A centromeric satellite sequence in the Pacific oyster (Crassostrea gigas Thunberg) identified by fluorescence in situ hybridization

A highly repetitive satellite sequence was previously identified in the Pacific oyster Crassostrea gigas Thunberg. The sequence has 168 bp per unit, present in tandem repeats, and accounts for 1% to 4% of the genome. We studied the chromosomal location of this satellite sequence by fluorescence in situ hybridization (FISH), A probe was made by polymerase chain reaction and incorporation of digoxigenin-11-dUTP. Hybridization was detected with fluorescein-labeled antidigoxigenin antibodies. FISH signals were located at centromeric regions of 7 pairs of the Pacific oyster chromosomes. No interstitial site was found. Signals were strong and consistent on chromosomes 1, 2, 4, and 7, but weak or variable oil chromosomes 5, 8, and 10. No signal was observed on chromosomes 3, 6, and 9. Our results showed that this sequence is clearly a centromeric satellite, disputing its previous assignment to the telomeric and submetacentric regions of 2 chromosomes. No signal was detected in the American oyster (Crassostrea virginica Gmelin).

Chromosome inheritance in triploid Pacific oyster Crassostrea gigas thunberg

Reproduction and chromosome inheritance in triploid Pacific oyster (Crassostrea gigas Thunberg) were studied in diploid female x triploid male (DT) and reciprocal (TD) crosses. Relative fecundity of triploid females was 13.4% of normal diploids. Cumulative survival from fertilized eggs to spat stage was 0.007% for DT crosses and 0.314% for TD crosses. Chromosome number analysis was conducted on surviving progeny from DT and TD crosses at 1 and 4 years of age. At Year 1, oysters from DT crosses consisted of 15% diploids (2n = 20) and 85% aneuploids. In contrast, oysters from TD crosses consisted of 57.2% diploids, 30.9% triploids (3n = 30) and only 11.9% aneuploids, suggesting that triploid females produced more euploid gametes and viable progeny than triploid males. Viable aneuploid chromosome numbers included 2n + 1, 2n + 2, 2n + 3, 3n - 2 and 3n - 1. There was little change over time in the overall frequency of diploids, triploids and aneuploids. Among aneuploids, oysters with 2n + 3 and 3n-2 chromosomes were observed at Year 1, but absent at Year 4. Triploid progeny were significantly larger than diploids by 79% in whole body weight and 98% in meat weight at 4 years of age. Aneuploids were significantly smaller than normal diploids. This study suggests that triploid Pacific oyster is not completely sterile and cannot offer complete containment of cultured populations.

Seasonal variation in metabolism of cultured Pacific oyster, Crassostrea gigas, in Sanggou Bay, China

Rates of respiration and excretion of the Pacific oyster, Crassostrea gigas, were measured seasonally from June 2002 to July 2003 under ambient conditions of food, water temperature, pH, and salinity in Sanggou Bay, an important mariculture coast in north China. The aim of this study is to obtain fundamental data for further establishing an energy budget model and assessing the carrying capacity for cultivation of C. gigas in north China. Oysters were collected monthly or bimonthly from the integrated culture areas of bivalve and kelp in the bay. Oxygen consumption and ammonium and phosphorus excretion rates were measured, and ratios of O/N and NIP were calculated. One-way ANOVA was applied to determine differences among these parameters that act as a function of seasonal variation. All the physiological parameters yielded highly significant variations with season (P<0.01) The rate of respiration varied seasonally, with the highest oxygen consumption rate in July and the lowest rate in January, ranging from 0.07 to 2.13 mg O-2 h(-1) g(-1) dry tissue weight (DW). Maximum and minimum ammonium excretion rates were recorded in August and January, respectively, ranging from 0.51 to 5.40 mu mol NH4-N h(-1) g(-1) DW. Rates of phosphorus excretion varied from 0.11 (in January) to 0.64 (in July) mu mol PO4-P h(-1) g(-1) DW. The O/N and N/P ratios changed from 9.2 (in January) to 59.8 (in July) and from 4.6 (in January) to 10.9 (in August), respectively. For each season, the allometric relationship between the physiological response (e.g., rate of oxygen consumption, ammonium and phosphorus excretion) and DW of the animal was estimated using the formula: Y=a x DWb. (C) 2005 Elsevier B.V. All rights reserved.

Inheritance of 15 microsatellites in the Pacific oyster Crassostrea gigas: segregation and null allele identification for linkage analysis

Microsatellites were screened in a backcross family of the Pacific oyster, Crassostrea gigas. Fifteen microsatellite loci were distinguishable and polymorphic with 6 types of allele-combinations. Null alleles were detected in 46.7% of loci, accounting for 11.7% of the total alleles. Four loci did not segregate in Mendelian Ratios. Three linkage groups were identified among 7 of the 15 segregating loci. Fluorescence-based automated capillary electrophoresis (ABI 310 Genetic Analyzer) that used to detect the microsatellite loci, has been proved a fast, precise, and reliable method in microsatellite genotyping.

