中国簇毛黄耆亚属的分类修订和系统位置初探

摘要 "簇毛黄耆亚属隶属于豆科黄耆属，主要分布在青藏高原和横断山区，大多数种类都是狭域分布的。由于缺乏野外工作，标本不够丰富，模式标本不易收集齐全等原因，相当一部分种类的划分尚不能令人满意，应予以修订。除此之外，这个亚属的范围及其系统位置也存在一定的争议，还有待于深入的研究。本文对我国簇毛黄耆亚属的种类进行了分类修订，通过形态学和分子系统学两方面的研究，重新界定了该亚属的范围，并对其系统位置进行了探讨。 1. 分类修订 通过查阅文献，标本室研究与野外观察相结合，对簇毛黄耆亚属形态性状的变异式进行了分析，特别调查了性状在居群中的变异幅度。发现茎和花的长短以及果实的形态等是可靠的分类性状。另外，茎和小叶的被毛状况，小叶和小苞片的形状以及花的颜色等对于亚属下种类的划分也有重要的意义。 本文将7种植物从簇毛黄耆亚属中分出，9种处理为异名，确认中国簇毛黄耆亚属植物有23种。多尼尔黄耆是中国分布新记录种，亚东黄耆和单花黄耆都是该种的异名。狭叶黄耆、芒齿黄耆和丽江黄耆是弯齿黄耆的异名，这些种类中存在的分类困难得到了澄清。本文给出了每一个种的形态描述和标本信息以及亚属内的分种检索表。 2. 微形态学 观察了簇毛黄耆亚属植物花柱的发育过程，发现通常使用的术语“柱头具毛”没有准确地描述其中一部分簇毛黄耆的特征。这些植物的毛只是长在花柱的顶端，柱头是光滑无毛的。除毛被直立且向上指外，其它与花粉刷（pollen brush）相关的特征，在这些植物中也出现。所以，这些簇毛黄耆的花柱及其毛被也应该叫做花粉刷。在山羊豆族中，花粉刷正是区分鱼鳔槐亚族的关键特征。因此，这一构造支持将一部分簇毛黄耆从黄耆属（黄耆亚族）中分出，作为一个属放入鱼鳔槐亚族当中。 3. 叶表皮研究 在光学显微镜下观察了代表簇毛黄耆亚属4个组的11种植物的叶表皮。发现所观察种类都具有两种气孔类型，以无规则型为主，放射状细胞型数量很少。 表皮细胞根据细胞轮廊和垂周壁的情况，可以分为三种类型：一是表皮细胞不规则形，垂周壁波状纹或深波状纹，代表为扁荚组植物;二是表皮细胞为多边形，狭长形为主，垂周壁平直，略有浅波状纹，袋果组植物属于这种类型;三是表皮细胞为多边形，垂周壁平直，属于这种类型的有膨果组和背扁组植物。表皮细胞形状对于亚属范围的确定以及亚属下组的划分有一定的意义。 4. 分子系统学 测定了簇毛黄耆亚属植物的ITS序列，并从Genbank中下载了48个种的ITS序列，包括了黄耆属及其临近12个属的代表。以锦鸡儿属（Caragana）为外类群，进行简约性分析，构建簇毛黄耆亚属与其临近类群的系统发育树状图。结果显示，扁荚组与亚属其余类群在系统树上处于不同的分支，亲缘关系较远，表明包括扁荚组的簇毛黄耆亚属不是一个单系类群;膨果组，背扁组和袋果组的代表作为一个单系类群能得到ITS序列的支持，但它们与鱼鳔槐亚族关系更近。这种分支方式能够得到形态证据的支持，说明一部分簇毛黄耆的确与鱼鳔槐亚族有更近的关系，这些种类的分类位置值得重新考虑。"

七叶树组织及细胞培养产生生育酚的研究

从七叶树（Aesculus Chinensis Bunge）的未成熟的果实的子叶中诱导出愈伤组织;愈伤组织在pH5.8，温度26 ± 1 ℃，加有NAA，TBA，K，CA的MS培养基上生长良好。光对愈伤组织的生长有促进作用，植醇对生长有抑制作用;进行了发酵罐培养。 利用TLC、质谱分离鉴定了γ-生育酚的存在，并利用HPLC、荧光法测定了生育酚的含量。结果表明，愈伤组织中生育酚的含量在3.2～6.6mg/100g干重;光对生育酚的合成有促进作用;植醇是生育酚合成的可能前体;悬浮培养不利于生育酚的合成，培养液中没有发现生育酚的存在。生育酚的合成与组织的生长速率成正相关。

