国萤火虫的系统分类与进化研究

萤火虫因具有生物荧光现象而众所周知。狭义的萤火虫仅指萤科昆虫，而广义的萤火虫则包括萤科和雌光萤科昆虫。萤科和雌光萤科在分类上隶属于节肢动物门、昆虫纲、鞘翅目、多食亚目、软鞘类昆虫。萤火虫主要生活在热带和亚热带地区，广布于除南极洲以外的各大洲。中国地跨热带、亚热带地区，具有潜在的物种多样性，但在中国，尤其在大陆地区，对萤火虫的研究相对较少。为了更好的保护和应用中国的萤火虫，本文对中国萤火虫的系统分类和进化进行了初步研究。 本文先简单概述了自然界的发光生物类群、生物发光的原理、生物荧光的生物学意义及应用，之后，从以下几个方面对萤火虫的研究概况作了概述：首先，介绍了萤科的分类地位、形态特征、分类历史与现状，并根据文献初步总结了当前萤科分类中使用的属名、各属的物种数及地理分布概况；其次，介绍了雌光萤科的分类地位、形态特征及分类概况；第三，从宏观和微观两方面介绍了萤火虫的系统发育与进化研究概况。 根据对标本检视及对文献归纳整理的初步结果，中国萤科昆虫隶属于5亚科(Lampyrinae, Amydetinae, Luciolinae, Ototretinae, Psilocladinae)、13属(Lampyris, Diaphanes, Pyrocoelia, Lucidotopsis, Lucidina, Pristolycus, Lamprigera, Vesta, Luciola, Curtos, Drilaster, Stenocladius, Cyphonocerus)、116种，其中包括1个新种、10个中国新记录种。Lampyrinae 亚科包括7个属：Lampyris仅包括1种；Diaphanes包括18种，其中1个新种，3个中国新记录种；Pyrocoelia包括23种，其中2个中国新记录种；Lucidotopsis包括2种；Lucidina包括5种；Pristolycus包括6种，其中3个中国新记录种；Lamprigera包括3种。Amydetinae 亚科包括1个属即Vesta，该属在中国分布5种，其中1个中国新记录种。Luciolinae亚科包括2个属：Luciola包括28种，其中1个中国新记录种；Curtos包括9种。Ototretinae亚科包括2个属：Drilaster包括10种；Stenocladius包括2种。Psilocladinae亚科在中国仅分布1个属即Cyphonocerus，该属在中国仅分布3种。新种Diaphanes pectinealis的发现对Pyrocoelia和Diaphanes两个相似属的界定提出了新的挑战，因此，当前萤科昆虫分类学研究中，对这两个属的系统修订是急需的，这也表明中国萤科分类的研究对完善萤科的分类系统具有重要意义。 中国雌光萤科仅包括1个属即雌光萤属，该属主要分布于东洋区，已知种类32种，中国分布16种。为了更好了解这类特殊的发光甲虫，根据文献和对标本的检视，对雌光萤属的32种作了简要介绍，并根据文献编制了种检索表。 为了更好的探讨萤火虫的系统发育关系，本文对采自云南的18种萤科昆虫进行线粒体16S基因的部分测序，加上来自GenBank的已知同源序列，采用贝叶斯法、邻接法和最大简约法构建了包括日本、韩国和中国萤科的5个亚科、12个属共45个种50个种群及近缘科雌光萤科的1个种的系统发育树。根据所构建的系统发育树得出如下结论：萤科不是单系；Amydetinae亚科是萤科中相对原始的亚科，推测Lamprigera属（其亚科分类地位有争议，当前放在Lampyrinae）与Amydetinae有近缘关系；由于Pristolycus sagulatus （当前放在Lampyrinae，但其亚科分类地位也有争议）出现在Luciolinae中，Luciolinae的单系概念仍是一个有争议的课题；在Luciolinae中，Curtos 和Hotaria均为单系，但形态学和分子数据依然表明萤科最大的属Luciola不是单系，对这个属的再分是必需的；由于一些在亚科分类上有争议的属如Lamprigera和Pristolycus目前均放在Lampyrinae，因此，Lampyrinae是否是单系有待于这些属的分类工作的进一步完善；在Lampyrinae中，Lucidina 是单系；Pyrocoelia 和 Diaphanes均不是单系，但Pyrocoelia+Diaphanes是很好的单系。 本文首次讨论了Diaphanes属在萤科中的系统发育地位。结合形态学和行为学的观察，确立了采自云南高黎贡山的1个具有Pyrocoelia 和Diaphanes两个属的某些镶嵌特征但具有特殊的触角结构的1个特殊种即Diaphanes pectinealis的分属及新种地位。这一新种的发现对Pyrocoelia 和 Diaphanes两个属的界定提出了挑战。结合形态学、行为学和交配体系的概念，在萤科分类中应该对受性选择的特征如触角予以更多的关注。

中国两种萤火虫荧光素酶基因的分子克隆表达及其序列分析

本文通过5’-RACE和3’-RACE方法克隆了西双版纳地区的卵黄萤Luciola ovalis和端黑萤Luciola terminalis两种荧光素酶基因。两个荧光素酶基因被连接到pET-15b载体上并在BL21(DE3)菌株中表达。L. ovalis荧光素酶基因的开放阅读框有1635个碱基，编码一个544个氨基酸的蛋白。L. terminalis荧光素酶基因有一个1647bp的开放阅读框，编码一个548个氨基酸的蛋白。它们的氨基酸序列和北美萤火虫(Photinus pyralis)的氨基酸序列分别有65.3%和65.9%的相似性，而彼此之间又有73.5%的相似性。两种在大肠杆菌中表达的荧光素酶均有很高的活性，它们的最大发光波长分别是566 nm和563 nm。同时表达的四种荧光素酶(L. ovalis、L. terminalis、Hotaria parvula和Pyrocoelia miyako)在不同pH下活性变化很大，四种荧光素酶在pH 6.5-7.5之间有比较高的活性，其中L. ovalis和P. miyako两种荧光素酶在pH 7.0时活性最高，而另两种在pH 7.5时活性最高。当pH大于8.0时，这四种荧光素酶的活性都散失很快，可见它们对pH变化非常敏感。序列分析和结构模拟发现，荧光素酶活性位点周围有六个非常保守的结构域，这六个保守区域包含了大多数在催化发光反应中与底物荧光素和ATP结合的氨基酸。L. terminalis萤火虫荧光素酶的三级结构与L. cruciata荧光素酶晶体结构非常相似，而L. ovalis荧光素酶的三级结构在AMP结合位点附近有两个偏离的环。