高放氧活性的PSII颗粒及胆酸抽提对其活性的影响

用Triton X--100增溶菠菜叶绿体，分离到高放氧活性的PSII颗粒。对增溶过程中的缓冲液pH Triton与叶绿素比例、Na~+ 浓度等因素进行分析，结果表明各因素相互间作用不大;pH的最佳范围为6.7～7.1。制备的PS-II颗粒放氧活性达210μmoles/mgchl.hr、DCIP→MV的光还原活性约为54μmoles O_2/mgchl.hr. P700与叶绿素比例为1/1900。放氧活性相当稳定，在0℃水浴保存的活性半衰期为80小时左右。该PSII颗粒的多肽分子量主要分布在68、56、46、34、28.5、25、20和17KD区域，其中25KD多肽占总蛋白质含量的40%经上。上述PSII颗粒经胆酸钠或Tris处理后，放氧活性和DPC→DCIP的希尔反应活性都有不同程度的下降，同时有一些蛋白质被抽提。胆酸钠抽提到的组分是65、58和15KD多肽;Tris则对34KD多肽的抽提作用最为显著。本文初步讨论了这些多肽与PSII氧化侧的关系。文中缩写：Tris-三羟甲基氨基甲烷;EDTA-乙二胺四乙酸;Tricine-一三（羟甲基）甲基甘氨酸;HEPES--N-2-羟乙基呱嗪-N-2-乙磺酸;DTT-二硫苏糖醇，DMBQ：2，5-二甲基对苯醌;DCIP-一二氯酚靛酚;ASC-抗环血酸;DPC-NN二苯氨基脲;MV-甲基紫精;SDS-十二烷基磺酸钠;Chl-叶绿素;LHCP-捕光色素蛋白复合体;PS-光系统;RuBP-二磷酸核酮糖;CF-叶绿体偶联因子;DCMU-二氯苯基二甲脲;Cyt-细胞色素。

光系统II反应中心复合物组成性质与光仰制分子机理研究

由于光系统Ⅱ反应中心Dl/D2/Cyt b559色素蛋白复合物(PSII-RC)的红 区吸收光谱严重重叠，给其组成特性研究及光抑制分子机理研究造成 了困难，因此我们运用多种光谱分析技术配合计算机数据处理技术对 PSII-RC复合物的组成特性进行了研究，并用自己建立的方法对PSII-RC 的色素和多肽的化学计量进行了进一步确定，另外还重点研究了单线 态氧在PSII-RC光破坏中的作用，据此提出新的PSD[-RC光抑制分子机 理。主要结果如下： 1．用反相HPLC外标法测定我们制备的色谱纯PSR-RC样品的色素化 学计量结果为Chl:Pheo:Car= 6:2:2。我们发现，当PSII-RC中存在微量CP47 时，Chl: Pheo的比例与CP47的含量呈正相关关系，说明较高的Chl比例 可能表示样品中有CP47污染。结果还表明PSII-RC中Car: Pheo的比例也与 CP47含量有关，说明CP47可影响Car在PSII-RC上的结合，这暗示CP47可 能结合Car，或者CP47对PSII-RC上Car的结合位点有影响，这一推测对阐 明CP47的功能有一定启发作用。 2．建立了一种估算PSII-RC多肽化学计量的理论计算方法，即利用计 算机统计PSII-RC中各多肽组分的不同氨基酸残基数量，以确定不同多 肽化学计量时的理论氨基酸残基组成，并与PSlI-RC的实测氨基酸残基 组成进行比较，得到所用PSII-RC样品的多肽化学计量值为D1+D2:Cyt b559-o+邮：I=2:1:1. 3．对PSII-RC的红区吸收光谱进行了高斯解析，发现680 nm附近含有 峰高和半高宽明显不同的两个高斯组分，它们对光抑制处理的响应具 有明显差别，分别表现了P680和Pheo的特征。由此可知，在680nm处除了 有P680的信号外，PSII-RC中的Pheo在这个区域也有跃迁组分。这个结果 表明光抑制进程中PSII-RC红区吸收光谱信号的下降除了P680的破坏 外，还与Pheo的破坏有关。 4．用Ste)anov关系式分析了PSII-RC色素激发态分布的平衡状态，发现 经过暗适应的PSII-RC的激发态可达到充分的平衡，光抑制处理可导致 PSIL-RC激发态平衡受到破坏。 5．用荧光发射光谱观察到PSII-RC在光抑制进程中有弱光破坏和强光 破坏两个破坏过程，前者是与色素间能量传递的色素结合状态与 取向的破坏，后者与色素本身化学结构的破坏有关。通过研究不同激发波长下的发射光谱发现Car的弱光破坏过程比Chl快，暗示Car可能的保护作用，而Pheo的破坏程度比Chl小。从发射光谱组分的光破坏时间 进程推断强光破坏过程导致的色素破坏是多步反应，验证我们小组原 先报导的PSII-RC的多步反应特性。 6．首次将磁圆二色光谱( MCD)技术应用于PSII-RC研究，发现MCD明显表现出比吸收光谱要丰富得多的光谱精细结构，同时还具有较高的灵敏度和分辨率，不经过任何解析就可直接观察到680 nm组分及其它色素组分的变化，而且PSⅡ-RC中的Car没有明显MCD信号，使PSII-RC谱 图简化，便于进一步分析。用MCD技术还观察到光抑制初期Chl从PSII- RC复合物上脱离及Pheo的光破坏现象。 7．分别用HPLC法、吸收光谱高斯解析法、荧光发射光谱分析法和MCD法共四种方法证明了PSII-RC中Pheo的光破坏，充分证实我们小组关于Pheo光破坏的报导，同时还证明Pheo的光破坏是单线态氧作用的结果。 8．给出了单线态氧参与PSII-RC色素和蛋白光破坏的直接实验证 据，即发现光抑制过程中色素和蛋白的破坏受到单线态氧的特异性清除剂的保护，用化学方法在暗中产生的单线态氧同样造成与光抑制相 似的PSII-RC各组分的损伤，由此说明单线态氧是PSII-RC光抑制过程中 的直接破坏因子。 9．提出了PSII-RC中Hiis残基光破坏的一种新的分子机理。用组氨酸残基的特异性化学修饰剂证实以前我们实验室发现的PSI[-RC组氨酸残基的光破坏，根据比较蛋白变性前后的测定结果，初步证明PSIl-RC中 受光破坏的His残基位于P680附近。我们还观察到光抑制处理后，PSII- RC表现与组氨酸残基被修饰后的样品相似的紫外吸收特征，由此提出 PSII-RC中His残基光破坏的一种分子机理，即His残基的眯唑环上的两个氮原子与其它多肽上的游离氨基在单线态氧的作用下发生反应形成酰 胺键而导致PsII-RC多肽间的共价交联，推测PSII-RC中His残基的光破坏与其蛋白的光致交联和降解有直接的因果联系。

