金黄色葡萄球菌肠毒素C2的结构特征与生物学功能研究

通过PCR技术对Staphylococcal enterotoxin C2(SEC2)的氨基端和羧基端部位进行删除突变。研究结果显示删除羧基端77个氨基酸对SEC2超抗原和致热活性没有显著影响，但更进一步的删除导致SEC2活性显著降低。而少量氨基端残基删除则可导致SEC2超抗原活性显著降低，说明SEC2超抗原活性主要集中于其氨基端部位。以上研究结果也表明SEC2分子的完整性并不是其超抗原活性所必需的。 对二硫环及Zn结合位点配位组氨酸残基在SEC2分子中的生物学功能进行研究。以定点突变技术构建SEC2二硫环突变蛋白，从而干扰二硫键的形成。研究结果表明干扰二硫环形成对SEC2的超抗原、催吐和致热等活性均有显著影响，说明二硫环在维持SEC2生物学活性方面具有重要作用。此外，针对Zn结合位点配位组氨酸残基的研究结果显示突变118位和122位组氨酸后对SEC2的超抗原活性没有有显著影响，而47位组氨酸的突变导致SEC2分子的超抗原活性显著降低。动物实验结果显示分别突变118位和122位组氨酸残基后均导致SEC2分子催吐及热源活性显著降低，而47位组氨酸突变仍具有较高的催吐和致热活性。说明Zn结合位点配位组氨酸残基在SEC2的催吐、致热和超抗原活性中扮演了重要的作用，并进一步揭示肠毒素诱导的超抗原和致热活性之间没有明显的相关性。 以Leu及Glu分别替代20和22位氨基酸残基后SEC2超抗原活性有显著提高，并将具有减毒作用的组氨酸位点突变引入上述活性增强的SEC2突变，从而构建减毒突变蛋白。结果显示引入118和122位组氨酸双突变后突变蛋白保留了与SEC2相当的超抗原和抗肿瘤活性，但与SEC2相比致热活性有显著下降，为减毒SEC2超抗原药物的开发提供了可能性。 为探索金黄色葡萄球菌的体内基因突变方法，本研究对金黄色葡萄球菌基因组中的α-溶血毒素基因进行敲除。首先构建同源重组质粒pMHL-α，经金黄色葡萄球菌RN4220修饰后再通过原生质体转入金黄色葡萄球菌SM-01。含重组质粒pMHL-α的金黄色葡萄球菌SM-01在42℃诱导条件下培养多代，最终筛选出α-溶血毒素基因缺失菌株。经序列分析和血平板溶血实验结果证实最终获得产SEB金黄色葡萄球菌α-HL缺失菌株。为构建产减毒肠毒素的金黄色葡萄球菌基因工程菌株提供了一定的理论基础和方法。

SEA的基因克隆及高效表达工程菌的构建

Staphylococcal enterotoxin A(SEA）是由金黄色葡萄球菌分泌至胞外的一种单亚基蛋白质。它能与抗原递呈细胞上的MHC II受体结合，激发大量T细胞活化，释放多种细胞因子。正是由于SEA是一种强的T细胞激活剂，近年来，它在肿瘤的免疫治疗中显示出巨大的应用潜力。本文总结了国内外近十几年来在SEA治疗肿瘤方面的研究成果，指出，SEA靶向药物及低毒性SEA分子改造是SEA类药物研究的方向。利用PCR方法从金葡菌基因组DNA中扩增出seap基因（即SEA前体基因，含信号肤编码区），采用重叠PCR技术突变了694佩714碱基之间的所有稀有密码子，得到seap，。基因表达结果证实，改造seap基因中稀有密码子对提高基因表达水平非常有效。对seap基因中关键稀有密码子的突变在国内外尚属首次。以seapm为模板采用PCR方法扩增出seam (SEA成熟蛋白基因）。自行设计，自行构建成功一个新型原核表达载体7ZTS。它具有克隆，测序和表达在同一载体上进行，并可依据蓝白反应挑选重组子的特征。7ZTS表达载体将多种功能集于一体的独特优点是目前已知表达载体所不具备的，其大大简化了分子生物学操作步骤，提高了工作效率。利用7ZTS表达载体，在大肠杆菌JM109（DE3)中表达了mseap和seam基因。前者以包含体形式表达出SEA前体蛋白，后者以包含体和可溶性两种形式存在。通过均匀设计方法，摸索出'0sea基因表达的最佳条件为：诱导前生物量ODEo。为0. 8，装液量为28%，诱导温度为37'C，诱导时间为8小时。在此条件下，SEA表达量占细胞总蛋白的37%，可溶性SEA约占70%o SEA如此高效的表达为国内一外首次报道。质粒稳定性实验表明，7ZTS一msea重组质粒具有极好的稳定性，连续培养72小时或IPTG诱导48小时后，质粒基本不丢失。以上实验结果为SEA的大规模制备和SEA导向药物的研究开发奠定了基础。

产SEB金黄色葡萄球菌α-溶血毒素基因缺失菌株的构建

构建产肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB)的金黄色葡萄球菌α-溶血毒素(α-hemolysin,α-HL)缺失菌株。首先构建用于α-HL基因敲除的同源重组质粒pMHL-α,经金黄色葡萄球菌RN4220修饰后再通过原生质体转入金黄色葡萄球菌SM-01。含重组质粒pMHL-α的金黄色葡萄球菌SM-01在42℃诱导条件下培养多代,最终筛选出α-溶血毒素基因缺失菌株。经序列分析和血平板溶血实验结果证明最终获得产SEB金黄色葡萄球菌α-HL缺失菌株。为野生型金黄色葡萄球菌的体内遗传操作及构建产超抗原药物金黄色葡萄球菌基因工程菌株提供了一定的理论基础和方法。