AFLP-based genetic linkage maps of the Pacific oyster Crassostrea gigas Thunberg

Amplified fragment length polymorphisms (AFLPs) were used for genome mapping in the Pacific Oyster Crassostrea gigas Thunberg. Seventeen selected primer combinations produced 1106 peaks, of which 384 (34.7%) were polymorphic in a backcross family. Among the polymorphic markers, 349 were segregating through either the female or the male parent. Chi-square analysis indicated that 255 (73.1%) of the markers segregated in a Mendelian ratio, and 94 (26.9%) showed significant (P < 0.05) segregation distortion. Separate genetic linkage maps were constructed for the female and male parents. The female framework map consisted of 119 markers in 11 linkage groups, spanning 1030.7 cM, with an average interval of 9.5 cM per marker. The male map contained 96 markers in 10 linkage groups, covering 758.4 cM, with 8.8 cM per marker. The estimated genome length of the Pacific oyster was 1258 cM for the female and 933 cM for the male, and the observed coverage was 82.0% for the female map and 81.3% for the male map. Most distorted markers were deficient for homozygotes and closely linked to each other on the genetic map, suggesting the presence of major recessive deleterious genes in the Pacific oyster.

Chromosome segregation in fertilized eggs from triploid Pacific oysters, Crassostrea gigas (Thunberg), following inhibition of polar body 1

Chromosome segregation in fertilized eggs from triploid Pacific oysters, following inhibition of the first polar body (PB1), was studied with acetic orcein staining techniques. To block the release of PB1, fertilized eggs were treated with 0.5 mg/l of cytochalasin B (CB). Four types of segregation were observed, namely, ''tripolar segregation'' (54.5%), ''united bipolar segregation'' (12%), ''separated bipolar segregation'' (2.5%), and ''incomplete united bipolar segregation'' (4%). The remaining 23% could not be classified because of chromosome disorganization, but appeared to be variants of the above. It seemed clear that the predominant pattern that gave rise to tetraploids was united bipolar segregation, although certain separated bipolar segregations might also lead to the formation of tetraploids. The sequential events of meioses observed in CB-treated eggs are described. The asynchrony of meiotic events and possible mechanisms for the various types of chromosome segregation are discussed.

Concurrence of cat and tet genes in multiple antibiotic-resistant bacteria isolated from a sea cucumber and sea urchin mariculture farm in China

A basic understanding of abundance and diversity of antibiotic-resistant microbes and their genetic determinants is necessary for finding a way to prevent and control the spread of antibiotic resistance. For this purpose, chloramphenicol and multiple antibiotic-resistant bacteria were screened from a mariculture farm in northern China. Both sea cucumber and sea urchin rearing ponds were populated with abundant antibiotic-resistant bacteria, especially marine vibrios. Sixty-five percent chloramphenicol-resistant isolates from sea cucumber harbored a cat gene, either cat IV or cat II, whereas 35% sea urchin isolates harbored a cat gene, actually cat II. The predominant resistance determinant cat IV gene mainly occurred in isolates related to Vibrio tasmaniensis or Pseudoalteromonas atlantica, and the cat II gene mainly occurred in Vibrio splendidus-like isolates. All the cat-positive isolates also harbored one or two of the tet genes, tet(D), tet(B), or tet(A). As no chloramphenicol-related antibiotic was ever used, coselection of the cat genes by other antibiotics, especially oxytetracycline, might be the cause of the high incidence of cat genes in the mariculture farm studied.

贝藻混养系统中贝类食物来源的定量分析

应用稳定碳、氮同位素比值法和脂肪酸标志分析法，较为系统地研究了贝藻混养系统中滤食性贝类的食物来源，评估了大型藻类对混养系统及滤食性贝类的物质贡献。主要研究结果如下： 1.综述了典型生态系统中大型藻类和滤食性贝类各自的生态学地位和作用，大型藻类与滤食性贝类不仅在水体营养盐方面存在互利关系，二者在物质循环与收支方面同样具有耦合性，大型藻类提供的颗粒态有机质可以为滤食性贝类提供饵料来源。 2.总结了稳定同位素比值法和脂肪酸标志法在海洋生态系统食物来源及食物网分析中的应用，并建立了两种方法的具体操作规程。 3.分析了栉孔扇贝Chlamys farreri和海带Laminaria japonica混养系统中海带碎屑形成及释放不同阶段的生态学特征，评估了碎屑对扇贝的饵料贡献。海带在6周内释放了自身约27％的碳；碎屑形成及释放过程中C:N比值显著下降，同时伴随着旺盛的细菌降解，碎屑中也发现有大量硅藻类和原生动物存在。稳定同位素分析证实海带碎屑是混养期间扇贝的主要食物来源。 4.查明了春季胶州湾潮间带自然分布的长牡蛎Crassostrea gigas、紫贻贝Mytilus galloprovincialis和湾内浅海筏式养殖栉孔扇贝的可能食物来源。湾内栉孔扇贝饵料组成中浮游硅藻类为最主要部分，同时混杂有陆源有机质和细菌类物质；潮间带自然生长的牡蛎和贻贝饵料组成中，浮游植物占86.2-89.0％，种类组成中除硅藻外还包括一定比例的金藻和甲藻类；潮间带繁盛的孔石莼Ulva pertusa藻床为两种贝类提供了8.7-11.0％的补充食物来源。 5.揭示了桑沟湾贝藻混养海区春、夏季栉孔扇贝饵料来源组成情况及其季节变化，评估了海带养殖区碎屑碳量季节变化及海带来源碳对扇贝组织碳的贡献。结果表明，湾内贝藻混养区碎屑碳量为75.52-265.19 μg l-1，其在水体总颗粒态有机碳中的比例为25.6-73.8％。海带来源碎屑碳对栉孔扇贝组织碳的贡献比例为14.1-42.8％，且与水体碎屑碳比例的季节变化存在极显著相关性(F=0.992, P=0.004)。5月份湾外海带养殖区水体碎屑碳量为110.12-144.71 μg l-1，显著高于湾内无海带区（75.52 μg l-1），湾外养殖的扇贝组织中海带来源碳比例为22.0-24.1％，显著高于湾内单养区扇贝（9.6％）。估算结果表明，桑沟湾每年收获的6967吨（总湿重）栉孔扇贝中，海带提供了约57.1吨碳，换算为海带干物质为219.6吨。脂肪酸标志分析结果表明，2月份至8月份硅藻类在扇贝饵料组成中比例逐渐下降，而细菌类比例逐渐升高。整个采样期间，EPA/DHA比例较低，说明扇贝饵料组成中可能包括高DHA含量的组分。

