连续PCR扩增过程中异常现象的发生机理研究

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术从其发明以来，因为其操作的简单方便和高效率而在生物学研究的各个领域得到了广泛的应用，包括序列扩增、序列的人工突变、疾病诊断、法医学鉴定、基因的表达分析等等。从PCR技术发明以来，如何提高反应的特异性和反应的效率一直是人们所共同关心的题目，为此也发展了相当数量的各种方法，如热启动PCR、降落PCR、巢式PCR以及在反应体系中添加一些有益的附属物等。而适合不同目的的PCR技术也得到了充分的发展，如多重PCR、反转录PCR、定量PCR、原位PCR、PCR突变、毛细管PCR技术等等。并且，包括随机引物扩增多态、扩增片段长度多态性、简单重复序列多态性、单核苷酸多态性等这些在PCR技术基础上发展而来的各种分子标记技术极大地方便了遗传分析和遗传图谱的构建等工作。在PCR技术发明了20年后的今天，提高PCR的反应性能、发展适合新领域的PCR技术和新的分子标记技术仍然是研究者关心的题目和努力的方向。 　　PCR实验中已经观察到多种异常现象，除了常见的扩增失败（没有产物）、扩增产物特异性不强（有非特异产物出现）、引物多聚体产物扩增、扩增效率低等现象以外，还包括PCR介导的重组、跳跃、复制滑动等等。阐明这些异常现象的发生机理和过程，避免或缓解这些异常现象在扩增过程中对目的产物扩增的影响，以及促进和利用一些特殊的异常PCR扩增都是PCR技术研究所关心的话题。各种研究工作中经常需要扩增一些长片段的序列，但是在进行长片段PCR时经常会发现扩增目标序列的长度是有限的、扩增效率比较低、扩增产物检测中有很强的背景弥散等现象;同时长片段PCR需要一些特殊的反应体系组成和反应条件。如何更加有效地实现更长序列的PCR扩增也是人们所关心的话题之一。 　　常见的PCR产物重复扩增（以上一轮扩增产物为模板进行新的PCR扩增）扩增轮数少，通常仅进行一次重复扩增;同时，在重复扩增中常使用的策略是使用巢式引物。而连续PCR扩增实验（用相同的引物以产物为模板进行多轮次的连续重复PCR扩增）从未见于文献报道。我们第一次系统地进行了连续PCR扩增实验;同时，在实验过程中我们观察到了一种新的PCR扩增异常现象——用不同来源的模板（病毒、细菌质粒或真核生物来源的DNA序列）进行连续PCR扩增不同长度的靶序列，经过有限次数的重复扩增后，最终都会导致扩增失败;这种扩增失败都表现为在常规琼脂糖电泳检测时特异产物条带的消失和不能泳动出点样孔之复杂异常产物的出现;这种扩增产生的异常产物能够被稳定地重复扩增。用λ和细菌质粒序列为模板连续扩增不同长度靶序列的结果表明：连续PCR扩增失败的时期具有扩增靶序列长度的依赖性，越长的靶序列在连续PCR中扩增失败的时期越早。 　　对不同连续PCR扩增的扩增过程观察表明扩增产物经历了一个从高效特异性扩增到低效率特异性扩增，再到扩增产生复杂异常产物的过程。对复杂异常产物的甲酰胺辅助变性处理和变性胶电泳（尿素变性聚丙烯酰胺胶电泳和NaOH碱变性琼脂糖电泳）检测表明扩增产生的复杂产物主要由连续分布的小于靶序列长度的具有相当程度多样性的非全长链组成。连续PCR产生的复杂产物在内部具有局部的双链区域和大量的单链区域及外部单链分支，能够被单链特异的S1核酸酶消化，但是不能被双链特异的限制性内切酶消化。用DNase I或限制性内切酶处理连续扩增早期产生特异扩增产物形成不同长度序列组成的混合物，或者直接用不同扩增反应产生的不同长度的核酸序列组成混合物，混合物在经历变性-复性后都表现出类似连续PCR失败所产生的异常产物电泳行为。这些证据都表明PCR扩增过程中形成的非全长链成分是导致这种异常现象的关键因素，多个不同长度的非全长链复性形成“杂种分子”（具有较大且不一致的分子量和复杂的分支结构），最终表现为常规琼脂糖电泳异常的复杂产物。同时，异常产物组成非全长链成分和全长链成分是其能够实现稳定重复扩增的基础。 　　实验结果表明：对于特定长度的靶序列而言，导致复杂异常出现的根本原因是连续PCR扩增体系中所经历的总PCR热循环数目（每一轮PCR扩增所使用的循环数目多，成功连续扩增的轮数就少）;而扩增体系中的引物浓度、DNA聚合酶用量的多少、扩增程序中时间参数等对此影响较小;巢式PCR和单引物-互补引物PCR的结果表明这些处理对于缓解或延迟异常产物的出现有一定的作用。人工处理（DNase I或限制性内切酶处理）完整模板双链形成的非全长链长产物，然后把非全长链长产物以不同比例同完整模板混合模拟连续扩增后期产物，这种人工混合模板表明连续PCR扩增中同源的非全长链成分对PCR扩增有严重的干扰作用，是导致复杂异常产物出现的直接原因。 　　已有的研究表明：PCR介导重组、长片段PCR难于操作有共同的产生基础——扩增过程中非全长链成分的产生和非全长链成分对后续扩增过程的干扰作用。这一点和导致连续PCR失败的原因是一致的。非全长链成分的出现是PCR扩增过程中不可避免的，其最初产生的可能来源有三个：模板的损伤（扩增前的模板损伤或扩增热循环过程中的损伤）、聚合酶的忠实性、以及聚合酶的进行性。根据聚合酶的特性而调整扩增程序中延伸时间的实验表明，聚合酶的进行性不是导致连续PCR扩增失败的最主要原因。这种非全长链成分产物从无到有且不依赖于体系中非全长链成分的过程我们称之为非全长链成分的初级合成;而已经存在的非全长链成分干扰后续合成形成非全长链成分的过程我们称之为非全长链成分的次级合成。非全长链成分的初级合成和次级合成共同导致了连续扩增的失败和异常产物的形成。 　　从已有的研究结果看，任何降低PCR扩增过程中非全长链成分产生的措施，特别是聚合酶忠实性的提高，都能缓解异常扩增产物的出现和利于长片段PCR操作。 　　