苏铁叶绿体的超微结构和功能及对CO2浓度倍增的响应

本研究首次揭示了七种苏铁类植物叶绿体的超微结构。即苏铁科(Cycadaceae)的攀枝花苏铁(C. panzhihuaensis).苏铁(C. revoluta)、叉叶苏铁(C.micholitzii)、 刺叶苏铁(C.rumphii和多歧苏铁(C.multipinnata)，蕨铁科(Stangeriaceae)的蕨铁(Stangeria eriopus)和泽米科(Zamiaceae)的米德尔堡大苏铁(Encephalortos middelburgensis).根据它们叶绿体内膜结构的不同将其大体分为两种类型：1、阴生型叶绿体：多歧苏铁和刺叶苏铁为此类型，它们的叶绿体类囊体垛叠程度高，基粒垛较宽，单个基粒中类囊体的数量很多，有的甚至上百;2、阳生型叶绿体：攀枝花苏铁、米德尔堡大苏铁、苏铁、蕨铁和刺叶苏铁以及外类群的凤尾蕨(Pteris vittata)的叶绿体均有阳生型叶绿体的特征：类囊体膜垛叠程度低，基粒较小。根据它们叶绿体的结构特征，又将其分为两组： ( 1)攀枝花苏铁，米德尔堡大苏铁和叉叶苏铁叶绿体中均有类囊体膜膨大的现象： (2)苏铁和蕨铁在苏铁类中是比较原始的种类，它们的叶绿体与在系统进化上较苏铁类低等的凤尾蕨的叶绿体中都有几个基粒聚集成簇的现象，说明苏铁类在进化的同时一些较原始的性状仍保留了下来。这些苏铁都在温室相同的条件下生长了两年多，但它们的叶绿体结构仍然能够反应原产地生境特点，说明在长期进化中，叶绿体对环境的适应方式已在基因水平上稳定下来，苏铁类植物不同叶绿体结构的形成有其遗传基础。 多歧苏铁，攀枝花苏铁，叉叶苏铁的叶绿体膜垛叠程度依次降低，与此相应，它们的chla/b和F730/F684依次升高，反应了结构与功能的一致性。 选用具有阳生型叶绿体的攀枝花苏铁和有阴生型叶绿体的多歧苏铁用不同的C02浓度（350 umol mol-l和700umol mol-l）处理后观察其叶绿体结构的变化，结果发现C02浓度倍增对它们的叶绿体影响甚微，而作为对照的无论是C3植物小麦(Triticum italica)还是C4植物谷子(Setaria italica)在C02倍增的条件下叶绿体内均有大量淀粉粒积累，并有膜结构改变。这说明苏铁的叶绿体结构有保守性，这有可能是苏铁类能历经亿万年的沧桑而生存下来的结构基础之一。