双壳贝类幼虫变态诱导及其机理研究

变态过程是双壳贝类由幼虫向成体转变的一个必不缺少的发育阶段。研究双壳贝类幼虫的变态过程及其机理，对于阐明它们的种群数量变动，促进重要经济双壳贝类增养殖的发展有重要的理论和实践意义。本论文除了用化学物质对几种双壳贝类(海湾扇贝、墨西哥湾扇贝和硬壳蛤)幼虫的变态进行诱导外，主要以激素和神经递质的作用方式为基础，通过直接测定双壳贝类(以海湾扇贝为代表)幼虫体内激素和神经递质、第二信使cAMP等生化物质含量的变化来研究双壳贝类幼虫变态过程中的信息传递途径，从分子生物学和神经生物学角度阐明双壳贝类幼虫变态机理。主要结果如下：1．通过参考国内外大量文献的基础上，较为系统地评述了近二十年来海洋无脊椎动物幼虫附着变态研究的一些进展情况，主要包括诱导因子、附着变态机理模型、人工诱导物的应用和延迟变态四个方面。到目前为止，人们已经发现了许多海洋无脊椎动物幼虫附着变态的诱导物质，主要分为天然诱导物和人工诱导物两大类，一些人工诱导物如GABA、肾上腺素和去甲肾上腺素已经在经济贝类苗种生产中得到应用。幼虫附着变态机理模型主要有长牡蛎(Crassostrea gigas)幼虫附着变态的双调控模型、红鲍(Haliotis rufescens)幼虫附着变态的上行调节模型以及多毛类Phragmatopoma california幼虫附着变态的脂肪酸调控模型。本论文还评述了海洋无脊椎动物幼虫发生延迟变态的原因以及延迟变态对海洋无脊椎动物造成的影响，并提出了解决的方法和今后研究的重点问题。2．在室内用氯化乙酰胆碱、ATP和CaCl_2 3种化学物质对海湾扇贝幼虫的变态进行了诱导实验。结果表明，虽然在个别浓度和处理时间氯化乙酰胆碱和ATP有诱导作用，但总体诱导效果不显著。而10×10~(-3)～40×10~(-3M的CaCl_2在处理12～24h后诱导效果较显著，其诱导效果对处理时间的依赖性较显著，在浓度为40×10~(-3)M和处理时间为24h时诱导效果最好，与对照组相比，变态率提高23.18％。3种诱导物对幼虫死亡率均有显著影响，并且死亡率对浓度和处理时间均有显著的依赖性，浓度越高，处理时间越长，死亡率越高。3．用KCl、肾上腺素、去甲肾上腺素和氯化胆碱进行了墨西哥湾扇贝(Argopectenirradians concentricus Say)幼虫变态的诱导作用实验。结果表明，KCl、肾上腺素、去甲肾上腺素和氯化胆碱对墨西哥湾扇贝幼虫变态均有显著诱导作用。KCl在处理时间为12h～48h范围内均有诱导作用；13.42×10~(-3)M和20.13×10~(-3)M的KCl诱导效果较好，变态率平均提高10％以上。1．O×10~(-6)M～50×10~(-6)M的肾上腺素在处理时间为lh～12h较适宜，此时变态率均提高10％以上。1.0×10~(-6)M～50×10~(-6)M的去甲肾上腺素在处理时间为1h～24h都较适宜，变态率平均均提高10％以上，最高可提高31．07％。0.01×10~(-4)M～1.O×10~(-4)M的氯化胆碱在处理时间为12h～48h时诱导效果均较好，它们之间的平均变态提高率并没有显著差别，均在12％～13％之间。10×10~(-4)M的氯化胆碱在处理时间为12h时诱导效果较明显，变态率可以提高19.14％，超过12h，变态率明显下降，100×10~(-4)M的氯化胆碱明显产生毒害作用，幼虫变态率均为零，而幼虫的死亡率均为100％。4．用KCl、肾上腺素、去甲肾上腺素、L-DOPA、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，Serotonin，5-HT)和GABA(γ-氨基丁酸)进行了不同浓度不同处理时间对硬壳蛤(Mercenaria mercenaria L.)幼虫变态诱导实验。结果表明，KCl、肾上腺素、去甲肾上腺素、L-DOPA和5-羟色胺对硬壳蛤幼虫的变态均有诱导作用，而GABA的诱导 作用不显著。KCl的最佳诱导浓度随处理时间不同而有所不同。当处理时间为1～24h时，KCl的最佳诱导浓度为33.56×10~(-3)M，此时幼虫变态率均提高24％以上，当处理时间为48h时，KCl的最佳诱导浓度为20.13～26.85×10~(-3)M，处理时间为72h时，最佳诱导浓度为13.42×10~(-3)M。肾上腺素和去甲肾上腺素的诱导作用与浓度和处理时间均有关。肾上腺素的最佳处理浓度为100×10~(-6)M，最佳处理时间均为8h，此时幼虫变态率提高最大，为36.97％。当去甲肾上腺素的诱导浓度为100×10~(-6)M，处理时间为8h～16h时，幼虫变态提高率较高，均大于18％，死亡提高率均低于30％，当去甲肾上腺索诱导浓度为500×10~(-6)M时，虽然在8h～16h的处理时间范围内，幼虫变态提高率也较高，均大于18％，但当处理时间超过8h，在16～48h范围内，幼 虫死亡提高率明显升高，均大于50％。L-DOPA的适宜诱导浓度为10×10~(-6)M～50×10~(-6)M，适宜处理时间为8～24h，此时幼虫变态率均提高30％以上，最高可提高79.43％。