金环蛇蛇毒丝氨酸蛋白酶抑制剂和三种胡蜂蜂毒的研究

蛇毒和蜂毒是提供药理学活性分子的丰富来源，它们富含肽和蛋白，包括一 些酶类和毒素。 丝氨酸蛋白酶抑制剂广泛存在于动物、植物和微生物体内，参与许多重要的 生理过程，如血液凝集、纤维蛋白溶解、细胞凋亡、发育以及炎症反应和补体活 化等（van Gent D. et al., 2003）。通过凝胶过滤、离子交换和反向高压液相色谱， 我们从金环蛇毒液中纯化得到一种天然的丝氨酸蛋白酶抑制剂，命名为 bungaruskunin。并且从该蛇的毒腺cDNA 文库中克隆到了它的核苷酸序列。 bungaruskunin 预测的前体由83 个氨基酸组成，包括含有24 个氨基酸的信号肽 和含有59 个氨基酸的成熟肽。它与一种由红腹伊澳蛇（Pseudechis porphyriacus） 的cDNA 预测到的丝氨酸蛋白酶抑制剂blackelin 具有最大相似性，达64％。 Bungaruskunin 是一种Kunitz 型的蛋白酶抑制剂，具有一个保守的Kunitz 结构域， 能够抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶。通过对金环蛇毒腺cDNA 文库 的筛选，我们还得到了另外两条β-bungarotoxin B 链，Bungaruskunin 的整体结 构与β-bungarotoxin B 链相似，特别是它们都具有高度保守的信号肽序列。这些 发现强烈地表明蛇毒Kunitz/BPTI 蛋白酶抑制剂与神经毒性的类似物可能起源于 共同的祖先。 肥大细胞脱粒肽是从膜翅目昆虫的毒液中鉴别出的一个小肽家族，是一种具 有潜在的药物治疗作用的诱导活性分子（Xueqing Xu et al., 2006）。来源于蜂类的 缓激肽样的类似物vespakinin 家族是一种具有调节和激素功能的活性成分，与哺 乳动物和两栖动物的缓激肽类似（Nakajima T., 1984）。本研究对三种胡蜂的 毒液进行了一系列的活性检测，发现黑尾胡蜂的蜂毒对白色念珠菌Candida albicans 和金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 有抑制作用。凹纹胡蜂和黑尾 胡蜂的蜂毒具有微弱的磷酯酶A2 活性。通过凝胶过滤和反向高压液相色谱，没 有得到相关的活性组分。通过对三种胡蜂毒腺cDNA 文库的筛选，我们得到了2 条来源于黑尾胡蜂的核苷酸序列，Blast 分析表明，其中一条编码类似肥大细胞 脱粒肽，但未克隆到全长，序列比对结果显示其与来源于大胡蜂（Vespa magnifica） 的Mastoparan-like peptide 12c precursor（GenBank accession A0SPI0）的核苷酸序 列相似性达98％（Xueqing Xu et al., 2006）；另一条编码缓激肽类似物，命名为 Hw-bradykinin，序列比对结果显示其与来源于大胡蜂（Vespa magnifica）的 vespakinin-M precursor（GenBank accessionABG75944）的核苷酸相似率达96% (Zouhong Zhou et al., 2006)。