高温胁迫诱导光系统Ⅱ及其异质性的变化

近年来有证据证明，光系统II(PS II)反应中心在结构与功能上存在着异质性，它与光舍原初过程、激发能的分配和调节、胁迫因子导致的光合单位的损伤与修复等密切相关。本论文主要研究了高温胁迫诱导PS II及其异质性的变化，以及人工电子受体与PS II还原侧异质性电子传递的关系．根据研究需要，建立了精确测定无活性PS II中心相时含量的软件和方法，圆满完成了本研究任务。此外，也参加了新的非调制式动力学荧光计的研制及其软件的编写． 以下是本论文的主要结果： 1．用N80-BASIC语言结合汇编语言重新编写了本室快速（ms级）叶绿素动力学荧光计的测控程序，使快速荧光上升曲线的采样速度提高了一个数量级（达到100μS/点），可对Fo、Fi等关键荧光参数进行精确测定，为无活性PS II中心相对含量的准确测定奠定了基础．新研制的荧光计的软件用C语言编写，可在IBM PC兼容机上运行，采样速度最快可达25μs/点，对Fo和Fi等参数的测定更加可靠和精确．新荧光计从软、硬件两方面进行了彻底地更新，具有高信噪比、高响应、高精度、低功耗等优点，其性能己达到国际同类产品的先进水平． 2．高温胁迫诱导小麦类囊体膜吸收光谱的变化，结果显示40℃-50℃20分钟以内的高温胁迫导致681nm的吸收峰下降，同时引起663nm的吸收峰增加，表明高温胁迫引起部分叶绿素蛋白复合体的破坏和游离的叶绿素分子的增多．在更严重的高温胁迫下（55℃5分钟以上），体内游离的叶绿素分子(△A663)本身也遭到进一步的降解． 3．小麦类囊体膜低温( 77K)荧光光谱的分析。结果证实温和的高温胁迫(40℃20分钟以内)可导致激发能更多地从PS II向光系统IcPsi)分配，而更严重的高温胁迫（45℃- 55℃20分钟以内）对PS II和PS I的叶绿素蛋白复合体（F684和F736）均有破坏作用． 4．高温胁迫诱导小麦叶片荧光诱导动力学、荧光猝灭及其荧光参数的变化的研究．结果表明，高温胁迫首先导致有效量子产量(E．Y．)的下降，胁迫作用进一步加强导致最适量子产量(0．Y．)下降，而对光化学猝灭qP的影响较晚．这说明和PS II电子受体侧的电子传递和与二氧化碳固定有关的酶系统对高温胁迫极为敏感．其次，PS II放氧系统的损伤也早于PS II原初反应中心的失活．同时，在自然界条件下，存在着高温和高光强对植物的加强协同的光抑制和破坏作用． 5．在研究高温胁迫诱导荧光动力学及其参数变化的基础上，提出测定和计算高温胁迫的植物样品中无活性PS II中心相对含量的合理方法．认为在高温胁迫导致可变荧光( Fv)猝灭的情况下，应以Fvi(Fvi=Fi-Fo)对室温对照的可变荧光(FVCK)的比值作为计算无活性PS II中心相对含量的指标(Fvi/FVCK)．我们在弱激发光下测得正常的小麦和菠菜的无活性PS II中心的相对含量分别为0.155±0.011和0.094士0.010． 6．高温胁迫诱导有活性和无活性PS II中心异质性的相互转化的研究。结果发现50℃以下小于10分钟的处理，对PS II有活性和无活性中心的比值无明显影响：而经过50℃和55℃高温处理5-10分钟，有活性PS II中心才明显向无活性中心转化并发现这一转化过程发生在Fo己明显增加和Fv明显猝灭之后，也就是说它迟于高温胁迫对PS II天线色素蛋白复合体( LHCII)与PS II反应中心结合的破坏以及对放氧侧的损伤． 7．高温胁迫后的室温恢复期中有活性和无活性PS II中心相互转化的研究．发现在高温胁迫不太严重时（如50℃1分钟），无活性PS II中心的含量降至对照的70%，在随后室温60分钟恢复过程中继续降为50%。而Psn氧化侧的活性在此过程中可以得到部分恢复。高温胁迫进一步加强（如55℃5分钟和55℃10分钟）后，无活性PS II中心数目在随后的60分钟室温恢复期中，从恢复开始时为对照的130%和150%继续增加到240%和290%，且有加速转化的趋势。这说明高温胁迫诱导PS II还原侧异质性中心的转化除包含一个快速、直接的机制外，还启动了某种间接转化的机制． 8．对DMQ和DCBQ两种人工电子受体对有活性和无活性PS II中心的作用提出了不同见解。Cao和Govindjee(1990)认为DMQ(>20μmoI.L-1)只接受有活性PS II中心的电子，而DCBQ（>15, μmoLL-1）可完全接受有活性和无活性两种PS II中心的电子。但Lavergne等(1993)认为DCBQ不能接受无活性Psn中心的电子．我们用Stern-Volmer猝灭公式对我们的实验结果进行了分析，结果表明DMQ在较高浓度下（如120μmoI.L-1）才可完全接受有活性PS II中心的电子．但DCBQ的浓度在比Cao等几乎高出一个数量级( 120μmoI.L-1)的情况下，也只接受部分无活性PS II中心的电子( 40%)。另外我们发现，DMQ和DCBQ对Fm的猝灭不是随猝灭剂浓度的增加呈线性关系，而是一条近似饱和曲线，说明它至少包括两种以上不同的猝灭机制． 9．Mg2+诱导PS II异质性(Cα/Cβ)的研究。我们小组发现Mg2+诱导的chl a荧光增强动力学曲线包含Cα和Cβ两个指数成分，说明Mg2+在抑制激发能满溢，调节激发能向有利于PS I1分配的过程中存在异质性。其中Cβ比Cα具有更长的迁移寿命、更低的活化能和Mg2+半饱和浓度．这些说明Cβ比Cα更有可能在体内生理条件下发生迁移，从而在两个光系统之间起调节激发能分配的作用． 10.提出了高温胁迫诱导PS II异质性中心相互转换的可能模型．高温胁迫导致PS II异质性的转化包括几个步骤：有活性的α型PS II专荧光猝灭态的PS II专有活性的β型PS II专无活性的β型PS II专破坏了的PSⅡ．前两种转化一般具有可逆性．当高温胁迫进一步加强后，转化失去可逆性，在胁迫去除后，有活性PS II中心可继续向无活性中心转化，后者还有可能进一步受到破坏。

磷脂对光系统II光合放氧的影响及其作用机理的研究

以类囊体膜中唯一的阴离子型磷脂一磷脂酰甘油(PG)为研究对象，应用放氧测定和富立叶红外光谱等实验方法和技术手段，对PG与光系统II (PSII)之间的相互作用进行了研究。 研究表明，PG对PSII的放氧活性产生显著影响，具有明显的浓度效应。在低浓度(2～22 mg PG／mg Chl)时对PSII的放氧活性有明显的促进作用，而在高浓度(24～40 mg PG／mg Chl)下则表现出显著的抑制作用。 PG对PSII放氧活性的影响与其引起蛋白结构的改变密切相关。结果显示，PG的作用导致PSII颗粒中蛋白质二级结构的改变，主要表现为α-螺旋、β-折叠的增加和无规卷曲的减少。 不仅如此，红外光谱的分析还表明，PG还使蛋白酪氨酸残基中的酚基构象及其周围的微极性发生改变，即在红外光谱的1620—1500 cm-1，之间芳香环骨架的伸缩振动带向高频方向变化，其吸收强度也相应增加;在3500～3100 cm. -1间出现新的氢键吸收峰。 PG除能促进PSII的放氧活性以外，还对PSII表现出新的作用，即PG可以使PSII颗粒因缺钙而受抑制的放氧活性得到恢复;外加Ca2+可使PG表现出对缺钙PSII颗粒(dc。PSII)放氧活性的更大促进作用，且随Ca2+浓度的增加，促进作用也越显著。 PG的作用也使dc。PSII蛋白的结构发生了改变，导致蛋白二级结构中a-螺旋、p_折叠结构的增加和转角、无规卷曲成分的减少，即可使PSII颗粒因缺钙而改变的蛋白结构基本得到恢复。PG还能与Ca2+形成离子对似的配合物，而这种配合物的形成可以优化缺钙PSII颗粒的功能如放氧活性等。