5-羟色胺的诱导作用较强，其适宜诱导浓度为100×10~(-6)M—1000×10~(-6)M，适宜处理时间为0.5～24h，此时幼虫变态率提高均在30％以上，当处理时间为8h时，最佳诱导浓度为1000×10~(-6)M，此时幼虫变态率提高57.5％，当处理时间为24h时，最佳诱导浓度为100×10~(-6)M，此时幼虫变态率提高69.29％。GABA的诱导作用较弱，最佳诱导浓度随处理时间的不同而有所不同。处理时间为24h和48h时，最佳诱导浓度为0.1×10~(-6)M；处理时间为0.5～16h时，最佳诱导浓度为100×10~(-6)M。5．KCl、肾上腺素、去甲肾上腺索、L-DOPA、5-羟色胺、GABA、茶碱和咖啡因8种诱导物对不同发育阶段海湾扇贝幼虫变态的诱导作用是不同的。13．42×10~(-3)M和20.13×10~(-3)M的KCl对第12天幼虫的变态有抑制作用，变态提高率为负值；之后当幼虫发育至第13和14天时，两浓度的KCl能够明显诱导幼虫变态，变态提高率均高于20％，而对于第16天的幼虫诱导作用有所减弱，变态提高率有所降低；26.85×10~(-3)M的KCl对第12和13天幼虫的变态均有抑制作用，变态提高率为负值，对第14和16天幼虫的变态却有明显的持续的诱导作用，变态提高率分别为22.98％和37.5％。神经递质肾上腺素、去甲肾上腺素、L-DOPA、5-羟色胺和GABA的诱导作用规律基本相似，即对第13天海湾扇贝幼虫的变态有明显的抑制作用，变态提高率均为负值，而对第14天幼虫的诱导作用较显著。茶碱和咖啡因作为影响细胞内cAMP的物质，它们的诱导作用规律与神经递质有所不同。它们对第13天海湾扇贝幼虫变态的诱导效果最好。6．测定了不同发育阶段及人工诱导后海湾扇贝幼虫体内去甲肾上腺素、多巴胺和5-羟色胺含量的变化规律。结果表明，海湾扇贝幼虫体内去甲肾上腺索含量在变态前和变态后没有明显变化，变态前为2352(pg／mg湿重)，变态后为2770(pg／mg湿重)。多巴胺和5-羟色胺含量在变态前随幼虫的发育而增加，变态前(第13天)急剧增加，第13天的幼虫比第12天的幼虫分别增加了2.8倍和5.7倍，变态后急剧下降，变态后幼苗比第13天的幼虫分别降低了25.1倍和16.4倍。海湾扇贝幼虫体内DA：NE比和5-HT：NE比在变态前和变态后变化比较剧烈。DA：NE比和5-HT：NE比在变态前(第13天)急剧增加，第13天的幼虫比第12天的幼虫增加了3.O倍(DA：NE比)和5.0倍(5-HT:NE比)；变态后急剧降低，变态后幼苗比第13天的幼虫降低了29.8倍(DA：NE比)和19.5倍(5-HT：NE比)。海湾扇贝幼虫经KCl和氯化钙诱导24h后，体内去甲肾上腺素、多巴胺和5-羟色胺以及DA：NE比和5-HT：NE比均有所降低。本实验的结果表明，多巴胺和5-羟色胺可能启动了海湾扇贝幼虫的变态过程。7．茶碱和咖啡因对墨西哥湾扇贝幼虫的变态均有明显诱导作用。它们的诱导作用均对浓度的依赖性较强，对处理时间的依赖性较弱。10×10~(-4)M的茶碱诱导效果最好，平均变态提高率达33％，其次为1.0×10~(-4)M和100×10~(-4)M的茶碱，平均变态提高率分别为23.15％和21.97％。处理时间对茶碱诱导效果影响不显著，在1～24h范围内，平均变态提高率在19.07～26.1％之间变动。10×10~(-4)M的咖啡因诱导效果最佳，4个处理时间的平均变态提高率为36.01％，其次为100×10~(-4)M，平均变态提高率为26.43％。处理时间对茶碱的诱导效果影响不大，在1～24h范围内，平均变态提高率在19.65～22.02％之间变动。8．采用直接测定cAMP的方法来研究cAMP是否参与了海湾扇贝幼虫的变态过程。结果表明，cAMP参与了海湾扇贝幼虫的变态过程。海湾扇贝幼虫体内cAMP含量随着发育阶段的不同而有所变化。在D形幼虫期最低，为73 pmol／(mg蛋白质)；当到达壳顶期幼虫时cAMP含量明显增加，比D形幼虫期提高了12.7倍。从壳顶期幼虫到眼点幼虫(100％，第13天)cAMP含量增加速度较慢，各发育阶段分别比前一发育阶段增加了0.4倍、0.3倍和0.2倍。但当幼虫变态后，体内cAMP含量又急剧增加，幼苗体内cAMP含量比眼点幼虫(100％，第13天)增加了6.1倍。当用KCl、肾上腺索和L-DOPA诱导后，幼虫体内cAMP含量明显增加，分别比对照组提高了7.8倍、1.5倍和10.7倍，说明cAMP参与了这3种诱导物诱导海湾扇贝幼虫变态的过程。9．在前面实验结果和参考有关文献的基础上，初步提出了以海湾扇贝为代表的双壳贝类幼虫变态机理模型：幼虫变态分为两个过程：启动过程和后续过程。当幼虫发育到一定阶段，在外界刺激因子的作用下，体内分泌多巴胺和5-羟色胺，多巴胺和5-羟色胺通过某种信号转导途径(如以DG和IP_3为第二信使)启动变态过程，变态过程启动后，又激活以cAMP为第二信使的信号转导途径(暂时称为后续过程)，两者共同完成了幼虫的变态过程。

