荧光原位杂交技术对土壤石油降解菌的检测

微生物修复是石油污染土壤修复的主要方法之一，但是对修复过程中微生物的检测却是其主要限制因素，传统的检测方法存在很大的局限性，而荧光原位杂交技术结合了分子生物学的精确性和显微镜的可视化信息，可较为精确快速的对微生物进行定性和定量测定。 实验中利用辽河油田污染土壤中筛选纯化的高效石油降解菌，以原油为碳源，考察不同菌株处理后的去除率变化。发现有8株菌：B101、B381、B0502、B25 、B64、B2001、B2003、B18，在14 d内对石油的降解率都在20%以上，且族组分分析结果显示，被降解部分主要是烷烃和芳烃。经鉴定，此8株菌均为杆菌。 同时，对5株石油降解菌标准菌株（铜绿假单胞菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌）在基因库中比对，核苷酸同源性显示其相似性均在98%以上，因此针对其16S rRNA设计寡核苷酸探针。 将上述5种探针应用于荧光原位杂交实验，分别作用于8株降解菌和5株标准菌株，得出5种探针均符合特异性标准，仅地衣芽孢杆菌探针与B381之间有特异性荧光反应。添加B381（地衣芽孢杆菌）于泥浆反应器中降解石油烃。鉴于石油污染土壤的复杂组成，检测泥浆反应器中地衣芽孢杆菌的FISH条件优化结果为：样品固定时间17 h，杂交温度46 ℃，杂交时间3 h，杂交液中去离子甲酰胺浓度35%，冲洗缓冲液中与去离子甲酰胺对应的NaCl的浓度88 mmol∙L-1。运用上述FISH技术监测生物泥浆反应器中地衣芽孢杆菌量的变化，得出地衣芽孢杆菌的浓度在第5天达到最大，同时对泥浆反应器中去除率进行测定，前5天菌对原油的去除速率也最高，前8 d是石油烃被去除的主要作用阶段。微生物的数量变化和原油的去除率进行比较，两者的变化情况符合微生物降解石油的趋势，为监测含油污泥中微生物的变化提供了一种可行的技术。