细胞色素b6f蛋白复合体的结构与功能色素的结构与功能及膜脂的作用

采用改进的的分离纯化方法从菠菜叶绿体中获得了纯度和活性、Chl a 和β-carotene含量较高的Cyt b6f制剂。利用吸收光谱、CD光谱和共振喇曼光谱对Cyt b6f蛋白复合体中的β-carotene分子的构型及构象进行了研究。结果表明，无论是结合在蛋白复合体上还是处于自由状态，该β-carotene都是一种特殊的9-顺式构型的分子;在蛋白复合体中，该9-顺式β-carotene存在于一种不对称的蛋白环境中，但从喇曼光谱中没有观察到构象扭曲现象。SDS处理前、后的荧光激发光谱和光破坏的研究表明Cyt b6f中的β-carotene不能有效地向Chl a传递光能，但对Chl a具有明显的光保护功能，因而说明β-carotene分子是Cyt b6f的天然结构和功能成分。根据这些实验结果和文献的有关报道，提出了β-carotene在Cyt b6f中可能的光保护机理模型，，即在Cyt b6f中，Chl a不是单线态氧的主要发生源，单线态氧主要由Rieske[Fe-s]中心产生，β-carotene不具有直接淬灭Chl a三线态的功能，其主要功能是作为抗氧化剂抵御Rieske[Fe-s]中心产生的单线态氧对Chl a的攻击，从而保护Cyt b6f中Chl a免受强光照射的破坏。 利用非变性凝胶电泳和硫酸铵沉淀对Chl a在Cyt b6f中的结合和解离现象进行了研究，观察到Chl a的解离与Rieske蛋白的解离及Cyt b6f复合体单体化的关系比较密切，膜脂能够有效地抵制这三个过程的发生，推测膜脂的作用位置位点可能位于Cyt b6f二聚体中两个单体之间的交界处。色素重组实验表明缺失Rieske[Fe-S]蛋白的Cyt b6f单体不能有效的和Chl a重组。 利用从菠菜叶绿体中分离纯化出的缺脂Cyt b6f与从菠菜类囊体分离纯化的膜脂进行体外重组，检测了不同膜脂对Cyt b6f催化电子传递活性的影响。结果表明：被检测的五种膜脂单半乳糖基甘油二酯（MGDG）、双半乳糖基甘油二酯 （DGDG），磷脂酰胆碱（PC），磷脂酰甘油（PG）和硫代异鼠李糖基甘油二酯（SQDG）对Cyt b6f催化电子传递的活性均有明显的促进作用，但促进的程度各不相同。不带电荷的MGDG和DGDG及分子整体呈电中性的PC对促进Cyt b6f催化电子传递的活性非常用效，最适条件下可分别使其活性提高89%、75%和77%;而带负电荷的PG和SQDG的活性促进作用则相对较弱，最适条件下仅可使其活性分别提高43%和26%。由此可见，膜脂对Cyt b6f活性的促进作用可能与这些膜脂分子的带电性质密切相关。

小麦光系统I的分离纯化及其光合特性的研究

从不同基因型的小麦京411和小偃54中分离纯化了PSI颗粒并研究了PSI颗粒的一些光合特性： 1. 测定了两种基因型小麦PSI颗粒的室温吸收光谱、低温荧光光谱，并进行了SDS-PAGE多肽分析。吸收光谱显示了红区680nm和蓝区439nm的两个最大吸收峰，低温荧光光谱显示了PSI特征的位于735nm左右的发射峰，同时SDS-PAGE也显示我们的制备物包括PsaA、PsaB、LHCI以及一些其它小分子量蛋白亚基。这些都表明我们从不同基因型小麦中获得了比较理想的PSI颗粒制备物。 2. 测定了京411类囊体膜和PSI颗粒的脂类组成和脂肪酸成分，发现PSI颗粒中也存在着类囊体膜中的五种膜脂，即：MGDG、DGDG、PG、SQDG、PC，但PSI颗粒的MGDG含量比类囊体膜高，而DGDG含量较类囊体低。PSI颗粒和类囊体膜的脂肪酸组成也有差异。 3. 运用光谱学手段，研究两种基因型小麦PSI颗粒光破坏过程的异同。发现在经过强光破坏后，两种小麦PSI颗粒都发生叶绿素漂白现象，在各种状态叶绿素中，683nm状态的Chl a对强光最为敏感，受到光破坏的程度最大，而649nm Chl b和667nm Chl a分子变化较小。结合吸收光谱和低温荧光光谱我们提出了PSI中可能存在的能量传递途径。比较两种小麦PSI颗粒光破坏在低温荧光光谱上的不同，我们初步认为，小偃54可能通过将能量较多地分配给予长波长Chl而一定程度的避免过多能量向P700反应中心传递，从而起到对P700的保护作用。 4. 研究了不同表面活性剂SDS和Triton X-100对PSI颗粒色素结合状态和能量传递的影响。发现表面活性剂对色素状态和PSI中的能量传递都有很大的影响。并且Triton X-100的作用较SDS强烈。紫外荧光显示PSI蛋白结构也发生了显著变化。

