高效石油烃降解菌的分离鉴定及降解特性

为获得更为丰富的石油降解微生物资源,从沈抚污灌区石油污染土壤和实验室高浓度柴油胁迫土壤中筛选出了4株高效石油烃降解菌SF-422、SF-428、SF-433和SYS-1.这4株菌总石油烃(Total petroleum hydrocarbon/TPH)生物降解率为67.4%~73.6%.经过16项生理生化特性实验和16S rDNA序列分析鉴定,SF-433,SF-428,SF-422和SYS-1分别为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus),木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans),施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)和洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia).纯烃降解定性实验表明所筛选出的4株高效降解菌均能够利用正十六烷、苯、菲和环己烷为唯一碳源生长,其中菌株SF-428和SYS-1显示了对芳烃及环烷烃较强的利用能力.

长期重金属污染胁迫下农田土壤微生物特征研究

本论文以沈阳张士污灌区土壤为例，首次采用传统微生物生态学与现代微生物分子生态学相结合的研究方法系统地研究了污灌区长期重金属污染胁迫下原位农田土壤微生物特征。结果表明，虽然已经停止污灌十多年，张士灌区土壤耕作层（0～30 cm）仍然存在普遍的Cd污染，灌区土壤Cd含量高达1.75～3.89 mg kg-1。部分区域土壤Cd呈现向下迁移的趋势,且同时伴随有Cu、Zn复合污染。灌区土壤Cd含量较高时清水灌溉能降低土壤表层Cd含量，灌区土壤Cd含量下降到一定程度（约2 mg kg-1）后，清水灌溉对消除土壤表层Cd污染的作用消失。重金属元素中Cd对土壤微生物的影响最突出，在三个不同季节中土壤Cd与土壤微生物生物量（MBC）和微生物商（qM）呈显著负相关，与土壤微生物代谢商（qCO2）呈显著正相关。所检测的微生物指标中qM和qCO2与多种重金属元素呈显著相关性，可作为评价一定程度重金属污染的微生物指标。土壤营养元素（除P外）与微生物特征呈显著正相关性，土壤营养元素对微生物的刺激作用有可能在某种程度上掩盖了重金属对土壤微生物的负面影响。 用16S rDNA-PCR-DGGE方法，研究了不同浓度Cd胁迫下土壤Cd抗性细菌群落结构的动态变化，结果表明在Cd的胁迫下Cd抗性细菌多样性显著增加，不同土壤样品中Cd抗性细菌群落结构向相似的方向偏移，群落结构最终将可能趋向一致。Cd胁迫使敏感菌Pontibacter消失，而伯克氏菌（Burkholderia）、罗尔斯通氏菌（Ralstonia）、芽孢杆菌（Bacillus）和节杆菌（Arthrobacter）则富集成为优势菌。 从张士灌区Cd污染土壤中分离出32株Cd抗性细菌，研究了Cd抗性细菌和Cd抗性基因cadA的分布特征。这32株Cd抗性细菌分别归属于拟杆菌门(Bacteroidetes)（37.5%）、变形菌门(Proteobacteria) （37.5%）、放线菌门(Actinobacteria)（9.4%） 和厚壁菌门(Firmicutes)（15.6%）。在液体LB培养基中对Cd的抗性浓度都大于2 mmol L-1，对Zn抗性浓度介于5～13 mmol L-1。首次从Cetobacillus属的Cd抗性菌株S1基因组DNA中扩增出cadA基因的部分片断。在芽孢杆菌属(Bacillus)的4株菌N7，N9，N10和N11的基因组DNA中扩增出cadA基因的部分片断。序列分析结果表明这5株菌的cadA基因序列相似性为99％～93％，它们与坚强芽孢杆菌（Bacillus firmus） cadA 基因序列(M90750）相似性为94％～92％。系统发育分析结果表明这5株菌的cadA都与Bacillus firmus cadA 基因有着较近的亲缘关系。不同属的Cd抗性细菌间cadA基因的高度相似性揭示了cadA基因能在不同种属间转移的特性。

海洋聚磷菌Halomonas YSR-3的除磷特性研究

本论文报道从海洋中分离到的一株聚磷菌的分离、鉴定、在系统发育中的地位、除磷特性、菌体内多磷酸盐颗粒的研究、D-海因酶和核苷二磷酸激酶基因的克隆及序列分析，为海水系统的生物除磷提供部分基础资料。 从黄海海域分离到聚磷菌Halomonas sp. YSR-3，菌体呈杆状，大小为3.5 μm×1 μm，革兰氏阴性，好氧生长，能运动。透射电镜观察发现，菌体内有致密颗粒。经DAPI染色确定该致密颗粒是多磷酸盐，亦可称为异染粒、迂回体。16S rDNA鉴定结果表明，YSR-3与Halomonas属中的marine bacterium B5-7有较高的同源性，相似值99%。YSR-3的生理生化特性：对氯霉素和卡那霉素敏感；淀粉水解呈阳性；反硝化和几丁质降解呈阴性；能将葡萄糖作为唯一碳源和能源。 对YSR-3的培养条件进行优化。以海水2216培养基、24 ℃、180 rpm、pH 6.5的条件培养，更利于菌体生长和菌体内多磷酸盐的形成。 对YSR-3的除磷特性进行研究。无磷培养时，菌体不能生长；用磷酸钾盐作为磷源时，菌体生长较好，形成多磷酸盐的菌体比例较高；较适合YSR-3菌体生长和多磷酸盐形成的磷源是KH2PO4，较适磷浓度为1.5 mmol/L。pH的变化影响菌株的生长、多磷酸盐形成和除磷效果。pH值为5时，菌体的数量几乎不增加，体内多磷酸盐和培养基中磷含量变化不大；pH值为6、7和8时，菌体生长良好，95%以上的菌体内形成多磷酸盐，培养基中磷含量明显下降。YSR-3在不同培养基中除磷量和除磷率不同。在高磷培养基中除磷量为0.7 mmol/L(磷含量由1.84 mmol/L降到1.14 mmol/L)，除磷率为37.5%；在低磷培养基中除磷量为0.02 mmol/L(磷含量由0.028 mmol/L降到0.008 mmol/L)，除磷率为72.2%。 以海洋聚磷菌Halomonas sp. YSR-3的总DNA为模板，用PCR法扩增D-海因酶基因和核苷二磷酸激酶基因，将扩增片段克隆到pGM-T载体，转化E.coli TOP10菌株，经蓝白斑筛选、菌落PCR得到阳性克隆，测序后对序列进行Blast比对分析。得到的D-海因酶基因序列长度为1510 bp，与Pseudomonas entomophila L48的海因酶基因序列的相似性为77%。翻译后的序列与Pseudomonas fluorescens Pf-5，Marinomonas sp. MED121，Burkholderia vietnamiensis G4的海因酶蛋白序列相似性分别为75%，73%，70%。得到的核苷二磷酸激酶基因序列长度为420bp，翻译后的序列与Loktanella vestfoldensis SKA53，Jannaschia sp. CCS1，Roseobacter sp. CCS2的核苷二磷酸激酶蛋白序列相似性分别为89%，86%，85%。 聚磷菌能将外界环境中的磷吸收到体内，并以多磷酸盐的形式储存。多磷酸盐对于细胞的生存和生长有很重要的作用，但目前对于多磷酸盐的形成过程以及过程调控还不是很清楚。在今后可以通过构建高效表达的重组菌，提高与除磷相关的酶的纯度及活性。同时可以将相关酶的基因进行突变，对基因表达的调控以及酶的代谢以及功能结构等多方面进行基础研究，使聚磷菌在生物除磷中得到广泛应用。