改性粘土治理有害赤潮对生态环境的影响初探

本文以室内实验为基础，研究了改性粘土治理有害赤潮的方法对生态环境的影响。研究结果表明：有机和无机改性粘土对溶解氧（DO）、化学耗氧量（COD）、pH等主要水质因子均有改善作用；对营养盐，尤其是磷酸盐有一定的吸附作用，在外加磷酸盐为0-0.3μmol/ml范围内，吸附量随水体中磷酸盐浓度的增加而增大，有机改性粘土对海水中磷酸盐的吸附能力为：有机改性粘土Ⅰ>有机改性粘土Ⅱ>有机改性粘土Ⅲ。通过有机改性粘土对磷酸盐的吸附－再释放情况，进一步探讨了其磷酸盐的释放对赤潮异弯藻（Heterosigma akashiwo）、东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）等赤潮生物生长的影响。实验结果显示，经过有机改性的粘土有利于提高其对磷酸盐的吸附能力，降低对磷酸盐的解吸率，利用有机改性粘土治理赤潮可以缓解海水富营养化程度，即使被吸附的部分磷酸盐能缓慢释放，但仍不足以维持赤潮生物的正常生长。无机改性粘土对磷酸盐和硝酸盐与有机改性粘土有相似的吸附性能。其添加剂PAC的重金属含量符合沉积物排放要求，不会对环境造成压力。 其次，以太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)幼贝为对象，研究了有机改性粘土Ⅱ和无机改性粘土在对海洋底栖生物的影响。急性毒性试验中二者对牡蛎幼贝的半致死浓度（LC50）分别为4.62 g/L和2.67 g/L，均远远大于改性粘土去除赤潮藻的浓度。在能够有效去除赤潮微藻的粘土浓度条件下，经慢性毒性试验发现改性粘土对牡蛎幼贝成活率、生长和摄食略有降低，但无明显影响，在牡蛎幼贝鳃组织和消化道组织的超微结构中未发现机械损伤。 最后，研究了改性粘土在对去除有毒赤潮藻过程中对底栖生物的影响。以能产生麻痹性贝毒（PSP）的塔玛亚历山大藻（A. tamarense，ATHK）为例，研究了PSP在水体中和粘土沉积层中的分布，发现改性粘土去除塔玛亚历山大藻能有效降低水体中藻细胞浓度及其所携带的PSP毒素。由于藻细胞破裂, 虽然沉积层中藻细胞体内部分PSP毒素溢出，但通过塔玛亚历山大藻细胞不同组分对牡蛎的影响发现，细胞内容物和细胞碎片对牡蛎没有明显毒副作用，由此推断改性粘土对藻细胞絮凝沉降后,能降低对生物的不良影响。此外，室内实验模拟了去除赤潮生物塔玛亚历山大藻（A. tamarense，ATHK）、东海原甲藻 (P. donghaiense )、赤潮异弯藻 (H. akashiwo)过程中，比较改性粘土和赤潮微藻对生物体的影响发现改性粘土在去除赤潮藻过程中能提高牡蛎的存活率，进一步证明改性粘土在赤潮生物防控中，是一种有效的应急措施。

长牡蛎SNP标记的开发及多态性检测

长牡蛎是重要的经济养殖贝类，良种化、抗逆性状及快速生长个体的培育是长牡蛎养殖业得以持续发展的基础。目前飞速发展的分子标记辅助育种技术为优良品种的快速培育提供了理论基础和实践经验。本研究以长牡蛎为主要研究材料，探讨了长牡蛎SNP标记的筛选和多态性评价。 本研究利用已有长牡蛎EST库中的序列进行单核苷酸多态（SNP）标记开发。通过对长牡蛎（Crassostrea gigas）已有的EST序列数据库检索，经过序列聚类和拼接得到EST簇4548个，含有不少于4条EST序列的簇共1079个，经过进一步设置筛选条件，整理出可供利用的EST簇313个，得到候选SNP位点共计1140个。目前根据候选SNP位点共设计引物82组，通过片段长度差异等位基因特异性PCR（fragment length discrepant allele specific PCR，FLDAS-PCR）的分型方法，在一野生群体中进行检测和验证，结果共有17个SNP候选位点显示多态性，期望杂合度分布区间为0.088至0.506，观测杂合度分布区间为0.091至0.667；通过哈代-温伯格(HW) 平衡、连锁不平衡检验，结果显示除3个SNP位点的差异显著（P值<0.05）,不符合HW平衡之外，其他14个位点没有明显的连锁不平衡。对含有17个SNP的EST的共同序列进行BlastX分析，推测其功能并确定开放阅读框，从而预测17个SNP的性质。 本研究表明对于目前基因组学研究尚处在初级阶段的海洋生物物种，通过基于EST数据库的SNP开发是一条重要途径，可以有效弥补海洋生物基因组学滞后影响SNP标记开发的现状。