复苏植物牛耳草Boea hygrometrica耐旱复苏过程中LEA基因表达调控及功能研究

本实验室以复苏被子植物旋蒴苣苔（Boea hygrometrica (Bunge) R Br，牛耳草）为实验材料，利用cDNA微阵列技术，筛选到2个LEA蛋白的cDNA片段。它们在干旱条件下表达水平增加一倍以上。在上述基础上，通过5’-RACE的方法扩增得到这两个LEA基因的全长cDNA，BhLEA1和BhLEA2，发现二者编码蛋白均与玄参科复苏植物Craterostigma plantagineum中的第4组LEA蛋白pcCC2具有最高的同源性。PCR扩增得到的基因组序列中发现BhLEA1和BhLEA2在靠近5’端处各有一内含子，分别为97和171bp。利用tail-PCR和inverse-PCR扩增得到BhLEA2的1215bp的启动子序列，其中含ABRE、W-box、HDEs、MYB、MYC、和生长素响应元件等。两个基因在不同胁迫、激素等处理下都有诱导表达。构建过量表达载体, 转化烟草。筛选T2代的纯合体植株进行抗旱试验，测定了干旱过程中的土壤和叶片含水量，PSⅡ最大光化学效率Fv/Fm、SOD和POD酶的活性及蛋白质降解程度，发现BhLEA1和BhLEA2过量表达的烟草抗旱性有明显提高，与野生型相比，叶片含水量和光系统Ⅱ活性下降慢、SOD和POD活性增高、蛋白质降解减少。Western blot检测发现在干旱时，野生型烟草的RbcL、LHCⅡ和PsBO蛋白明显降解，而转基因植物的几乎没有降解，或者降解较少，说明BhLEA的过量表达可以在一定程度上抑制干旱诱导的蛋白质降解。这些结果表明，BhLEA基因可能直接或间接地在牛耳草干旱过程中参与了保护蛋白质的作用，为牛耳草叶片的复苏提供了基础。