光系统Ⅱ反应中心细胞色素b559结构和功能的研究

植物已经演化出多种保护其免受强光抑制和破坏的机制，从而使植物体在自然界能够应付复杂多变的光照环境。虽然人们早就确定Cyt b-559存在于PSII反应中心内，但目前对其性质与功能的认识还不充分。本工作的目的就是研究Cyt b-559天然分子特性，探讨其生理功能和存在的意义。取得了一些有新意的结果： 1、依据PSII反应中心分离纯化的原理，应用更有效的层析介质DEAE-Sephacel，我们设计了快速高效的从菠菜和水稻中分离纯化Cyt b-559的方法和流程，获得了高纯度的样品。它们在非变性胶电泳中具有相同的泳动性。蛋白组分的HPLC结果证明，纯化的Cyt b-559的确由两个亚基组成，α亚基和β亚基的分子量用我们设计的适合于分析小蛋白的Tricine—SDS—PAGE方法准确测定为9.4kDa和4.5kDa。 2、利用HPLC技术分析了纯化的Cyt b-559样品的色素组成，结果表明Cytb-559中含有Chl α而不含类胡萝卜素分子，这一结果通过吸收光谱和共振拉曼光谱的分析得到进一步地证明。通过等电聚焦方法分析了Cyt b-559的等电点，发现其亚基的等电点相差很大，全蛋白的等电点与...更多D1、D2蛋白的等电点也不相同，推测在体内生理pH条件下它们具有相反带电性而在PSII组装中发挥作用。 3、低温荧光光谱的检测结果表明，Cyt b-559的荧光发射峰位在563nm和666nm;首次证明Cyt b-559可以发出荧光和将电子传递给结合在其上的辅助叶绿素，但传递能力比较低故而导致其荧光特性与PSII反应中心的不相同。Cytb-559的紫外荧光光谱表明Trp残基位于其内部的疏水区域，证明Cyt b-559中的芳香族氨基酸可能在其功能的发挥中起一定作用。 4、通过MCD的分析，发现Cyt b-559中血红素的MCD信号在540—580nm和400—440nm波段，而且光谱形状和强度与PSII反应中心的相一致，说明PSII反应中心该范围内的MCD信号中有Cyt b-559的贡献。FTIR光谱的测定结果证明Cyt b-559血红素的配体是组氨酸，其二级结构中α-螺旋占了一半。此外，还比较了Cyt b-559和PSII反应中心的膜脂成分，发现两者有很大的相似性。不同植物来源的Cyt b-559在许多性质上都表现出高度一致，从一个侧面证明Cyt b-559在进化中的保守性。 5、PSll反应中心发生光破坏时，原初电子供体P680己受到严重破坏。我们发现，在光抑制的最初一段时间内，Cyt b-559吸收峰值发生变化：在受体侧光抑制的条件下，其吸收峰值先略有增加而后才下降，而在供体侧光抑制条件下则相反，说明 Cyt b-559对光抑制的发生非常敏感，可能在光抑制早期保护PSll反应中心。 6、纯化的Cyt b-559的组氨酸含量在照光前后没有显著的变化，说明 PSll反应中心内被破坏的组氨酸不属于Cyt b-559。PSll反应中心所含的组氨酸中有些可被DEPC修饰，但我们的实验结果表明DEPC不能修饰Cyt b-559的组氨酸。这可能有利于Cyt b-559保护功能的发挥。 7、我们观察到，在两种光抑制条件下，LP Cyt b-559光还原和 HP Cyt b-559光氧化具有对pH值的依赖性，说明Cyt b-559在光保护中的作用不仅与其高低电势态有关，而且与其质子化程度有联系。CCCP促进HP Cyt -559释放质子，从而维持循环电子传递。DCBQ和 DCMU在很低浓度时都抑制 Cyt b-559光还原，前者不影响Cyt b-559光氧化而后者在CCCP存在时也会抑制Cyt b-559光氧化。 8、Cyt b-559有定位PSll反应中心其它蛋白的锚蛋白的作用。黄化苗转绿实验证明在 HP Cyt b-559的含量增加超过 45％以后放氧活性开始逐渐增加。Cytb－559从低电势态到高电势态的转变是放氧复合物组装到PSll反应中心的关键步骤之一。在植物正常生长时，Cyt b-559与 P680的其它电于供体发生竟争，起到安全阀门的作用。 9、在逆境条件下，Cyt b-559具有保护PSll反应中心免受强光破坏而起到“分于开关”的作用。我们的实验表明，在室温条件下存在通过Cyt b-559的环式电子流，存在从氧化态LP Cyt b-559到还原态HP Cyt b-559的一个循环，其中的氧化还原变化与质子化／去质子化反应相连。通过与其它血红素蛋白的比较，我们推测 Cyt b-559“分子开关”的关键是：光抑制情况下，铁原子与远端His之间的疏水空穴被氧自由基占据后使得铁进入叶琳中央孔中，迫使近端HIS向叶琳平面位移，从而引起 Cyt b-559构象改变，使电势态发生转变。

假根羽藻不同聚集态捕光色素蛋白复合物（LHC II）的纯化与功能分析

应用温和、非变性的液相色谱层析技术以及蔗糖密度梯度分级分离技术，从假根羽藻类囊体膜直接分离、纯化出5种不同聚集态的光系统II捕光色素蛋白复合物(LHC II)，即LHC II单体、同质三聚体、异质三聚体、寡聚体l和寡聚体2。这种分离、纯化LHC II的方法与传统的等电聚焦(IEF)电泳分离方法相比，具有蛋白质提取条件温和，纯化的蛋白质样品纯度高且数量大等优点，为进一步研究LHC II分子的晶体结构和功能创造了有利的条件。 SDS-PAGE电泳分析和MALDI-TOF质谱分析结果表明，纯化得到的LHC II单体和同质三聚体都具有一种分子量为24.3 kDa的脱辅基蛋白质，而异质三聚体和两种寡聚体除含有这个脱辅基蛋白外，还含有另一种分子量为23 kDa的脱辅基蛋白。 采用室温吸收光谱、低温荧光光谱及园二色(CD)光谱技术对LHC II单体、同质三聚体、异质三聚体、寡聚体l和寡聚体2内的叶绿素组成以及叶绿索之间的能量传递特性进行分析研究表明，在同一条组成LHC II的脱辅基蛋白多肽链上结合着Chl a二聚体，二聚体内的两个Chl a分子之间存在偶极子相互作用。在这5种LHC II亚复合物中均具有Chl a-Chl a相Chl biChl a→ Chl a能量传递途径，其中同质三聚体表现出最高的能量传递效率，而寡聚体的传能效率大大低于单体和三聚体，同时出现Chl a的淬灭现象。当LHC II脱辅基蛋白质高度聚集形成寡聚体时，其蛋白质上结合的Chlb大量减少，引起这两种寡聚体吸能和传能能力的急剧下降。 LHC II单体、同质三聚体、异质三聚体、寡聚体1和寡聚体2的二级结构数据表明，自由堆积的脱辅基蛋白的二级结构以8．折叠构象为主，当LHC II蛋白质有序聚集形成三聚体时，可能每条蛋白质多肽链上的叶绿素结合区域形成两个跨膜a-螺旋，对称排列在脂双层膜内，而非叶绿素结合区则形成一条跨膜a-螺旋。当LHC II蛋白质高度聚集形成寡聚体 时，LHC II蛋白质的二级结构似乎对其上结合着的叶绿素的影响不大，而LHC II寡聚体内蛋白质的高密度聚集引起的更高级的蛋白质相互之间的空间结构可能对叶绿素的影响起主要作用，特别是破坏Chlb结合位点。 依据上述的实验结果推测在类囊体膜内，LHC II可能通过其脱辅基蛋白聚集形式的转换，调控其光能吸收和激发能传递的过程和效率。

