几种固氮菌突变种固氮酶的特性及晶体生长

一，缺失nifZ的棕色固氮菌突变种钼铁蛋白的晶体生长的研究进展 在一定的结晶条件下，缺失nifZ的棕色固氮菌突变种钼铁蛋白将从溶液中结晶出深棕色的短斜四棱柱晶体。PEG 8000、MgCl2、NaCl、Tris的浓度及缓冲液的pH对该蛋白的结晶及晶体生长影响的系统研究表明，它们的浓度和pH较低时，不出晶体;当pH高于8.0，随着前三种化合物浓度的逐渐提高，便在一周内出现大量小品体;再提高浓度后，便延长结晶时问但出质好、数少而个大的晶体;然后晶体随浓度的提高而又变小、变多、甚至晶质变差，直至不再出晶体。影响晶体生长的各因子的最适浓度随其它条件的改变而有所不同。当缓冲液的pH为8.2而PEG 8000，MgCl’、NaCI、蛋白质和Tris的浓度分别为1.86%、300 mmol/L、400 mmoUL、4.64g/L、53 mmo/L时，首次发现在一滴悬滴结晶液中只有一颗较大的优质晶体（最大两边线度均为0.16mm）。 二，从分别含Mn和Cr的培养基中生长的固氮菌突变种UW3中纯化的固氮酶的特性和结晶 缺失nifH基因的棕色固氮菌突变种UW3，在有钼环境中不能固氮生长，但能在无钼而含MnS01或Na2Cr01的无氮培养基中固氮生长。分别经超声破碎、加热除去部分杂蛋白、离子交换柱层析和Sephacryl S-200或S-300柱层析的分离纯化，分别得到二种固氮酶组分l蛋白。金属元素测定表明，这两种蛋白除含铁元素外还分别含有锰和铬元素。它们的吸收光谱、CD和AR谱互不完全相同，并都与OP-MoFe蛋白存在较大差异。含Mn固氮酶也能还原C2H2、质子和N2，对它们的还原的比活性都分别约为MoFe蛋白活性的50%。初步结果表明，这一突变种在这两种培养条件下都可能已表达了不同于已发现的三种固氮酶的新固氮酶组分l蛋白-MoFe、VFe和FeFe蛋白，分别为含Mn或Cr的固氮酶组分1蛋白，分别被称为uw3，-MnFe蛋白和UW3-CrFe蛋白。通过对PEG 8000、MgCI2、NaCI和缓冲液的种类和浓度等结晶条件的大量优化组合实验，首次获得uw3-MnFe蛋白和UW3-CrFe蛋白的的晶体。最大晶体为21.4×14.3×2.1μm。