梭梭种群分子生态学研究

中国是受沙漠化影响最严重的国家之一。梭梭(Haloxylon ammodendronBunge)是藜科梭梭属多年生小乔木或灌木，作为荒漠地区主要的建群种和优良固沙植物，梭梭在维持荒漠生态系统的结构与功能、防止土地沙漠化、改善小气候方面具有十分重要的作用。近年来，由于不合理地开发利用，大面积的天然梭梭林衰退甚至死亡。然而，我们对于梭梭种群的空间分布和遗传结构所知甚少。本文拟通过对自然梭梭种群的空间格局、遗传结构、遗传结构的空间分布、以及种子种群与地面植被种群的遗传比较的研究，探讨种群的空间结构特征及成因，评价种群遗传多样性水平，了解遗传多样性在种群内、种群间的分布情况以及在空间上的分布格局，预测种群的遗传潜能，并为制定合理的保护、利用策略提供理论依据。 1．对古尔班通古特沙漠东南部地区处于不同演替阶段的四个梭梭种群的分布格局和种群动态进行了考察。结果表明，不同样地中梭梭种群的幼苗（<0.5m）和幼树( 0,5-lm)均呈聚集分布，样地A、B、D中的成熟个体(>1m)也呈聚集分布，样地c中的成熟个体呈随机分布，从整个种群来看，所有梭梭种群均呈聚集分布。种群的龄级结构图表明样地A和c中的梭梭种群表现为稳定型结构，可进行持续更新，虽然样地D中的种群幼苗和幼树数量较少，但这种现象是暂时的，种群仍具有持续更新的能力，样地B中的种群表现为衰退型结构。 2．利用空间自相关分析检测上述四个种群的空间遗传结构，结果表明，四个种群中的成株均无显著的空间自相关。虽然梭梭的种子散布能力有限，但花粉流有可能是空间遗传结构不显著的原因之一;另一个可能的解释是在种群更新和发展过程中，由于种内竞争的增强而发生了自疏现象。 3．利用ISSR标记对新疆和内蒙古境内共9个种群的遗传结构进行研究。8个引物共扩增出219条带，其中184条(84%)具多态性，种群的遗传多样性水平较高，通过AMOVA分析表明大部分遗传多样性分布在种群内，区域间、种群间的遗传变异均很小。梭梭种群较高的遗传多样性水平可能源于对异质、高胁迫环境的长期适应，而种群间遗传分异低的主要原因是种群间存在强大的基因流。 4．对5个梭梭种群的地面植被和种子库的遗传结构进行了比较分析，并调查了其中3个种群地面植被和种子库的空间遗传结构。结果表明，在所有种群中，地面植被和种子库的遗传多样性水平相似，而地面植被的遗传分异高于种子库的遗传分异：二者在遗传结构的空间分布上也不相同，地面植被种群无显著的空间自相关，而种子库种群在第一距离级上( 0-10 m)呈显著正相关。研究结果表明梭梭种群的种子库有能力保持种群的遗传多样性并减弱种群的遗传分化。 5．研究结果建议，由于现存梭梭种群和其潜在种群（种子种群）仍保持了较高的遗传多样性，种群间的基因交换并没有受到阻碍，因此对梭梭的保护可以与生态恢复工作同时进行。在具体工作中，应充分考虑种群的遗传结构特征及其空间格局，选取适合的种群或种子资源进行恢复与重建，并保持一定水平的种群大小，才能实现种群的稳定发展以及在高胁迫环境中的长期存活。 荒漠生态系统植被结构简单，环境压力大，对荒漠地区主要建群种和优势种植物的空间分布和遗传结构进行研究对于探讨在胁迫环境中各种进化力量（如选择、突变、迁移、漂变）的作用机制有重要意义，并为荒漠生态系统的恢复与重建工作提供了有价值的信息。在本文中，对荒漠植物在较大地理范围内的遗传结构研究、通过空间自相关分析进行种群的空间遗传结构研究、地面植被种群与种子库种群在遗传结构、空间遗传结构上的比较研究在国内均为首例。这些研究结果为进一步深入探讨荒漠植物生态适应与进化的分子机制奠定了基础。

复苏植物牛耳草Boea hygrometrica干旱诱导基因的筛选和功能分析

干旱对植物的影响和植物对干旱的反应是十分复杂的，涉及到植物的各种生理活动，由胁迫强度及时间、植物本身的遗传特性、发育阶段和生理状况以及其他环境因子共同决定。现代分子生物学和生物技术的发展深化了对植物逆境反应的研究，对植物抗旱分子反应的研究成为这个领域的热点，也引发了抗逆基因资源的争夺战。 以拟南芥等植物为实验材料的研究对深入了解植物对干旱胁迫感知和反应机制提供了重要信息, 但对植物抗旱机制的了解仍然十分匮乏。其中， 限制人们对抗旱机制深入了解的一个重要因素就是植物抗旱机制的复杂性和多样性，这种抗旱机制的复杂性决定了不是所有的机制都可通过拟南芥等植物来加以揭示。因此利用特殊生境植物来研究相关基因的表达对揭示植物对环境适应机制有着极为重要的价值。 我们实验室以复苏被子植物旋蒴苣苔（Boea hygrometrica (Bunge) R Br.，牛耳草）为实验材料，开展了多方面的工作，以期从复苏植物的角度加深人们对抗旱机制的了解。目前我们实验室已成功地建立了利用cDNA微阵列技术研究牛耳草基因表达谱的体系，并比较了4562个cDNA克隆在干旱前后的表达差异, 发现434个cDNA在干旱条件下表达水平增加一倍以上。 本工作是在上述工作的基础上，对这些表达差异的cDNA克隆并测序，利用Northern blot进一步验证这些基因。序列分析表明，这434个cDNA片段实际上代表着42个基因。根据序列同源性分析表明其中36个克隆与已知功能的基因具有同源性，它们分别是细胞壁相关基因、LEA基因和糖类、抗氧化酶类的编码基因等。另外，4个克隆未能找到同源序列，这可能意味着它们是一些新基因；2个克隆虽找到同源基因但功能未知。36个克隆中有3个编码的是细胞壁相关基因，它们在干旱早期就被诱导，而编码LEA蛋白的基因在干旱中期或后期大量诱导，这说明牛耳草耐旱反应的启动是程序化的，随干旱时间的延长和程度的加强，一步步地启动相应的基因来发挥作用，多方面地对植物细胞进行保护和修复。 本实验室的前期工作表明牛耳草脱水复水过程中细胞超微结构分发生了明显变化，其中细胞壁脱水时发生折叠复水时恢复原状。鉴于细胞壁如此显著的变化及其重要作用，我们以两个细胞壁相关的基因BhGRP1和BhGLP1为对象，对其表达的时间空间特点和对不同胁迫信号的应答、编码产物的理化性质、过量表达或抑制表达的转基因植物的表现型及转基因植物对不同逆境胁迫的抗/感性状等方面的进行研究，综合分析其在耐旱反应中可能参与的代谢途径或信号途径，以期为揭示牛耳草耐旱复苏机制提供有力的佐证。 我们利用Northern blot和半定量RT-PCR对两基因进行了表达模式分析，发现BhGRP1在干旱早期被诱导，干旱后期其转录本水平下降。而BhGLP1在早期诱导后一直保持高的表达。两者在不同胁迫、激素等处理下都有不同的响应。经PSORT分析两基因编码的蛋白都具有N-端信号肽，意味着两蛋白定位于胞外基质。构建BhGRP1-GFP和BhGLP1-GFP融合蛋白进行亚细胞定位分析，质壁分离后BhGRP1-GFP的信号仅保留在细胞壁，而BhGLP1-GFP则在胞壁胞膜上都存在。过量表达BhGRP1后发现它能赋予植物更强的耐旱复苏能力及机械强度，而抑制GLP表达的植株的抗旱性明显弱于野生型，表明BhGRP1和BhGLP1与牛耳草的耐旱复苏有密切的关系。