大田小麦旗叶衰老过程中的光合作用及其抗氧化代谢研究

小麦是我国的重要粮食作物，小麦籽粒产量的形成主要来自小麦旗叶的光合同化产物，但是，小麦籽粒的灌浆时期正好伴随着旗叶的衰老过程，因此，研究小麦旗叶在衰老期间的光合作用有着重要意义。同时，光合器官也是产生活性氧的重要部位，如何消除衰老叶片中的活性氧，保证衰老旗叶光合作用的进行也有着重要意义。本文对衰老旗叶在衰老过程中的光合作用和抗氧化代谢进行了较为全面的研究。结果如下： 1．在大田小麦衰老旗叶中叶绿素含量，光合速率和RuBPCase活性随着衰老的进程而逐渐降低。但是在衰老过程中光系统II最大光化学效率（Fv/Fm），实际光系统II量子效率，光化学焠灭以及开放的光系统II激发能的利用效率在衰老初期和中期几乎不变，而到衰老晚期急剧下降。非光化学焠灭在衰老初期和中期也是几乎没有明显变化，到衰老晚期迅速上升。光系统II捕光色素复合体在衰老叶片中的下降要慢于光系统II核心和光系统I的下降。这些结果说明衰老叶片中，光系统II在叶绿素含量和光合速率和RuBPCase活性降低的情况下依然保持着完整的功能，而实际光系统II量子效率的下降是由于光系统II反应中心的关闭和光能热耗散的提高引起的。 2．叶黄素循环库随着衰老进程逐渐增加，叶黄素循环的脱环氧化状态也是逐渐增加。由于叶黄素循环在光能热耗散中有着重要贡献，这表明在衰老叶片中光能热耗散的提高与叶黄素循环在衰老叶片中的提高有关。 3．在衰老过程中，小麦旗叶的MDA，抗坏血酸含量以及其与脱氢抗坏血酸比值逐渐增加，谷胱甘肽含量逐渐降低，这说明在衰老叶片中，主要是抗坏血酸作为活性氧清除剂。 4． 分别以不同单位表示抗氧化代谢中各种酶的活性，这些酶包括：脱氢抗坏血酸还原酶，单脱氢抗坏血酸还原酶，抗坏血酸过氧化酶，谷胱甘肽还原酶，过氧化氢酶和超氧化物岐化酶。结果表明：以每克鲜重为单位表示的酶活随着衰老逐渐降低，而以每毫克蛋白表示的酶活都随着衰老逐渐升高，表现趋势为衰老初期小幅度变化，衰老晚期大幅度变化。同时，测定结果表明小麦旗叶衰老过程中的蛋白含量降低。这些说明在衰老过程中抗氧化酶的降解速度可能慢于其他蛋白的降解速度，相对提高了消除活性氧的能力。 5．对大田小麦开花期，衰老中期，衰老晚期的旗叶光合作用日变化作了较为系统的研究。结果表明，在小麦旗叶衰老的三个时期，叶绿素含量和Chl a/b比值以及叶黄素循环库在一天中变化不明显。光合速率随着光强增大而提高，在中午表现出明显的光抑制。光系统II最大光化学效率，实际光系统II量子效率，光化学焠灭和开放的光系统II激发能的利用效率在中午强光下较明显的降低，非光化学焠灭在中午强光下升高。它们的变化幅度都是在开花期和衰老中期较小或者几乎没有变化，而在衰老晚期旗叶中变化幅度明显增大。叶黄素脱环氧化状态随一天中光强的增大而增大，且在衰老晚期叶片中变化幅度最大。这说明在强光条件下，衰老叶片中光系统II仍然维持着完整的功能，这种功能的维持可能与高光强下光系统II的关闭和叶黄素循环参与的光能热耗散的增加有关。 6．对开花期，衰老中期，衰老晚期的旗叶抗氧化物日变化的研究发现：抗坏血酸含量和ASC/DASC都是在衰老晚期中午强光条件下有较明显的升高，在早晨和傍晚弱光条件下其值较低。脱氢抗坏血酸含量和ASC+DASC含量在一天中未表现出明显的变化规律。GSH＋GSSG，GSH和GSH/GSSG有相似的变化规律，即在衰老的三个时期都表现出在一天的中午强光下的值比早晨和傍晚弱光条件下要高。GSSG在一天几乎不变。对开花期，衰老中期，衰老晚期旗叶的抗氧化酶日变化的研究发现：在开花期和衰老中期，DHAR活性一天中变化不大;在衰老晚期，其活性在中午强光条件下显著上升，而早晨和下午光强较弱的条件下，活性相对较低。ASPX, MDHAR, CAT和GR活性变化与DHAR类似。SOD活性在一天中变化不明显。结果表明，强光促进了抗氧化代谢中抗坏血酸的再生，特别在严重衰老叶片中与抗坏血酸再生有关的酶都在中午强光下有显著提高。严重衰老叶片中其他抗氧化酶在强光下，也表现出显著的提高，在衰老叶片中抗氧化系统提高了消除活性氧的能力，特别是在强光下，抗氧化系统有着重要的作用。