一种改进的动物线粒体DNA提取方法

线粒体 DNA (mtDNA)已被广泛用于动物群体遗传学和进化生物学的研究, 并取得了许多有意义的结果. 有效的 mtDNA 提取方法无疑是开展这方面研究的前提. 关于动物 mtDNA 的提取方法, 国内外已有不少报导. 概括起来, 可分为: 1)氯化铯超速离心法, 2)柱层析法, 3)DNase法, 4)碱变性法. 该文报道了一种改进的碱变性提取法, 与其它方法相比, 具有应用范围广、简便、经济等优点。

特殊涡鞭毛虫——尖尾藻的核骨架

采用分级抽提, DGD包埋-去包埋剂电镜技术在特殊涡鞭毛虫——尖尾藻的细 胞核内显示出了一个纤维网络结构。此网络结构不溶于CSK液和可抽去微管与微 丝的溶液, 不被DNase所酶解和热三氯醋酸所提取,因而是一个非DNA性质的纤维 蛋白网络结构。有别于典型真核细胞的核纤层。首次证实了特殊涡鞭毛虫—— 尖尾藻已进化产生了核骨架结构,且与典型真核细胞的核骨架在形态结构上已很接近。图版1参17

小眼虫的核骨架研究

小眼虫细胞经轻度超声处理、选择性抽提后, 利用 DGD 包埋-去包埋剂电镜技术及 Western blot 分析技术对其核骨架、核纤层进行了研究. 结果显示: 细胞核内存在一个不被 DNase 所降解和热三氯醋酸所去除的纤维蛋白性网架结构; 核的周围有一层明显的核纤层结构; Western blot 分析表明其核纤层有两种阳性蛋白成分, 一为相当于高等真核细胞核纤层蛋白 lamin B 的强阳性成分, 另一为相当于 lamin A 的弱阳性成分, 但无相当于lamin C 的成分. 该文认为小眼虫这种低等的单细胞真核生物已具有了核骨架、核纤层结构, 其核纤层的蛋白组成应该代表了核纤层进化历程中早期的一个阶段。

The nuclear matrix of Euglena gracilis (Euglenophyta): A stage of nuclear matrix evolution?

Euglena gracilis cell was extracted sequentially with CSK-Triton buffer, RSB-Magik solution and DNase-As solution. DGD embedment-free electron microscopy showed that in the extracted nucleus there was a residual non-chromatin fibrous network. That it could not be removed by hot trichloroacetic acid further supported the idea that it was a non-histone, non-chromatin fibrous protein network, and should be the internal network of the nuclear matrix. After the sequential extraction, the nuclear membrane was removed, leaving behind a layer of lamina; the chromatin was digested and eluted from the dense chromosomes and residual chromosomal structures that should be chromosomal scaffold were revealed. Western blot analysis with antiserum against rat lamins showed that nuclear lamina of the cell possessed two positive polypeptides, a major one and a minor one, which had molecular masses similar to lamin B and lamin A, respectively. Comparing these data with those of the most primitive eukaryote Archezoa and of higher eukaryotes, it was suggested that the lower unicellular eukaryote E. gracillis already had the nuclear matrix structure, and its nuclear matrix (especially the lamina) might represent a stage of evolutionary history of the nuclear matrix. (C) 2000 Editions scientifiques et medicales Elsevier SAS.