文冠果种皮中的香豆素类化合物及抗HIV-1活性研究

利用多种分离技术对文冠果种皮甲醇提取物的乙酸乙酯和正丁醇萃取部分进行分离纯化,根据理化性质和光谱数据鉴定结构,得到3个香豆素类化合物Ⅰ(臭矢菜素B)、Ⅱ(秦皮素)、Ⅲ(秦皮苷),其中化合物Ⅰ为首次从无患子科中分离得到,Ⅱ、Ⅲ为首次从文冠果种皮中分离得到.通过对HIV-1ⅢB诱导感染C8166细胞致细胞病变的抑制试验及对HIV-1ⅢB感染MT4细胞的保护试验进行抗HIV-1活性研究,结果表明,化合物Ⅰ具有较强的体外抗HIV-1活性,CC50＞200 μg/mL,EC50为8.61～12.76 μg/mL,选择指数(SI)＞15.67～23.23;对HIV-1ⅢB感染的MT4细胞具有一定的保护作用.

栽培措施与文冠果结实性关系的研究

文冠果（Xanthoceras sorbifolia Bunge）是我国北方特有的木本油料树种，已被列为生物质能源树种之一。现阶段产量低是限制其发展的重要因素。结合目前文冠果生产发展的实际需要，有必要通过实践探讨出一套经济、简单易行的栽培措施，指导文冠果的高产优质栽培管理。本文以内蒙古翁牛特旗文冠果经济林场内40年生文冠果树为研究对象，对文冠果生物学、生态学特性进行定位观测和试验，研究了文冠果物候与积温的关系；野外布置不同管理措施的正交试验设计，测定了不同管理措施下文冠果产量和年生长周期内叶片矿质元素（N、P、K、Mg、Fe、Zn、Cu、Mn）的含量变化趋势，并对数据进行了分析。初步确定了文冠果物候与矿质养分动态变化、栽培管理措施与产量以及叶片养分含量之间的关系，为提高文冠果的产量、制定合理栽培管理措施提供一定理论依据，也为文冠果的进一步开发利用打下基础。 主要结论： 1.文冠果年生长周期内物候变化与积温呈显著对数函数关系，可以预测文冠果年生长发育期有效积温的理论值，也可以根据实际有效积温预测文冠果物候变化进程； 2.文冠果叶片中矿质元素变化与物候期有密切联系，大量元素间存在协同关系，水肥管理对叶片中矿质元素的变化有很大影响； 3.施肥和浇水均可提高文冠果果实产量，水肥耦合措施提高产量尤为显著：与对照相比，5月初一次浇水、施肥270g/株可使产量提高303%。