牡蛎的比较解剖学及系统分类和演化的研究

本文对我国己发表的牡蛎作了详细的比较解剖学研究。在强蛎亚科（Pycnodonteinae）发现了第三个心耳－－右上心耳和与其相连的第三条回心静脉－－后静脉，这在双壳类中实属首次报道。第一次提出了牡蛎循环系统的两种类型，附心脏型和无附心脏型。两者之间的主要区别是：前者无肌套血管，其外套血液主要来自环外套动脉和附心脏，而后者由于无附心脏和环外套动脉，其外套血液主要来自肌套血管；前者是通过出鳃静脉和外套静脉分别将鳃前部和后部的血液送回心耳，而后者的外套静脉与外入鳃血管不通，鳃中的血液只能通过出鳃静脉回到心耳。根据外套腔的形态特点，本文将中国的牡蛎分为三种类型六个组。第一种类型，左右侧都具侧水腔，包括一个组；第二种类型，仅右侧具有侧水腔，包括四个组；第三种类型；不具侧水腔，包括一个组。在比较解剖学研究的基础上，文章还讨论了消化系统，神经系统，循环系统等一些主要系统的演化过程，并推测了现生牡蛎各属间的演化关系。提出了一些新的分类依据，发现了一个具有重要演化意义的单行属种，爪蛎属（Talonostrea），猫爪牡蛎（T. talonata）。澄清了目前世界上在舌骨蛎属（Hyotissa）、拟舌骨蛎属（Parahyotissa）、小蛎属（Saccostrea）和巨蛎属（Crassostrea）分类中的混乱。解决了我国牡蛎分类中存在己久的疑难问题，将己发表的20种牡蛎重新鉴定为15种，即舌骨牡蛎（Hyotissa hyotis），复瓦牡蛎（Parahyotissa imbricata）。中华牡蛎（P. sinensis），鸡冠牡蛎（Lopha cristagalli）。薄片牡蛎（Dendostren folium），缘齿牡蛎（D. cre-nulifera），褶牡蛎（Alectryonella plicatula），猫爪牡蛎（T. talonata），长牡蛎（Crassostrea gigas），近江牡（C. rivularis），拟近江牡蛎（Crassostrea sp.），僧帽牡蛎（Saccostrea cucullata），棘刺牡蛎（S. echinata），鹅掌牡蛎（Planostrea pestigris）和密鳞牡蛎（Ostrea denselamellosa）。它们分别隶属于二个科，曲蛎科（Grypheidae）和牡蛎科（Ostreidae）；四个亚科，强蛎亚科（Pycnodonteinae）。冠蛎亚科（Pycnodonteinae），巨蛎亚科（Lopheinae）和牡蛎亚科（Crassostreinae）。