固氮菌突变种DJ35钼铁蛋白和UW3细菌铁蛋白的纯化、特性、晶体生长及鉴定

一、棕色固氮菌突变种DJ35固氮酶钼铁蛋白的纯化、体外重组及结晶研究 　　棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii Lipmann)突变种DJ35的菌体破碎后，所得的未经加热的粗提物经DEAE Cellulose 52柱层析后得到部分纯的钼铁蛋白（ΔnifE Av1）和铁蛋白(Av2)。部分纯的ΔnifE Av1再经Sephacryl S-300和Q-Sepharose Fast Flow柱层析进一步纯化，便首次得到SDS凝胶电泳检测为基本纯的ΔnifE Av1。SDS-PAGE及Western blotting的结果表明，ΔnifE Av1具有与野生型棕色固氮菌钼铁蛋白(OP Av1)相同的亚基种类和组成（α2β2）。质子还原活性测定表明，在与Av2进行活性互补时ΔnifE Av1不具有明显的质子还原活性，而与从OP Av1抽提出的FeMoco抽提液保温后便可与Av2实现活性互补。这表明，ΔnifE Av1是一种缺失FeMoco的钼铁蛋白。 　　将ΔnifE Av1用过量的邻菲啰啉(o-phenanthroline)厌氧处理并经Sephadex G-25柱层析分离后，便得到部分丢失Fe的ΔnifE Av1©。在同时存在Av2和MgATP发生系统的条件下，ΔnifE Av1©, 而不是处理前的ΔnifE Av1，可为由KMnO4或Na2CrO4、高柠檬酸铁、Na2S、Na2S2O4 和二硫苏糖醇组成的含Mn或含Cr重组液(RS-Mn或RS-Cr)显著激活，但在缺少MgATP或Av2的条件下，RS-Mn和RS-Cr则不能激活ΔnifE Av1©。这就表明，RS-Mn和RS-Cr对ΔnifE Av1©的激活都需要邻菲啰啉的预处理及Av2和MgATP的同时存在。从分别缺失nifZ和nifB点突变的固氮菌突变种DJ194和UW45中纯化得到的钼铁蛋白，ΔnifZ Av1和NifB- Av1，经邻菲啰啉厌氧处理并经Sephadex G-25柱层析分离后，也分别得到部分丢失Fe的ΔnifZ Av1©和NifB- Av1©。与ΔnifE Av1©一样，这两种蛋白在Av2和MgATP同时存在时也可被RS-Cr和含Mo重组液（RS-Mo）明显激活。 　　为获得可供X-射线衍射的ΔnifE Av1的大单晶，对组成蛋白质沉淀剂的各种化合物的种类和浓度、缓冲液的pH值、结晶方法及蛋白样品的批次、浓度等结晶条件进行了大量优化研究。首次获得了ΔnifE Av1的深棕色短斜四棱柱晶体，并对其蛋白组成进行了鉴定。 二、铬铁蛋白中残存的棕色固氮菌细菌铁蛋白的晶体生长及鉴定 　　从无钼、无氨而含铬的固氮培养基中生长的棕色固氮菌突变种UW3中纯化得到了部分纯的CrFe蛋白。在试图培养CrFe蛋白大晶体时发现，棕色晶体和砖红色晶体可同时或单独出现。SDS-和厌氧天然-PAGE皆表明，棕色晶体主要由与Av1类似大小的亚基（~60 kD）组成，而砖红色晶体则主要由~20 kD亚基组成。Western-blotting表明只有~60 kD亚基可与OP Av1的抗体发生反应，而~20 kD亚基则无这种反应。在部分纯的CrFe蛋白中，~20 kD的蛋白含量远低于~60 kD蛋白的含量，表明由这种小亚基组成的蛋白只是CrFe蛋白中的一种污染蛋白。用3,5-二氨基苯甲酸染色的天然电泳表明，形成砖红色和棕色晶体的蛋白是迁移率不同的两种含铁蛋白。质谱分析表明，该晶体蛋白为棕色固氮菌的细菌铁蛋白（AvBF）。分辨率为2.34 Å的X-射线衍射结果也表明，砖红色晶体属于H3空间群，晶胞参数为a = 124.965 Å, b= 124.965 Å 和 c = 287.406 Å。首次完成的结构解析也表明，这种砖红色晶体确为24聚体的AvBF。 关键词：棕色固氮菌突变种DJ35和UW3; ΔnifE Av1; 铬铁蛋白; 细菌铁蛋白; 纯化和特性; 体外激活组装; 晶体生长及组成鉴定

Construction and characterization of a live, attenuated esrB mutant of Edwardsiella tarda and its potential as a vaccine against the haemorrhagic septicaemia in turbot, Scophthamus maximus (L.)

The esrB gene of Edwardsiella tarda, which encodes a regulator protein of the type III secretion system, was mutated by the unmarked deletion method and reintroduced by allelic exchange into the chromosome of E. tarda LSE40 by means of the suicide vector pRE 112. The LSE40 esrB mutant was highly attenuated when inoculated intraperitoneally into turbot Scophthamus maximus L., showing a 50% lethal dose of 10(8.1) cfu/fish. The esrB mutants were not recoverable from the internal organs at 14 days post-inoculation. Vaccination with a single dose of 10(5)-10(7) cfu/fish of the esrB mutant elicited significant protection against the wildtype strain of E. tarda LSE40 (relative percentage survival > 50%). The protection correlated well with the antibody titres in the serum of vaccinated fish. (c) 2006 Elsevier Ltd. All rights reserved.