文冠果壳苷提取工艺的研究

文冠果为我国独有的油料树种，研究发现，文冠果壳乙醇提取物具有良好的促智作用，文冠果壳苷（Xanthoceracide）为齐墩果烷型五环三萜皂苷，是文冠果壳乙醇提取物中活性最强的物质。大量的药效学实验证明其具有显著改善多种记忆障碍模型小鼠的学习能力，提高大脑的缺氧耐受能力，预防并治疗多发性栓塞引起的记忆保持障碍，降低谷氨酸造成的PC12细胞死亡数量，增强对神经细胞的保护作用；数例临床试验中，一些记忆力严重减退导致生活不能自理的老年人以及智力低下的儿童服用文冠果壳提取物或文冠果壳苷后，也有明显的康复效果或治疗效果；而急性毒性试验进一步证实，这些天然产物毒性低，仅仅1/50的LD50用量就能表现出明显的改善记忆障碍作用，这预示着文冠果壳乙醇提取物将有可能开发成有效的老年痴呆症特效药。 本研究采用薄层层析法（TLC）对文冠果壳提取物中的文冠果壳苷进行定性鉴别。显色剂为10%硫酸乙醇，操作方法简便，斑点清晰，Rf适中，重现性良好。采用分光光度法对文冠果壳总皂苷含量进行测定。用文冠果壳苷作为对照品，测定波长为546 nm，文冠果壳苷含量在0.004 mg·mL-1~0.02 mg·mL-1（r=0.9998）呈现良好的线性关系，方法检验合格。采用高效液相色谱法（HPLC）对文冠果壳苷进行含量测定，文冠果壳苷含量在0.02 mg·mL-1~0.2 mg·mL-1（r=0.9992）范围内线性关系良好，方法检验合格。 采用溶剂提取法，大孔吸附树脂分离，有机溶剂萃取，硅胶柱层析分离，结晶与重结晶等方法相结合，得到纯度达98.5%的文冠果壳苷，可作标准品为开发利用文冠果壳提供依据。 以出膏率和文冠果壳苷含量为考察指标，分别考察提取次数、提取温度、乙醇浓度、料液比以及提取时间等因素对提取效果的影响。采用正交试验优化文冠果壳苷的溶剂提取工艺，最终确定提取工艺为：用70%乙醇提取，料液比为1/7（W／V），提取时间为5 h，提取温度为60 ℃，提取次数为2次。采用中试放大试验验证该工艺条件，结果表明，该提取工艺简单，易操作，提取效果较好，具有较好的应用前景。

水肥措施对文冠果叶片、果实养分分配的影响

文冠果（Xanthoceras sorbifolia Bunge）是我国北方特有的木本油料树种，已被列为生物质能源树种之一。现阶段产量低是限制其发展的重要因素。本文以内蒙古赤峰市翁牛特旗文冠果经济林场内50年生文冠果树为研究对象，对文冠果生物学、生态学特性进行定位观测和试验，分析了文冠果发育节律与积温的关系。野外布置水肥措施试验，测定了文冠果产量和叶片、果实养分元素（N、P、K、Mg、Ca、Fe、Zn、Cu、Mn）的含量，分析了水肥措施对叶片、果实养分分配的影响。 主要结论： 1.文冠果物候期与积温呈显著的直线函数关系。能够用来预测文冠果年生长发育期有效积温的理论值，为经营管理提供依据。 2.文冠果叶片中主要元素含量随物候期的变化呈下降趋势，但微量元素呈增加趋势。养分重吸收水平由大到小的顺序是：Mg>N>K>P，一定的水肥措施提高了文冠果养分再吸收水平，并降低了功能叶中的N/P、C/N。 3.文冠果果实中Ca和Fe随物候期的变化呈下降趋势，其他元素呈先减后增趋势。水肥措施降低了果实对养分元素的分配和收获系数；提高了养分利用效率。 4.合理的水肥措施能显著提高种子产量，增加含油率。最佳水肥措施为：5月初灌水50mm，施肥量为N 63 g•株-1、P2O5 83.3 g•株-1，于5、7月初分2次等量施入。 5.水分、P是文冠果生长的主要限制性因子，限制性因子具有阶段性。水分对肥效有“激发效应”。