海湾扇贝超氧化物歧化酶家族基因结构、表达和多态性分析

海湾扇贝Argopecten irradian Lamarck于1982年从美国引种到中国，由于具有较快的生长速度和很高的经济效益，海湾扇贝成为中国最主要的养殖贝类之一。近年来海湾扇贝养殖遇到了死亡率高等问题，深入开展海湾扇贝功能基因的研究，尤其是免疫相关基因及其机制研究并在此基础上寻找扇贝疾病防治的有效方法对海湾扇贝的健康养殖十分重要。 对于贝类免疫系统来说，其血细胞在先天性免疫防御中起着重要的作用。当受到外界病原侵染时，贝类血细胞的一个重要免疫反应就是吞噬作用。在吞噬病原过程中，受到病原侵染的贝类还会产生其他多种免疫反应，这些免疫反应将消耗大量的能量（ATP），产能的呼吸链会加速运转，由此也会引发与呼吸链相耦联的活性氧（ROS）的大量产生。这些活性氧具有极强的反应特性，能破坏病原微生物的结构和功能分子，实现对入侵病原的杀灭。利用活性氧对被吞噬的病原进行杀灭，这是吞噬作用消除病原抵御侵染的重要机制。但由于活性氧分子反应的非特异性，它们也会破坏宿主机体细胞内的功能蛋白分子、不饱和脂肪酸分子和核酸等，对细胞造成严重的伤害，进而导致机体生理机能的损伤和免疫系统的破坏。所以，及时消除病原感染机体内过量产生的ROS，维持相关细胞的正常代谢，对提高机体抵抗力和免疫力具有重要的作用。O2-是生物体内产生的第一种活性氧分子，其他的活性氧分子也是由它衍生而来，消除过量O2-是消除过量活性氧危害的第一步也是关键一步。生物体内，超氧化物歧化酶（SOD）是催化O2-发生歧化反应，消除O2-的关键酶。 首先，本文通过RACE方法获得了海湾扇贝SOD家族全部三种基因的cDNA全长并对其进行了序列的生物信息学分析，海湾扇贝AiCuZnSOD全长cDNA为1047个碱基，其中开放阅读框为459个碱基，编码152个氨基酸，与栉孔扇贝Chlamys farreri的CuZnSOD相似度为77.5%，与长牡蛎Crassostrea gigas的相似度为75%，与人的相似度为74.7%。AiMnSOD全长cDNA为1207个碱基，其中开放阅读框为678个碱基，编码226个氨基酸，序列比对结果发现AiMnSOD的氨基酸序列与虾夷扇贝Mizuhopecten yessoensis和皱纹盘鲍Haliotis discus hannai的相似度分别为85%和78.4%，与哺乳动物相似度也在68%~72%之间。AiECSOD全长cDNA为893个碱基，其中开放阅读框为657个碱基，编码218个氨基酸。AiECSOD与其它物种ECSOD相似度比较低。与线虫Brugia pahangi的相似度为27.9%，与疟蚊Anopheles gambiae的相似度为31.4%，与斑马鱼Danio rerio的相似度为27.8%，与人的相似度也只有28.6%，与同是贝类的长牡蛎ECSOD也只有28.1%的相似性。主要原因是AiECSOD的信号肽和肝磷脂结合区域在各物种中无同源性。 其次，采用qRT-PCR（quantitative real time PCR）方法分析三种SOD基因在不同组织中的表达情况，结果表明三种SOD基因的组织表达有所差异。AiCuZnSOD基因在鳃中表达水平最高，其次是血细胞和性腺，在外套膜、闭壳肌和肝胰脏表达水平较低。AiMnSOD基因在鳃中表达水平最高，其次是外套膜，在血细胞、性腺，而在肝胰脏和闭壳肌表达较弱。AiECSOD基因在血细胞中表达水平最高，其次是肝胰脏，在鳃、闭壳肌表达水平较低，而性腺和外套膜没有检测到。同时，采用qRT-PCR对鳗弧菌Vibrio angullarum感染后海湾扇贝血细胞中三种SOD基因mRNA表达变化进行了检测。AiCuZnSOD表达量在各个时间段没有显著差异(P > 0.05)。AiMnSOD的表达量在1.5 h时略有下降，在3 h时达到最高表达量，是空白组（0h）的3倍(P < 0.01)，从6 h到24 h表达量逐渐下降，24 h时表达量是空白组的1.6倍，24 h到48 h又稍有升高。AiECSOD的表达量在1.5 h时有所下降，是空白组的0.3倍（P < 0.05)，随后逐渐升高，在12 h时达到最高表达量，是空白组（0h）的4.5倍（P < 0.01），从24 h到48 h表达量逐渐下降并恢复到空白组的水平。在对照组，各个时间点没有显著差异（P > 0.05）。在鳗弧菌感染后，海湾扇贝三种SOD的表达并不一致，且差异比较显著。AiCuZnSOD被认为是构成性表达基因，其受外界刺激的影响最小，AiMnSOD和AiECSOD受刺激后表达上调比较明显。 第三，采用Genome-walking的方法得到了海湾扇贝三种SOD基因的基因组全长和近端启动子序列并对其进行了相关分析。AiCuZnSOD的基因组序列全长为4279bp，包含有4个外显子和3个内含子。AiMnSOD的基因组序列全长为10692bp，包含有4个外显子和3个内含子。AiECSOD的基因组序列全长为5276bp，包含有5个外显子和4个内含子。三种基因外显子和内含子的结合处序列遵循-AT/GT-原则。我们把海湾扇贝SOD家族的三个基因的近端启动子进行了比较分析。发现三种SOD在靠近起始密码子的位置都有Oct-1结合位点。三种SOD共有的转录位点有：Oct-1、C/EBPalp、Oct2.1、Sp-1和GATA-1。AiCuZnSOD和AiMnSOD共有的转录位点有：ICSBP、Ftz、TATA-box、C/EBPbeta和Antp。AiCuZnSOD和AiECSOD共有的转录位点有：AP-1和NFκB。AiMnSOD和AiECSOD共有的转录位点有：GR和ER。AiCuZnSOD独有的位点有：SRF、YY-1和NF-1。AiMnSOD独有的位点有：HNF-1、Hb、MEB、NF-muE1、Pit-1a和Eve。AiECSOD独有的位点有：CREB、RATA-alph、Kruppel-like和AP-3。 此外，通过构建原核表达载体，本研究对AiCuZnSOD和AiECSOD基因进行了体外重组表达，并对纯化的重组蛋白进行了酶活分析。酶活分析表明，重组AiCuZnSOD蛋白有较高的酶活和稳定性。 最后，我们对海湾扇贝三种SOD基因的部分区域，包括启动子、编码区，部分内含子区域进行了SNP检测，并对SOD基因部分SNP位点多态性和鳗弧菌敏感性进行了相关分析。三种SOD基因中，我们共发现了59个SNP位点，其中AiECSOD的SNP位点最多，特别是在启动子区，AiCuZnSOD和AiMnSOD多态性较低。其中AiCuZnSOD启动子区的-1739 T-C 位点的基因型和等位基因，AiECSOD启动子区的-498 A-T和-267 G-A等位基因频率，AiECSOD的第一个外显子38 Thr-Lys的多态性在敏感和抗菌群体中存在显著差异（P < 0.05）。