菜花烙铁头蛇毒金属蛋白酶的研究

本论文结合生物化学与分子生物学手段对云南产菜花烙铁头蛇毒（几互刃eresrs户厂由刀打）的金属蛋白酶进行了系统深入的研究。从中分离纯化到两个新的蛇毒金属蛋白酶：二型蛇毒金属蛋白酶Jerdonit认和三型蛇毒金属蛋白酶jerdohagin。采用又卫PCR的方法得到了两个cDNA。通过蛋白质胰蛋白酶水解的内肚测序分析，其中一条为编码Jerdo址tin的，cDNA。序列分析发现，另外一条是一个含有RTS短链去整合素cDNA序列，命名为jerdos七atin，并对其进行了表达和活性鉴定。，Jerdonitin是一个表观分子量为为kDa的单链蛋白。它的c砚认全长1578bP，由金属蛋白酶、间隔区和去整合素区组成，说明它是二型蛇毒金属蛋白酶。但是与其它二型蛇毒金属蛋白酶不同的是，Jerdonitin的成熟蛋白由金属蛋白酶和去整合素结构域组成。与其它二型相比，Jerdonitin"多了两个半肤氨酸的（CysZ19andCys238）分别位于间隔区和去整合素区，Cys219可能和后面去整合素区的自由半眺氨酸残基Cys238形成一对二硫键，这对二硫键可能阻止了在后翻译加工过程中去整合素区的释放。通过Jerdonitin和其它二型蛇毒金属蛋白酶氨基酸序列比较和进化分析，结合天然蛋白结构数据，说明Jerdonitin是二型蛇毒金属蛋白酶的一个新亚型。和其它蛇毒金属蛋白酶一样，Jerdon九in是a一纤溶酶，并且它的活性都能被金属鳌合剂EDTA完全抑制，而不受丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF影响。像其独特的结构一样，Jerdonitin不仅具有纤维蛋白原降解的蛇毒金属蛋白酶活性，而且也有抑制ADP诱导的血小板聚集的非酶活性。Jerdohagin是一个表观分子量为96kDa单链蛋白。测定其内肤发现它有金属蛋白酶、去整合素样和富含半耽氨酸区组成，说明jerdohagig是三型蛇毒金属蛋白酶。像其它典型的蛇毒金属蛋白酶一样，jerdohagin的出血活性能完全被EDTA抑制，而不受R涯SF的影响。Jerdohagin是仪纤溶酶专一酶切人纤维蛋白原的。链。用氧化的胰岛素B链作底物，它可以水解仰r16一Leu17肤键。有趣的是，jerdohagin不激活人凝血酶原，但是它酶切人凝血酶原和凝血酶原激活后产生的激活片段F1。Jerdostotin的cDNA全长邹3bp，由信号肚、前肤和去整合素三个区组成，其与。btustotin和vieris七atin有较高的相似性（80％）。jerdostatin的序列是第一个报道的短链去整合素的cD以序列，它的产生机制和aCostatin一a有相似之处。值得注意的是，jerdostatin和obtus七atin八ipris，tatin不同的氨基酸残基（8／9）主要分布在含有整合素识别区的C末端。采用硫氧还蛋·白作为融合蛋白表达jerdostatin：，表达纯化后发现有两个j．erdostatin表达，，命名为：jerdo就。tin一1和'rjerdostotin一2。质谱分析显示它们的八个半肤氨酸都参与形成了四对二硫键，它俩可能是分别含有天然和非天然二硫键结构的多肚。但是jerdostatin一1的活性比rjerdostat还一2高两个数量级。和含有KTS的去整合素一样，重组jerdos七atin的异构体都选择性抑制整合素。lpl结合胶原IV，rjerdost就in一1的抑制活性分别是。b加stotin和viperistotill的1／1时和1／2500。氨基酸残基的组成不同尽管没有影响jerdost就in对整合素alpl的抑制选择性，但是它造成的化学环境不同可能导致抑制活性的差异。

