青花菜原生质体培养和根癌农杆菌介导的遗传转化

从4-5天龄青花菜(Brassica oleracea var���italica)下胚轴游离原生质体，经纯化后培养在简化的KMsP培养基上，原生质体分裂形成了细胞团;同时，对影响外源DNA导入子叶和下胚轴原生质体后瞬间表达强度的若干因素作了较详细的研究，这些因素包括转化介质中二价阳离子的种类和浓度、PEG溶液的浓度以及PEG溶液的pH值， 为进一步进行原生质体水平上的细胞遗传转化创造了条件。 以青花菜(Brassica oleracea var���italica)子叶和下胚轴为外植体材料，进行了根癌农杆菌介导的遗传转化研究。在建立了子叶和下胚轴外植体组织培养的高频率植株再生系统的基础上，用携带有双元载体质粒的根癌农杆菌(Asrobacterium,tumefaciens)A208sE感染青花菜子叶和下胚轴，对根癌农杆菌的感染过程以及影响抗性芽分化频率的诸多因素作了详细研究，再生了具有卡那霉素抗性的完整转化植株。Dot Blot分析表明NPTⅡ酶活性的存在;以pROA93经EcoRI /HindⅢ酶切产生的gus基因片段(约2.6Kb)为探针进行Southern Blot分子杂交，结果表明gus基因已整合到植物细胞基因组中，并且得到了表达。

甘蓝(Brassica oleracea L. var. capitata L.)富集铊的环境地球化学研究

通过对甘蓝进行品种差异、亚细胞分析、根际分泌物提取污染土壤中的铊、营养元素添加以及野外甘蓝样品采集分析，结合地球化学理论。分析了甘蓝对铊吸收富集的机理，并得出以下几点结论： (1) 甘蓝叶、根及茎对铊的吸收存在着明显差异，表明在面临土壤铊胁迫时，叶是铊的主要储存部位，而根和茎主要起到了转运作用。甘蓝中铊含量的升高导致了对钙和镁吸收能力的提高。不同品种甘蓝之间的吸收能力差别不大，通过选择种植对铊吸收能力小的甘蓝来控制铊的食物链危害是不可行的。此外，还应该避免在高铊土壤地区种植甘蓝。 (2) 高达92%的铊存在于甘蓝叶细胞液组分中，表明细胞液组分是铊在甘蓝叶细胞中的一个重要储存部位。但是在不同品种甘蓝叶中，铊的亚细胞分布形态没有显著差异，在甘蓝面对铊胁迫时，其叶细胞器组分中铊含量始终维持很低的含量。甘蓝对铊的解毒机制很可能就是通过在细胞内的区隔化作用(compartmentalization)，把进入体内的铊结合到细胞液组分以及细胞壁上，从而减少了铊对重要细胞器官的损伤。铊在甘蓝叶各亚细胞组分中的分配与常量元素存在一定的关系。在甘蓝叶细胞内，Tl+往细胞液组分中的传输很有可能是通过Na+/K+/2Cl–联合传输机制、Ca2+活化的钾离子通道以及一些需Mg2+或Mn2+的K+活化酶完成的。需要Mn2+参与的K+活化酶可能对于铊往细胞器中的转移起到了主导作用。在细胞壁中，很可能Ca2+活化的K+通道或者是某些特定的需要Mn2+的K+活化酶对铊的迁移或固定起了影响作用。 (3) 随着氮、磷、钾营养元素的加入，甘蓝地上部的生物量有一定程度的上升。影响主次因素依次均为氮>磷>钾。随着氮、磷、钾营养元素的加入，甘蓝地上部和地下部的铊含量并没有上升，而是有一定程度的下降。甘蓝地上部中铊含量的影响主次因素依次为磷>氮>钾，甘蓝地下部中铊含量的影响主次因素依次为氮>磷>钾。氮、磷、钾营养元素的加入都提高了甘蓝对铊的吸收量。甘蓝对铊吸收量的影响主次因素依次均为氮>磷>钾。因此我们认为，氮，磷，钾的加入显著提高了甘蓝生物量和铊的吸收量，但是随之而来的生物稀释效应，导致了甘蓝地上部和地下部含量的降低。运用铊累积量来判断营养元素对甘蓝吸收铊的影响更为客观和可靠。 (4) 通过对比蒸馏水和根际分泌物提取液对污染土壤中铊的提取能力，发现甘蓝根际分泌物提取液(root exudates)对污染土壤中的铊具有明显的活化作用。提取液的pH和土壤铊的提取率存在一定的正相关(R2=0.1659)，也就是说提取液的pH与其对污染土壤中铊的提取能力成正比。但是甘蓝体内各部分铊含量与其根际分泌物提取液对土壤铊的提取率没有任何关系，表明大量的植物非必需元素铊进入甘蓝后，并没有对其根际分泌物的产生任何影响。土壤pH越高，生长的甘蓝的根际分泌物提取液对土壤提取率就越高，甘蓝分泌物提取液对铊的提取率升高可以补偿由于土壤pH升高而造成的水溶态存在的铊减少。 (5) 铊在甘蓝叶片和叶柄中的分布状况为老叶叶片>新叶叶片>老叶叶柄>新叶叶柄，表明叶柄也是运输铊的一个重要器官。但是叶柄对铊的转运能力并没有茎那么强烈，而叶片才是甘蓝中最主要的铊储存部位。铊在根、茎、老叶和新叶中亚细胞的分布均为细胞液>>细胞壁>细胞器，这和前期室内温室培养甘蓝叶片中的分布结果是一致的。根据植物采矿经济理论的计算结果，很显然甘蓝可以成为土壤铊污染的植物修复和采矿的备选对象。