长牡蛎可存活四倍体的诱发机制和异源三倍体的诱发

采用乙酸地衣红染色技术（Acetic orcein staining technique）较系统地研究了长牡蛎 Crassostrea gigas (Thunberg)三倍体产生的卵子在受精且第一极体释放受抑制后的减数分裂过及染色体的分离行为以阐明可存活四倍体的产生体的机制。用浓度为0.5 mg/L的细胞松驰素B （CB）处理受卵以抑制其第一极体的释放。在观察到个别受精卵出现第一极体时开始CB处理，持续至对照组中50％的受精卵出现的第一极体。对处理组和对照组的受精卵从受精后隔5分钟取样一次，用卡诺氏液（Carnoy's fixative, 冰醋酸和甲醇按1：3的体积比充分混合）固家样品。采用0.5%的乙酸－地衣红染料进行受精卵的染色，而后压片观察受精卵染色体行为。长牡蛎三倍体产生的卵子，中期I同源染色体构型呈现单价体（Univalents）,二价体（Bivalents）、三价体（Trivalents）以及大于三价体的多价体（Multivalents）混合出更的特征。在第一极体释放受抑制的受精卵的第二次减数分裂过程中，可确认四种染色体分离类型：三极分离（Tripolar segregation） (54.5%)、联合二极分离（United bipolar segregation） (12%)、独立二级分离（Incomplete united bipolar segregation）(4%)。其余卵子的染色体分离行为（23％）不规律，呈现不同程度的紊乱，但总体看来介于上述四种分离类型之间。此外，某些特定的独立二级也可能是四位体形成的最主要的细胞遗传学体制。此外，某些特定的独立二极分离也可能产生四倍体。轻细胞体驰素B 处理的受精卵的减数分裂过程具有显著的不同步性，表现在三个方面：第一，在两个重复组之间，即两个雌体之间，存在第二次减数分裂的时间进程的不同步性；第二，同一个雌体产生的卵子之间的发育速度不同步性，表现为不同的卵子进入第一次减数分裂的时间不同；第三，同一卵子内的染色体之间，其行为有时存在的不同步性。另外，探讨了中心类在支配第二减数分裂时各种染色体分离行为的可能机制。以长牡蛎二倍体与近江牡蛎二倍体的染交作为对照，探讨了能长牡蛎四倍体与近江牡蛎二倍体杂并诱导异源三倍体的可行性。长牡蛎Crassostrea gigas (Thunberg)四倍体和二倍体与近江牡蛎Crassostrea rivularis (Gould)二倍体的杂交以及相应的对照组共进行了三批重复实验，杂交实验采用高密度的精子。研究结果表明，自交组平均受精率依次为94％（GG）、77％ （RR）,88% （G／GG）和85％ （GG／G）。双方差分析（ANOVA）表明，各自交组之间受精率没有显著差异（F＝3.118, P=0.132）。在杂交组，直接授精后180分钟，尚未观察到受精迹象，因而无法估计受精率。授精后48小时的孵化率各组之间差异很大，并经双方差分析（ANOVA）表明存在显著性差异，（F＝3.188, P=0.018）。其中GGR和RGG组的孵化率相近似，产生的幼虫数量明显少于对照组。在四种类型的杂交实验中，二倍体C. gigas (雌体) ＊ 二倍体 C. rivularis (雌体)（ＧＲ）早最成功的。虽基ＧＲ组幼虫的生长率低于对照组，但其存活率接近于对照组。长牡蛎四倍体与近江牡蛎二倍体杂交组（GR），在授精后两天的孵化率较低，但幼虫的生长状况与对照组接近。另外两个杂交组，即近江牡蛎二倍体与长牡蛎四倍体（RGG），二倍体近江牡蛎江与二倍体长牡蛎（RG），授精后两天的孵化率很低，幼虫生长得缓慢。三个重复组的GR杂交组和一个重复组的GGR杂交组获得稚贝。聚合酶链式反应／限制性酶切片段长度的多态性（PCR／PFLP）检支分析结果证实这些稚贝均是杂交种；流式细胞术分析结果证明GGR获得的稚贝是三倍体，从而证明获得了长牡蛎与近江牡蛎的异源三倍体。有迹象表明三倍体与二倍体杂交种之间（GGR对GR）存在生长上的差异。首先，GGR的眼点幼虫大约比GR组早出现5－7天即仅次于对照组GG，G／GG，和GG／G；第二，尽管仅获得少量GGR幼贝，这些幼贝在授精后90天的大小显著大于GR组的个体。在RGG和RG组中，幼虫没能存活到眼点幼点阶段。细胞学检查结果表明，杂交组的绝大多数卵子发育停滞在第一次减数分裂中期（Metaphase I）,这一过程至少持续到授精后180分钟。仅有2％的GGR 组的卵子在授精后180分钟进入第一次减数分裂后期）（Anaphase I）. 而在此时期，GR，RGG和RG组的卵子中，仍只观察到10第二价体（Bivalents）.

Food sources of three bivalves living in two habitats of Jiaozhou Bay (Qingdao, China): Indicated by lipid biomarkers and stable isotope analysis

Food Sources of three filter-feeding bivalves from two habitats (intertidal oyster Crassostrea gigas, mussel Mytilus galloprovincialis. and subtidal cultured scallop Chlamys farreri) of Jiaozhou Bay (Qingdao,China) were determined by fatty acid and stable isotope in analysis. Cultured scallop was characterized by significant diatom markets such as 16:1/16:0 close to 1 and high ratio of 20:5(n - 3)/22:6(n - 3), hence we assume that the scallop mainly feeds on diatoms. Fatty acid biomarkers specific to bacteria and terrestrial materials were also found in considerable amounts in scallop tissue, which suggested that there were Substantial bacterial and terrestrial input into the food of the species. Intertidal oyster and mussel, however, exhibited significant flagellate marker. 22:6(n - 3). and lower level of diatom markers. which indicated that flagellates are also part of intertidal bivalves' Planktonic food Sources: meanwhile, high level of Chlorophyta fatty acid marker, Sigma 18:2(n - 6) + 18:3(n - 3), suggested that Ulva pertusa (Chlorophyta) seaweed bed supplied important food sources to intertidal bivalves. Additionally, result of stable isotope analysis showed that phytoplankton contributed 86.2 to 89.0% to intertidal bivalves' carbon budget; macroalga U. pertusa origin source had a contribution of MIX, to 11.0%, which indicated its role Lis in important supplemental food source to intertidal bivalves. From this study. it is concluded that the dietary difference of three bivalves probably relates to the different potential food sources in the scallop farm and intertidal zone in Jiaozhou Bay.