棕色固氮菌突变种(UW45、DJ54和DJ35)的缺失FeMoco钼铁蛋白的纯化、特性鉴定及结晶研究

一．棕色固氮菌突变种UW45、缺失nifH（DJ54）和缺失nifE(DJ35)突变种的钼铁蛋白的纯化、特性鉴定及结晶研究 棕色固氮菌突变种UW45的菌体破碎后，所得粗提物经两次DEAE 52柱层析后得到部分纯的nifB- MoFe蛋白和Fe蛋白。再经Sephacryl S-300和 DEAE柱的进一步纯化，便使nifB- MoFe蛋白基本达到SDS凝胶电泳纯。SDS-PAGE结果表明，nifB- MoFe蛋白具有与野生型棕色固氮菌（OP）MoFe蛋白相同的亚基种类和组成。此粗提物可为用NMF抽提的 OP MoFe蛋白的FeMoco激活，所得Fe蛋白具有与OP Fe蛋白相似的互补活性，可使OP MoFe的比活性达到2192 nmol C2H2/min/mg蛋白。FeMoco可使无互补活性的 nifB- MoFe蛋白与nifB- Fe蛋白组成具有可观放氢活性的固氮酶，使FeMoco显出的比活性接近文献报道的还原乙炔的最高值。对nifB- MoFe蛋白的结晶及晶体生长进行了的研究，初步探讨了结晶溶液各组分的种类和浓度、结晶方法和实验操作等与能否出现晶体及晶体的数目、大小、质量、形状和出晶时间等的相互关系。在结晶实验时，一次就得到了国内外尚未报道的该蛋白的短斜四棱柱的棕色晶体。目前所得的最大的晶体的二维边长都为0.1mm。初步结果表明，这种晶体可能就是nifB- MoFe蛋白的晶体。 从棕色固氮菌突变种DJ54中得到了ΔnifH MoFe蛋白;并参与了棕色固氮菌突变种DJ35的ΔnifE MoFe蛋白的分离纯化，所用方法与nifB- MoFe蛋白的分离纯化相似。对这两种突变种蛋白的特性和结晶进行了初步研究。在结晶实验时，也是一次就得到了国内外尚未报道的ΔnifH MoFe蛋白和ΔnifEMoFe蛋白的晶体。 二．新型固氮酶MnFe蛋白和CrFe蛋白的特性与结晶研究 在已有的工作基础上，分离纯化了几批MnFe蛋白和CrFe蛋白，并用部分纯的nifB- Fe蛋白进行活性互补，分别测定了MnFe蛋白和CrFe蛋白的底物还原活性。不断优化MnFe蛋白和CrFe蛋白晶体生长条件，获得了晶质良好的MnFe蛋白和CrFe蛋白的较大晶体。 在2001年的“神舟2号”飞船搭载实验中，MnFe蛋白的出晶率达到100%，所获得的晶体也比地面对照略厚些。继续进行MnFe蛋白和CrFe蛋白的空间计划的地面匹配实验，以满足对蛋白质样品的要求，以保证宇宙飞船“神舟3号”的蛋白质搭载实验获得更好的结果。

棕色固氮菌突变株DJ35 中钼铁蛋白和HBP59 蛋白的研究—纯化特性及晶体生长

我们从A. vinelandii突变株DJ35中纯化得到了ΔnifE Av1，并通过与OP Av1相比较对其特性进行了研究。虽然ΔnifE Av1以四聚体形式(α2β2)存在，但却表现出两种天然电泳行为。与OP Av1相比，ΔnifE Av1中的金属含量较低，每个蛋白分子仅含9.96个铁原子、0.36个钼原子。OP Av1和ΔnifE Av1的吸收光谱相似，均在280 nm附近出现蛋白吸收峰，在300-600 nm波长范围内光吸收普遍降低，并无特征峰出现。虽然ΔnifE Av1可见光区域CD谱的摩尔消光系数（Δε）总比OP Av1小，但在520nm区域附近摩尔消光系数减少的相对值明显大于在450nm附近摩尔消光系数减少的相对值。ΔnifE Av1的EPR信号明显与OP Av1不同，在g≈3.7处的EPR信号完全消失，在g≈4.3 和2.0处的EPR信号强度也分别降低了75%和50%以上。ΔnifE Av1不能与Fe蛋白组成活性单位，但被FeMoco激活后可与Fe蛋白组成活性单位。上述结果表明, ΔnifE Av1不含FeMoco，但具有与OP Av1相同的P-cluster。 我们在纯化ΔnifE Av1的过程中，发现一个类似OP Av1的β亚基的污染蛋白，经MALDI-TOF质谱鉴定这种蛋白是棕色固氮菌中一预测基因的产物。通过改进纯化方法, 我们首次得到80%电泳纯的蛋白，并将其命名为HBP59蛋白。HBP59为一单体蛋白，分子量约为59k Da。金属测定结果表明每个蛋白分子中含有0.42个铁原子。HBP59蛋白的可见光谱表现出典型的血红素蛋白光谱特征，还原态的HBP59蛋白在421nm处有最大吸收峰，同时在517nm、556nm处有两个伴随肩峰出现, A421/A280仅为0.146。HBP59蛋白氧化后，吸收峰发生蓝移，最大吸收峰从421nm移到413nm，517nm和556nm处的肩峰消失，A413/A280为0.168。HBP59蛋白的可见光区圆二色谱比较复杂，正峰出现在420nm, 406nm, 379nm 和364nm; 其摩尔消光系数分别为0.75, 0.94, 0.68 和 0.99;负峰出现在433 nm 和392nm，其摩尔消光系数分别为-1.13 和-0.78。血红素滴定实验结果说明每个HBP59蛋白分子结合了0.1个血红素，但每个蛋白分子具有最大结合1个血红素的能力。这低结合能力与这低比率的比率是非常一致的。该蛋白对温度相对敏感，高于40℃蛋白开始沉淀。上述结果说明HBP59是一个结合具有低自旋和不对称的血红素的蛋白，它在菌体内可能并未扮演贮藏血红素的角色，而是可能参与血红素的运输或附着。 此外，经过结晶条件的大量筛选后获得了ΔnifE Av1和ΔnifH Av1的优质小单晶,并对HBP59的晶体培养进行了初步探索。