圆斑蝰蛇毒磷脂酶A_2蛋白活性表现和分子进化探讨及菜花烙铁头、烙铁头蛇毒中Jerdonase、TmF的研究

磷脂酶AZ（PLA2）是蛇毒中含量较为丰富的一类作用于梭酷键的酶。迄今为止，己有多种形式的PLA2从不同地域、不同种属的蛇毒中得以纯化并进行了较为系统的研究。其中，以VipoXin为代表的异二聚体形式PLA2较为引人注目，原因在于这种形式不同于此类蛋白家族中的诸多其它个体。目前，己经有许多关于此异二聚体PL凡生物学特性的报道，包括对此类形式存在原因、活性变化、结构表现、系统进化等方面的讨论。然而至今，这种以异二聚体形式存在的PLA2仅发现于几种蛙亚科（ViperinaeSubfamily）蛇种的蛇毒中，其中就包括我国台湾岛的圆斑蜂蛇台湾亚种（Doboiarusselliiformosensis），而蝮亚科（CrotaiinaeSubfamil）蛇种的蛇毒至今却没有此类报道。我国大陆西南端接壤东南亚，存在于云南、福建一带的圆斑蛙蛇隶属圆斑蛙蛇泰国亚种（Daboiarusselliisiamensis），那么这种蛇毒中是否也含有异二聚体形式的PLA2呢？本工作就此疑问对云南产圆斑蛙蛇泰国亚种（D.r.siamensis）蛇毒中的PLA2进行了研究，结果得到三个新的PLAZ，分别命名为DRS-PLA2-I、DRS-PLA2-II和DRS-PLA2-III。其中，DRS-PLA2-I的分子量为13864.06Da，理论pI为4.56，PLA2活性为12.35μmol/mg/min；DRS-PLA2-II的分子量为13635.99Da，理论pI为8.74，PLA2活性为8.76μmol／mg/min；DRS-PLA2-III的分子量为13619.80Da，理论厂为4.61，无PLA2活性。这三个蛋白酶N端的30个氨基酸残基恰好和三个阳性克隆的cDNA序列推导的蛋白序列吻合，结合已经报道的PLA2蛋白家族蛋白序列的保守性表现，我们可以断定它们之间存在对应关系。分子系统学分析表明DRS-PLA2-II和DRS-PLA2-III在进化关系上和蛙亚科的异二聚体PLA2关系较近，并且二者酶活性分别与异二聚体PLA2的Normalchain和Inhibitorchain相一致，只是没有发现类似Vipoxin形式的异二聚体结合蛋白。这些分析表明DRS-PLA2-nORS-PLA2-III类似圆斑蛙蛇台湾亚种（D.r.forlnos翻s沽）中的PV-4/RV-7，是PLA2异二聚体的一种特殊形式，在进化上滞后于VinOXin。另夕卜本工作还相继从云南产菜花烙铁头（Trimeresrusjerdonii）蛇毒和湖南产烙铁头（Trimeresurusmucrosquamatus）蛇毒中分离得到Jerdonase和TmF。前者为一个丝氨酸蛋白酶性质的、具有纤维蛋白原水解作用和激肤释放酶原水解作用双重活性表现的、高分子量的份五brinogenase，其活性表现可以被PMSF彻底抑制，而EDTA对此却没有影响。其它的几种抑制剂如大豆胰蛋白酶抑制剂、l-cysteine、DTT对Jerdonase的活性表现也有不同程度的影响。在Jerdonase的这些生化特性上中，分子量的大小和对纤维蛋白酶水解的特性这两方面有别于蛇毒中诸多其它来源的同类蛋白；后者T淤为一个舒缓激肚增强肤（BradykninPQtentiatingPePtide，BPP），电离质谱分析表明其分子量为1110.7Da。此小肚氨基酸序列为促进舒缓激肚（Bradki垃n，BK）诱导的豚鼠回肠纵行肌收缩的活力单位为（1.13±0.3）（m留L），T妊抑制血管紧张素转化酶（ACE）对BK水解的半数抑制剂量IC50为2μg。比较已报道的从Agkistrodon属和Bothrops属中纯化得到的BPP氨基酸序列发现：BPP的N端都是特征性的pGlu，C端为IIe-Pro-Pro，有高度的保守性。另外，TmF是Trimeresurus属中此类小肤的首次纯化。总之，本研究对国产的几种常见蛇毒中的几种常见蛋白多肤进行了一定程度的探讨和分析，和相同类别的其它蛋白、多肤比较可以看到，有许多相同的地方，也有许多不同的表现，研究结果为相应领域的深入研究提供资料和思路。