海洋小球藻Chlorella sp.甘油脂及脂肪酸、光合色素特征的研究

海洋微藻是海洋生态系统中最主要的初级生产者，也是海洋生物资源的重要来源。许多海洋微藻富含对人体具有重要的生理作用与保健功能的长链多不饱和脂肪酸，因此，筛选富含EPA、DHA等长链多不饱和脂肪酸的微藻和利用人工培养方法提高这些脂肪酸的产量是当前海洋生物学研究领域的热点之一。在本研究中，我们对被中科院海洋所定名为“Chlorella sp”（编号为1061）的一种海洋微藻的化学分类、甘油脂及其脂肪酸组成和外源葡萄糖和抗氧化剂（硫代硫酸钠）对这种微藻的脂肪酸含量的影响进行了研究，取得了以下主要结果。 海洋微藻是我固海水养殖中广泛使用的优良饵料藻。脂类物质是微藻最重要的营养指标之一，在本研究中，我们首先分析了被中科院海洋所定名为“Chlorellasp”的海洋微藻中的甘油脂及其脂肪酸种类和组成特点。结果表明，Chlorella sp.中的非极性脂主要为三脂酰甘油，极性甘油脂有10种。其中，一般培养条件下（温度23℃：光照，周期L/D14:10，强度60umolm-2-S-l）三脂酰甘油约占总脂的31 mol%，极性甘油脂约占总脂的69 rriol%。10种极性甘油脂是单半乳糖甘油二脂( monogalactosyldiacylglycerol． MGDG)、 双半乳糖甘油二脂( diagalactosyldiacylglycerol ， DGDG)、 硫代异鼠李糖甘油二脂( sulfoquinovosyldiacylglycerol，SQDG)、磷脂酰甘油(phosphatatidylglycerol，PG)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)、磷脂酰胆碱( phosphatidylcholine，PC)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)、磷脂酰丝氨醴(phosphatidylserine，Ps)、l，2-二酰基甘油-0-4，．（ⅣMⅣ-三甲基）高丝氨酸（diacylglyceryltrimethylhomoserine，DGTS）以及一种未能完全肯定，但可能是一中氯硫脂( chlorosulfolipid，CSL)。其中MGDG、DGDG、SQDG和PG是构成光合膜的主要成分，也是Chlorella sp中的主要极性脂。甜菜碱脂DGTS和磷脂PC是构成非光合膜的主要组分。Chlorella sp.中的主要脂肪酸为C16:0、C16:1耜C20：5（EPA)，后者主要存在于MGDG、DGDG和DGTS中，而三脂酰甘油也含有接近7%的EPA。 海洋微藻Chlorella sp.1061虽然被归属到绿藻纲绿藻目小球藻属，但是我们的研究表明，其色素、极性脂皮其脂肪酸组成与其它小球藻属藻类存在这很大差异Chl b是绿藻纲藻类中最主要的光合色素之一，1 6：4(n-3)和l 8：3(n-3)是绿藻微藻的主要脂肪酸，然而所有这些绿藻的特征化合物均未在Chlorella sp. 1061中检测到。DGTS和20:5(n-3)存在于很多的海洋微藻中，我们从Chlorella sp. 1061 中分离到占总极性甘油脂8 mo1%的DGTS，并从MGDG、DGDG和DGTS等极性甘油脂中检测到大量的20:5(n-3)。但是一般认为，小球藻属藻类中不舍这两种化合物。根据Chlorella sp. 1061的以上特点，这种藻不应该被归到小球藻属中。另外，由于Chlorella sp. 1061在色素、膜脂和脂肪酸组成特征方面大眼藻纲( Eustigmatophyceae)中的微绿球藻（Nannochloropsis）非常相似，因此，我们认为ChloreHa sp. 1061可能是Nannochloropsis中的一个种。但是未得到更进一步的证明和权威的认可之前，本文中我们仍然沿用ChloreHa sp,这一名称。 许多藻类中DGTS和PC -般不会同时存在，或者说一个存在时另外的一个的含量非常低。由此有人认为DGTS和PC之间存在着相互替代的关系。然而本研究中发现正常培养条件下Chlorella sp.中的DGTS和PC含量均较高（约10%）。磷处理实验结果表明，磷缺乏时Chlore Ha sp,中DGTS舍量大幅升高，而同时PC含量相应下降许多：但高浓度的磷并不能提高PC含量和降低DGTS含量，说明Chlorella sp,中DGTS仍可起替代PC的作用，然而PC可能并不能替代DGTS。Chlorella sp.中MGDG和DGTS脂肪酸组成及其位置分布结果显示，它们的组成和分布相似;在老化培养过程中MGDG和DGTS表现出周期性的相反的含量升高、降低的趋势，这进一步说明MGDG和DGTS之间存在着特殊的关系，MGDG可能合成自DGTS。 海洋微藻富含有利于人体健康的长链不饱和脂肪酸，如何提高微藻脂肪酸特别是多不饱和脂肪酸产量是目前研究的热点之一。本文首次报道了同时加入葡萄糖和硫代硫酸钠对Chlorelta sp,的生长、脂类组成和脂肪酸总产量的影响，结果显示葡萄糖和硫代硫酸钠存在明显而且强烈的互作，二者在培养液中的同时存在显著刺激了脂肪酸总产量的积累，在培养液中分别加入2.5 mM的葡萄糖和5mM的硫代硫酸钠，脂肪酸的产量可以比对照提高78%。而低浓度的葡萄糖和硫代硫酸钠对Chlorella sp.脂肪酸组成影响变化不明显，甚至在硫代硫酸钠存在下令人感兴趣的EPA含量还略有升高。显然，在Chlorella sp.培养中同时加入低浓度的葡萄糖和硫代硫酸钠是极具潜力的提高脂产量的方法，也可作为提高培养微藻其它活性物质产量借鉴的方法。在不久的将来，这种培养方法很可能发展成为生产实践中提高Chlore sp．乃至其它微藻脂肪酸、EPA和其它活性物质产量的经济有效的新途径。