特殊涡鞭毛虫（甲藻）尖尾藻(Oxyrrhis marina)核骨架的初步检查

为检查特殊的涡鞭毛虫－－尖尾藻(Oxyrrhis marina)是否已进化产生了核骨架结构，若有的话，又与典型真核细胞核骨架在形态结构上有何异同，用了两种方法。方法一是将分离出的尖尾藻细胞核，仿照P. R. Gook的方法用含高盐及去垢剂的分解液处理之后再经DNase除去DNA，用透射电镜观察。方法二是采用S. Penman实验室的分级抽提、DGD包埋－去包埋剂电镜技术，但根据尖尾藻的生理特性作了修改。此外还用了以热三氯醋酸除去核酸的方法。方法一的实验结果表明，尖尾藻细胞核内有一个起框架作用的纤维蛋白结构，此结构类似于用同一方法在典型真核细胞上所显示的“nuclear cage”结构。方法二的结果显示，尖尾藻细胞核内存在一个纤维网架结构，核仁与染色体都被网络于其间。其纤维粗细为2.8nm到24nm，它们与细胞（质）骨架中的中间纤维（IF）有着广泛的联系。此网架结构是由非DNA性质的纤维蛋白组成的，其中还含有对维持其三维结构所必需的RNA成分。它们的这些特点都十分相似于典型真核细胞核骨架的特点。另外尖尾藻的核纤层及核骨架纤维上所结合的核糖核蛋白颗粒（RNP）方面又与典型真核生物的有差别。本工作首次证明了特殊涡鞭毛虫毛类－－尖尾藻已有了核骨结构。

Gene transfection of hyperbranched PEI grafted by hydrophobic amino acid segment PBLG

The complex copolymer of hyperbranched polyethylenimine (PEI) with hydrophobic poly(gamma-benzyl L-glutamate) segment (PBLG) at their chain ends was synthesized. This water-soluble copolymer PEI-PBLG (PP) was characterized for DNA complexation (gel retardation assay, particle size, DNA release and DNase I protection), cell viability and in vitro transfection efficiency. The experiments showed that PP can effectively condense pDNA into particles. Size measurement of the complexes particles indicated that PP/DNA tended to form smaller nanoparticles than those of PEI/DNA, which was caused by the hydrophobic PBLG segments compressing the PP/DNA complex particles in aqueous solution. The representative average size of PP/DNA complex prepared using plasmid DNA (pEGFP-N1, pDNA) was about 96 nm. The condensed pDNA in the PP/pDNA complexes was significantly protected from enzymatic degradation by DNase1. Cytotoxicity studies by MTT colorimetric assays suggested that the PP had much lower toxicity than PEI. The in vitro transfection efficiency of PP/pDNA complexes improved a lot in HeLa cells, Vero cells and 293T cells as compared to that of PEI25K by the expression of Green Fluorescent Protein (GFP) as determined by flow cytometry. Thus, the water-soluble PP copolymer showed considerable potential as carriers for gene delivery.

青海家牦牛HIF-1α基因组织特异性表达

[目的]探究青海家牦牛HIF-1α基因组织的特异性表达。[方法]应用半定量反转录PCR和实时定量反转录PCR（SYBRGreen）技术对青海家牦牛HIF-1α基因的组织特异性表达进行检测。通过提取不同组织总RNA，经DNase I消化后，用随机引物进行反转录合成cDNA，采用特异性引物分别对HIF-1α和β-actin基因进行RT-PCR和Real Time RT-PCR扩增。[结果]结果表明，HIF-1α基因在心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、睾丸组织中均有表达，其中以睾丸和脾中HIF-1α基因表达量最高，肌肉的表达量最低。[结论]该研究为进一步揭示HIF-1α在高原土著动物低氧适应过程中的分子机制有着重要的意义。

高原鼠兔ob基因的组织表达特征

ob基因编码的leptin蛋白在调节生物体能量平衡中起到重要作用。本研究应用Taqman探针real time PCR技术对高原鼠兔ob基因的组织分布进行检测。通过提取不同组织总RNA，经DNase I消化后，用随机引物进行反转录合成cDNA，采用特异性Taqman探针和引物分别对ob基因及β-actin基因进行实时定量PCR扩增，对不同组织中ob基因和β-actin基因的初始拷贝数之比进行比较。结果表明ob基因在脑、心脏、肺、肝脏、脾脏、肾脏、骨骼肌、脂肪组织中均有表达，其中以白色脂肪组织中ob基因表达量最高，其次为心脏和肺，表达量最低的是肝脏和肾脏。