菜花烙铁头蛇毒去整合素的纯化、克隆及活性研究

蛇毒去整合素蛋白（disintegrin）家族一般具有分子量低、富含半胧氨酸和含有RGD三肽等结构特点，因其能与配基竞争结合细胞表面的整合素受体，干扰整合素的正常功能而呈现出多方面的生物学活性，如抑制血小板聚集、抑制肿瘤转移和诱导细胞凋亡等。本论文用凝胶过滤、反向高压液相等层析技术从我国云南产菜花烙铁头（Trimeresurusjerdonii）蛇毒中分离纯化到两个新的去整合素蛋白，分别命名为jerdonin和Jerdonatin。MALDI-TOF-MS测定jerdonin分子量为7483Da，jerdonatin分子量为80llDa，二者均属第二类去整合素。分别测定了其N末端25个氨基酸序列，发现与其它蛇毒来源的去整合素具有很高的相似性。提取菜花烙铁头毒腺总mRNA，通过反转录PCR（RT-PCR）扩增到两个去整合素cDNA序列，分别命名为TJDIS-1和TJDIS-2。TJDIS-1全长1528bp，TJDIS-2全长16O3bp，二者均包含编码信号肚区、前肤区、金属蛋白酶区、间隔肤区和去整合素区一属于P一H型金属蛋白酶家族。经推导的氨基酸序列和MALDI一TOF一MS分析，可确定TJDIS-1去整合素区编码jerdonin，TJDIS-2去整合素区编码jerdonotin。jerdonin全长71个氨基酸，jerdonatin全长72个氨基酸，二者均含12个半眺氨酸，且在C末端附近均含有去整合素家族的典型特征三肤序列一RGD。氨基酸序列比较分析显示，jerdon加与来源于侏响尾蛇（Sistrurusm.tergeminus）的去整合素tergeminin序列相似性最高，为82.2％。而jertionatin与来源于黄绿烙铁头（Trimeresurusflavoviridis）的去整合素CTF-I序列相似性最高，为97.2％，仅在RGD附近有两个氨基酸不同。jerdonin与jerdonatin序列相似性为67.6％。本论文还研究了jedonin和jerdonatin的生物学活性。二者均能强烈抑制ADP、胶原、凝血酶诱导的人血小板的聚集，IC50为100-300nM。jerdonin和jerdonatin还能够抑制B16肿瘤细胞增生，研究表明，jerdonin不仅能显著抑制肿块的生长，还能延长荷瘤小鼠的寿命。平均肿块体积由对照的5260．33枷，降低至2086.65mm3，小鼠平均寿命由对照的24.8天延长至30.5天，提高了22.98％。本论文也研究了jerdonin和jedonatin对小鼠精卵受精过程的影响，结果表明jordonotin能够呈剂量关系抑制精卵结合，但对精卵融合无影响。当jerdonatin用量为10.0μg／毗时，单个卵子的精子结合数由对照的95.31降为21.83。菜花烙铁头蛇毒去整合素蛋白的结构和活性鉴定，为去整合素家族的生物多样性研究提供了丰富的素材，同时也为血栓、肿瘤、生殖等生理或病理过程的研究提供了一个有力的工具。

烙铁头蛇毒C-型凝集素样蛋白的生物活性及其作用机制研究

蛇毒C一型凝集素样蛋白一般是由两个相似亚基组成的异构二聚体或由多个异构二聚体组成的多聚体。烙铁头蛇毒血小板活化素TMVA是一个高分子量的C一型凝集素样蛋白。本文研究了烙铁头蛇毒C一型凝聚素样蛋白的生物活性及其作用机制。同时还从烙铁头蛇毒中分离到一个抗凝蛋白（mucroqucetin）。TMVA呈量效关系地诱导P好和洗涤血小板聚集，提示其活化血小板并不调节v从下或不依赖于vWF。抗人血小板糖蛋白（GP）Ib单克隆抗体HIPI呈剂量依赖性特异性抑制TMVA诱导的血小板聚集。抗人GPllb单克隆抗体PZ也抑制血小板聚集。单克隆抗体和流式细胞术分析显示，FITC一TMVA特异性地、剂量依赖性地结合到福尔马林固定的人血小板上，在FIIC-TMVA4O砚浓度时达到饱和性结合状态，这种结合被HIPI特异性地抑制，并呈剂量依赖性。TMVA不结合血小板GPIX、GPllb、GPllla、GPIa、GPlla和GPIV。Mocarhagin仅能部分阻断TMVA诱导的血小板聚集，然而TMVA却能诱导mocarhagin阻断的血小板聚集。以上结果显示TMVA在GPIbQ上的主要受体位于富含亮氨酸第二次重复区氨基酸残基59一81，除此之外，TMVA可能还有其他结合位点。小鼠体内首次给予TMVA后，在短时间内（15min-30min）引起循环血小板数及网织血小板百分率暂时性减低、血小板膜表面P-seleetin的表达暂时性增加，但循环血液中血小板一白细胞复合物未增加；抗鼠血小板单克隆抗体P一selectin、GPllb、GPlll。免疫组化染色显示脾和肺的组织巨噬细胞呈阴性反应，提示TMVA导致循环血小板减少不是巨噬细胞系统对血小板的清除所致。可能是由于TMVA．通过GPIb活化血小板后使P-selectin暴露于胞浆膜表面，这些脱颗粒的血小板在补体的参与下自身溶破，而导致快速的暂时性血小板减少。给予TMVA．后组织病理学显示，肝、脾、肺、肾、胰、大肠及小肠血管未血栓形成；TMVA不影响内源性和外源性凝血系统；TMVA呈剂量依赖性延长小鼠的出血时间，但在TMvA25p眺g时小鼠的出血时间未延长、仍小于5分钟，是一个安全的剂量。以上结果充分证明TMVA具有体内抗血栓作用，血小板自身溶破导致血小板减少在体内抗血栓中可能也起到重要的作用。体内外实验显示TMVA在动物体内外都具有抗补体活性作用。TMVA上调血小板上DAF和CD59的表达，不同程度地上调白细胞上D胚和CDS夕的表达。TMVA在补体系统中的作用可能与其在异种器宫移植中抗IIAR的发生相关。Mucroqucetin是一个由Q链和p链组成的异二聚体蛋白质，其分子量为25KD。。N一末端氨基酸序列与其它该类蛇毒C一型凝集素样蛋白有很高的同源性。Mucroqucetin呈量效关系延长部分凝血活酶时间（APTT），几乎不影响凝血酶原时间（PT）。因子IX和X的抑制试验显示，该纯化蛋白呈量效关系抑制工X因子的凝血活性，不影响X因子，提示mucroqucetin的抗凝活性主要通过结合FIX而实现，是一个血液凝固IX因子结合蛋白。