文冠果（Xanthoceras sorbifolia）

本文对中国特有植物文冠果（Xanthoceras sorbifolia Bunge）种仁油中脂肪酸的组成及结构进行了深入的探讨。应用远端化学修饰新技术，将混合脂肪酸制备成2－烃基取代－4，4－二甲基噁唑啉衍生物的混合物，用气相色谱－质谱－计算机联用仪，结合尿素包合法对混合脂肪酸衍生物进行分析，鉴定了十二种脂肪酸组分的结构，确定了不饱和酸的双键位置。基保三种脂肪酸首次被确存在于文冠果油中，即甘碳二烯－11，14－酸，甘四碳烯－15－酸和甘四碳烷酸（木焦油酸）。本文对衍生物制备的分馏催化法和简单回流法进行了比较，肯定了后者的可行性可靠性。

黄土丘陵区翻白草光合特性的研究

对典型草原云雾山保护区退耕6 a,11 a(放牧8 a)和16 a的3个退耕地和4个封育草地(百里香群落、铁杆蒿群落、大针茅群落和长芒草群落)对照坡耕地表层土壤的水分特征曲线数学模型、持水参数和比水容量进行了测定。结果表明,封育草地的持水和供水性能要大于退耕地和坡耕地,放牧对退耕11 a的持水和供水性能有较大影响。云雾山自然保护区坡地退耕和草地封育后,样地土壤的持水能力大小顺序为封育长芒草群落>大针茅群落>百里香群落>铁杆蒿群落>退耕16 a>退耕6 a>坡耕地>退耕11 a(放牧8 a)。供水能力大小顺序为封育长芒草群落>百里香群落>铁杆蒿群落>大针茅群落>退耕16 a>退耕6 a>退耕11 a(放牧8 a)>坡耕地。这说明土壤持水和供水性能随着退耕年限的增加和封育草地的正向植被演替均逐渐增强的趋势。坡地退耕和草地封育能够通过改善土壤的水分物理性质提高土壤的蓄水持水性能和抗侵蚀能力。

黑边假龙胆的胚胎学研究

系统报道黑边假龙胆（Gentianella azurea (Bunge) Holub）的胚胎发育过程，用以讨论假龙胆属长期存在争议的分类和系统发育问题。黑边假龙胆花药４室；药壁发育属双子叶型；绒毡层单型起源，细胞单核，属腺质绒毡层；花药壁表皮层宿存，药室内壁减缩。小抱子母细胞减数分裂为同时型，四分体的排列为四面体型；成熟花粉３－细胞型。子房为２心应，１室，减编的侧膜胎座，胚珠４列。薄珠心，单珠被，横生胚珠，大抱子母细胞减数分裂形成的４个大抱呈直列式排列，其中合点端的大抱子具功能。胚囊发育为蓼型。珠心冠原存在。极核在受精前融合为次生核，反足细胞宿存、分裂为８～１２个、每个细胞均多核和异常膨大，反足细胞形成的吸器明显。雄蕊先熟。异花传粉，珠孔受精。花粉管进入胚囊时不破坏助细胞，助细胞宿存；一个精核和次生核的融合几乎发生在另一个精核和卵细胞核融合的同时。受精作用属于有丝分裂前配子体融合类型。胚乳为核型，胚乳核分裂同步，每核含２～３个核仁。胚胎发育为茄型酸浆Ⅰ变型。成熟种子中胚只发育至球形胚阶段。反足细胞在合子分裂之后才开始退化；在胚的发育过程中反足细胞在胚乳层之外形成一层染色深类似“外胚乳”的结构。和龙胆属比较，假龙胆属具有如下不同的特征：绒毡层单型起源，典型的腺质绒毡层，无“类胎座”和“横格”，单层；减缩侧墨胎座，胚珠4列，横生胚珠；珠心冠原存在；反足细胞异常膨大，形成内多倍体和多核，并在胚乳核之外形成一层类似“外胚乳”的结构；花粉管进入胚囊时不破坏助细胞；胚胎发育为茄型酸浆Ⅰ变型等。胚胎学研究结果表明假龙胆与龙胆属的亲缘关系较远，分类等级上作为一独立的属较合适，在系统位置上它与龙胆属可能不在同一条进化线上。