理化因子对PSII内周天线CP43和CP47色素蛋白复合体结构与功能的影响

从菠菜叶绿体中分离纯化出PSII内周天线CP43及CP47色素蛋白复合物。通过利用光谱学手段 (吸收光谱、荧光光谱、CD光谱等)及生化技术(HPLC和电泳等)，研究了酸、碱、强光及高温等理化因子对其结构和功能的影响。结果如下： 1：酸和碱处理对CP43和CP47结构和功能的影响 1），酸、碱处理均使CP43和CP47红区主峰吸收降低，蓝区Soret带吸收降低，Soret带的附属带吸收增加，红区及蓝区吸收主峰均蓝移。酸处理时在542 nm及510 nm附近出现Pheo a的吸收峰，碱性处理时出现642 nm的吸收峰。酸、碱处理后CP43及CP47中绝大部分色素仍然结合在脱辅基蛋白上, 吸收光谱的变化源于结合态的色素而非游离色素。酸性条件下Chl a受到破坏变为Pheo a 使CP43及CP47失绿, 但Pheo a仍牢固地结合在脱辅基蛋白上，使CP43及CP47出现Pheo a的吸收峰。碱性条件下虽然绝大部分色素也结合在脱辅基蛋白上，但色素与蛋白之间的亲和力减弱，使其在进行PAGE电泳时从蛋白质上脱落。碱性条件下642 nm吸收峰的出现是OH- 与Chl a之间相互作用的结果，它需要蛋白质次级结构的变化，当蛋白质次级结构保持完整时或Chl a 分子被尿素分子包围时这种作用受到抑制。碱性条件下CP43及CP47中642 nm吸收峰的出现取决于Chl a与OH- 的相对量，同样在进行PAGE电泳时CP43中Chl a与脱辅基蛋白的分离也取决于Chl a与OH- 的相对量。 2），CP43中β-Car与Chl a之间的能量传递易于受碱的干扰，而在CP47中易于受酸的干扰。酸对CP43和CP47蛋白质次级结构的影响远小于碱的影响。酸和碱都显著地影响了Chl a分子所处的微环境并干扰了Chl a分子之间的激子相互作用。 3), 酸和碱以不同的方式影响CP43和CP47的光吸收、能量传递及蛋白质的次级结构。H+ 可以在不破坏蛋白质次级结构的情况下渗透到色素蛋白内部与Chl a反应而产生Pheo a，同时使β-Car和Chl a (或Pheo a) 之间的相对位置发生变化, 它们之间的能量传递受到干扰。OH- 首先破坏CP43和CP47中的氢键, 引起蛋白质解折叠, 使屏蔽在蛋白质内部的Chl a 暴露，进而与暴露的Chl a作用而将其皂化为叶绿素酸酯。随着蛋白质的去折叠, 其远紫外CD活性丧失, 色素所处的微环境受到干扰, β-Car和Chl a (或Chl a酸酯) 之间的相对位置发生改变, 因此β-Car和Chl a ( 或Chl a酸酯) 之间的能量传递也受到干扰。 4),酸或碱处理使CP43和CP47中Chl a 在进行HPLC时洗脱时间和洗脱峰面积发生改变, 但β-Car洗脱时间和洗脱峰的面积相对稳定。意味着酸碱处理并不破坏CP43及CP47中的β-Car。 2.强光照射对CP43结构和功能的影响 强光(1000 μmol E./m2.s)可以引起CP43中Chl a的漂白及蛋白质的降解，这种作用明显地被连二亚硫酸钠抑制。同样条件下,β-Car 的光吸收几乎不受光破坏的影响。 3.高温处理对CP43、CP47及其它PSII亚基降解的影响 用从菠菜叶片中分离出的PSII、OECC(放氧核心复合体)、去除33 kDa的OECC、RC-CP47(结合有CP47的反应中心复合体)、RC(反应中心复合体)、CP43及CP47等多亚基或单亚基色素蛋白复合体，研究这些复合体中各蛋白亚基在高温时的降解情况。结果发现PSII各蛋白亚基降解对温度的敏感性显著不同： CP43、D2、CP29、LHCII >D1、CP47 >> PsbO、PsbP、PsbQ及Cytb559 (α亚基)。

假根羽藻细胞色素b6f蛋白复合体中α-胡萝卜素的结构与功能

细胞色素b6f蛋白复合体（Cyt b6f）是光合链中连接两个光系统（PSII 和PSI）的中间电子载体蛋白复合物，其主要的生理功能是催化电子传递和质子跨膜转移，形成跨膜质子电化学梯度，为ATP的合成提供能量，在光合作用光能转化过程中占有很重要的地位。细菌和莱茵衣藻Cyt b6f的晶体结构已于2003年底获得了近原子水平的解析，但有关该复合物中两种色素（Chl a和β-Car）的生理功能及其机理尚无明确的解释。预计它们将成为今后几年的研究热点,因为揭示Cyt b6f蛋白复合体中Chl a和β-Car分子的生理功能对于进一步阐明光合作用高效转能及其调控的分子机理具十分重要的意义。鉴于目前尚未见到海洋绿藻Cyt b6f的报道，本文以海洋绿藻—假根羽藻（Bryopsis corticulans）类囊体膜上的Cyt b6f蛋白复合体为对象，对其中的类胡萝卜素的分子结构与生理功能进行了比较系统地研究。 首先，我们改进了原用于菠菜类囊体膜Cyt b6f的分离、纯化流程，在原流程的基础上增加了一次2 mol/L NaBr洗膜，彻底地去除了膜表面的杂蛋白;还调整了第二次硫酸铵分级沉淀时的饱和度，并将38-45%饱和度下的沉淀物确定为需要收集的Cyt b6f制剂。采用此改进的流程，我们首次从假根羽藻类囊体膜中分离纯化了高活性、高纯度的Cyt b6f制剂。SDS-PAGE分析的结果显示该制剂的4个多肽亚基 （Cytf 、Cyt b6 、Rieske[Fe-s]及亚基IV）的表观分子量分别为34.8、24.0、18.7和16.7 kD;Cyt b6 / f 比值接近2.0， 其纯度值为9.9 nmol cyt f/mg;其催化电子传递的活性 （C10-PQH2→PC）为73 e/s。HPLC 和共振拉曼光谱分析表明，假根羽藻Cyt b6f中的类胡萝卜素为α-胡萝卜素分子，它是一种在Cyt b6f中尚未报道过的类胡萝卜素。定量分析表明，每个假根羽藻Cyt b6f单体中全反式(all-trans)和9顺式（9-cis）α-胡萝卜素的含量分别为0.2和0.7个分子，另外还含有1.2分子的Chl a。CD光谱分析表明该9-cis-α-胡萝卜素处在一个不对称的蛋白环境中。TLC分析表明该制剂是一种缺脂的Cyt b6f蛋白复合体。 采用稳态荧光激发光谱，时间分辨吸收光谱及Chl a的光破坏实验对假根羽藻Cyt b6f中α-胡萝卜素的功能进行了研究。结果表明，Cyt b6f中α-胡萝卜素可以将它吸收的光能传递给Chl a，其能量传递效率为62.4%，提出α-胡萝卜素分子与Chl a分子之间的单线态能量传递是遵从Föster 机制进行的;α-胡萝卜素分子对Chl a分子有一定的光保护作用，这种保护作用是通过清除单线态氧来实现的。另外还发现Cyt b6f中的Chl a分子可能与其周围的氨基酸残基存在相互作用，认为这是其进行自我光保护的一种方式。 此外，还采用HPLC研究了光和暗交替对假根羽藻Cyt b6f中α-胡萝卜素构型的影响，并对假根羽藻Cyt b6f选择结合α-胡萝卜素的原因进行了初步的分析。