甘蓝型油菜（Brassica napus L.）花粉和柱头的发育及其与自交不亲和性的关系

作者用扫描电镜、透射电镜和组织化学方法研究了甘蓝型油菜(Brassica napus L．)花粉和柱头的发育及相互作用,得到了如下结果： 一．甘蓝型油菜具有典型的同型孢子体自交不亲和性(Homomorphic and sporophytic self-incompatibility)。自花授粉后，部分花粉粘住在乳突细胞表面，随后萌发出花粉管，花粉管生长受阻于乳突细胞，花粉管表现出各种异常形态，缠绕卷曲(Coiled pattern),顶端膨大成基足状(pad-Like swelling),花粉管二叉分枝（dichotomous branching Pollen tubes），花粉管相互连接(connections of pollen tubes），有的花粉粒还形成两个花粉管。 二．不同时期的乳突细胞的扫描电镜观察表明： 开花前6—7天 乳突细胞壁内陷，柱头中央有一沟槽; 开花前4—5天 乳突细胞被有孔的块状物覆盖; 开花前2—3天 覆盖物消失，壁表面只剩下波状纹或小凹; 开花前l - 2天 乳突细胞充分吸水膨胀，呈指状，排列疏松，细胞壁上有一些小颗粒。此时的乳突细胞已发育成熟。 三.不亲和授粉时，花粉和乳突细胞均有强烈的胼胝质荧光。 四.乳突细胞的组织化学特点：缺乏淀粉积累，细胞壁和细胞质中有过氧化物酶活性。 五.乳突细胞的超微结构特点：细胞壁分为三层，蜡质层、角质层和纤维素层。粗面内质网成群分布在细胞壁附近，并以及泡形式向细胞壁分泌物质。缺乏质体，细胞核位于乳突细胞基部，细胞中央为大液泡占据。 六.花粉的超微结构发育特点：单核花粉已发育出内壁和外壁，外壁内层不明显。细胞核位于中央。细胞质浓厚，缺乏层膜结构而积累大量淀粉粒的质体存在于细胞质中。其他细胞器不发达。两细胞花粉时期，花粉壁接受乌氏体转运的孢粉素和含油体转运的脂类物质。生殖细胞没有壁，悬浮在营养细胞的细胞质中。细胞核大，细胞质稀薄，只有一些嵴不明显的线粒体。营养细胞的核显著，细胞质浓厚，线粒体发达，质体内部的淀粉消失，转变成嗜饿小体。内质网短而粗，遍布于细胞质中，高尔基体缺乏。 七.绒毡层积极参与了花粉外壁的建成。首先，它通过分泌作用把物质（可能是蛋白质）转移到单核花粉的腔隙中或在它后期滚解后，由分布在二细胞花粉间的粗面内质网合成蛋白质，转移到花粉壁内。其次，绒毡层细胞的质体层膜形成许多造油小体，至二胞花粉时，造油小体进入壁的柱状层，参与花粉鞘形成。第三，绒毡层细胞形成许多乌氏体，花粉发育后期，乌氏体与花粉外壁接触，将孢粉素转移到花粉外壁上。