芋螺（Cone Snail）的神经毒素Conkunitzin-S1，黑色眼镜蛇毒液（black cobra, Dendroaspis polylepis polylepis）的树突毒素δ-DaTX 或蛋白酶抑制剂K 分别具有32.8%和36.7%的相同序列，和鱼类（fish）来源的Stonustoxin 也有一定的同源性。利用膜片钳技术分别检测Anntoxin 对大鼠背根神经节（rat DRG）上Na+通道，K+通道，Ca2+通道的作用，结果证明Anntoxin 对河豚毒素敏感（TTX-S）的钠离子通道（Nav）有较强的抑制活性，对 K+通道，Ca2+通道作用不明显。随后我们在非洲爪蟾卵母细胞上表达几种典型和常用于测试对亚型K+通道作用的Kv1.1，Kv1.2，Kv1.3，Kv2.1 和 Kv4.2，Kv4.3，Anntoxin 对这些亚型K+通道上的K+电流都没有明显影响。我们成功构建了Anntoxin 的3D-NMR 溶液结构（NMR 号：PDB ID 2KCR， BMRB ID 16094），证实Anntoxin 具有典型的Kunitz 结构，由反向平行的 β–折叠片和α–螺旋及转角组成梨形结构。利用RT-PCR，WesternBlot 以及 ELISA 技术，发现在皮肤、脑、肝、胃和肠中都能检测Anntoxin mRNA 转录，但只在皮肤、脑、肝和胃中有蛋白表达，表达量分别为29.5、5.39、 4.80 和2.02 微克/克鲜重，可以看出Anntoxin 在皮肤中大量表达，是皮肤分泌液中非常重要的组成部分。因为皮肤是雨蛙接触外界的第一屏障，雨蛙的生存环境中存在很多潜在威胁，比如微生物、吸血昆虫、鸟类、爬行动物、哺乳动物等，所以Anntoxin 有可能是雨蛙适应环境的重要化学武器，于是我们测试了Anntoxin 对甜菜夜蛾幼虫（Laphygma exigua Hubner）、水蛇（Enhydris plumbea）、鹌鹑（Coturnix coturnix）、昆明小鼠（Kunming mice）的急性毒性，其LD50 分别为50，450，2500 和3000 微克/千克体重，说明在华西雨蛙皮肤中大量表达的Anntoxin 对几类潜在天敌确实有较强的杀灭作用。为了检测AnSF 的生物学活性，我们在体外成功表达了AnSF，获得了大量rAnSF。设计三个浓度梯度10、100 和500ng/ml，把AnSF 和hESC 共培养，发现在10~100 ng/ml 浓度时对hESC 的自我更新有支持作用；设计三个浓度梯度10、100 和500ng/ml，把AnSF 和rNSC 共培养，发现在 10ng/ml 时对rNSC 的自我更新有较强的支持作用。在超过500ng/ml 高浓度时，AnSF 对hESC 和rNSC 都有明显的细胞毒性作用，对rNSC 的毒性作用更明显。利用RT-PCR 技术，我们检测了雨蛙的皮肤、肌肉、肝脏、胰脏、胃、肠、心脏和脑，AnSF 只在皮肤中有少量表达。这表明AnSF 可能只参与雨蛙皮肤干细胞库的维持，保持皮肤内环境稳定，因为蛙类的皮肤细胞要负责产生大量活性物质参与先天免疫和抗氧化等重要的生理活动，需要经常更新，而AnSF 的存在可能保证雨蛙皮肤干细胞库容量稳定，不断分化出各种成熟的皮肤细胞来使皮肤能够得到足够和及时的更新，保证其功能的正常行使。所以AnSF 是维持华西雨蛙皮肤内环境稳定的重要物质。