Construction and analysis of a high-CO2-requiring mutant of the cyanobacterium Anabaena sp strain PCC7120

A mutant of Anabaena sp. strain PCC7120 requiring high CO2 was generated using Tn5 mutagenesis. This is the first data for a filamentous cyanobacterium. The mutant was capable of growing at 5% CO2, but incapable of growing at air levels of CO2. Southern hybridization analysis indicated that the Anabaena genome was inserted by the transposon at one site. The apparent photosynthetic affinity of the mutant to external dissolved inorganic carbon (DIC) was about 300 times lower that of the wild type (WT), and the medium alkalization rate as well as the carboxysomal carbonic anhydrase activity of the mutant was also lower than those of the WT. When the mutant was transferred from the culture medium bubbled with 5% CO2 to higher DIC (8.4% CO2) or 1% CO2, it showed similar responses to the WT. However, aberrant carboxysomes were found in the mutant cells through ultrastructural analysis, indicating it was most probably the wrong organization of the carboxysomes that eventually led to the inefficient operation of carboxysomal carbonic anhydrase and the subsequent defectiveness of the mutant in utilizing DIC.

Selection and ultrastructural observation of a high-CO2-requiring mutant of cyanobacterium Synechococcus sp PCC7942

A high-CO2-requiring mutant of Synechococcus sp. PCC7942 las been isolated after chemical mutagenesis of ethyl methane sulphonate (EMS). It was able to grow at 4% CO2, but not under ambient CO2. The initial screening of the mutant showed that the genetic reversion rate was about 10(-7) and death occurred 2 -3 days after being transferred from 4% CO2 to the ambient air. Its photosynthetic dependence on external dissolved inorganic carbon was higher than that of the wild type cells, but its carbonic anhydrase activity was comparatively low. In the ultrastructural level, various types of aberrant carboxysomes appeared in the mutant cells: rod-shaped carboxysomes, irregular carboxysomes and the "empty-inclusion carboxysomes" with increasing number of glycogen granules surrounding the thylakoids. All these alterations indicated that the mutant was defective in utilizing the external CO2. The induction of carboxysomes by lower levels of CO2 and the biogenesis of carboxysomes are herein discussed.

棕色固氮菌变异菌株DJ54钼铁蛋白的分离纯化及其与FeMoCo模型化合物重组特性的研究

棕色固氮菌不固氮变异菌株DJ54是nifH缺失变突变株，不合成铁蛋和FeMoCo。DJ54钼铁蛋白与FeMoCo重组比活高于UW45钼铁蛋白。四个与UW45钼铁蛋白重组均无生物活性的FeMoCo的模型化合物与DJ45钼铁蛋白重组后有三个具有不同程度的生物活性。由四个模型化合物的结构、重组活性及重组蛋白的CD.MCO谱可知DJ54钼铁蛋白活性中心结合部位可能具有一定的“柔性”，FeMoCo模型化合物活性与两金属簇的配比，Mo原子配位体的类型，Mo原子配位体间的协同效应及其在蛋白质中所处环境和蛋白质的构象有关。