五步蛇出血毒结构和功能的研究

通过Sephadex-G-100分子筛层析，QAE-Sephadex-A-50阴离子交换层析和两次Poly-buffer-exchanger离子交换层析，分得两个出血毒蛋白，分别称之为HF-1和HF-2。通过碱性PAGE，等电聚焦（IEF），SDS-PAGE和线性密度梯度PAGE，证实两出血蛋白为电泳均一。它们均为三聚体蛋白，分别含有三个相同亚基。HF-1含3 x 113个氨基酸位点，而HF-2含3 x 104个氨基酸位点。EDTA可抑制两者的活性，而碘代乙酸部份抑制HF-2的活性而不抑制HF-1的活性。从氨基酸组成分析发现，HF-1不含有Cys，而HF-1的激光喇曼光谱也没有Cys的特征峰，这在出血毒中是少见的。HF-1和HF-2均属#alpha#－纤溶酶类，同时兼有出血活性和蛋白水解酶活性。还实验了出血HF-2对血小板聚焦的抑制活性，证实HF-2抑制血小板聚集依赖于其对血浆纤原的降解。

Mass spectrometry study on snake venoms and enzymes

In this paper, three kinds of snake venoms and lour kinds of enzymes (phospholipase A(2), fibrinolytic enzyme, arginine esterase and L-amino acid oxidase) isolated from the snake venom were analyzed. As the snake venom was different, the MALDI/TOF/MS showed difference, The MALDI/TOF/MS determination results could be affected Ly the concentrations of snake venom enzymes, And the mechanisms of desorption and ionization was also given in this study, By using MALDI/TOF/MS we obtained the accurate molecular weights and homogeneities of the enzymes. The apparent characteristics of the positive MALDI/TOF/MS of enzymes composed by two subunits were also given out, The results showed that MALDI/TOF/MS is an effective analytic method for discovering new components from snake venom complexes. And it is reliable to use this method to determine the molecular weights and purifies of protein molecules.

水母刺丝囊毒素的提取，溶血活性和毒性的研究

本文研究了水母毒性细胞—刺丝囊的性质、刺丝囊毒素的提取及刺丝囊毒素的溶血活性和毒性等方面的内容。 通过显微镜、扫描电镜及透射电镜分别对霞水母、海蜇、沙蜇触手中所含刺丝囊的形态特点进行了分析，发现三种水母触手中含有不同形状和大小的刺丝囊。应用珠磨式组织研磨器破碎刺丝囊，可有效提取刺丝囊毒素。 霞水母刺丝囊毒素具有明显的溶血活性。4-37°C范围内毒素的溶血活性与温度变化密切相关。毒素溶血活性对pH敏感。胰蛋白酶和鞘磷脂能明显抑制毒素的溶血活性。毒素的溶血活性具有二价金属离子依赖性，Ca2+可能是毒素溶血活性的重要活化剂。EDTA，NaCl及GSH对毒素的溶血活性具有稳定作用。 水母刺丝囊毒素与触手中提取的毒素含有明显不同的蛋白组成，刺丝囊毒素的溶血活性强于触手中提取的毒素。 霞水母刺丝囊毒素表现出明显的神经毒性作用。毒素对草鱼的毒性具有剂量依赖性。霞水母刺丝囊毒素的致死毒性对热的稳定性要比已报道的其它水母毒素强。毒性对pH敏感，胰蛋白酶对毒素的毒性具有明显的抑制作用。毒素的毒性在-80°C稳定。通过DEAE-Sepharose Fast Flow和Sephadex G-100分离霞水母刺丝囊毒素，主要得到两条蛋白谱带，分子量分别为60kDa和47kDa。毒素中的溶血活性成分不具有致死毒性。

Studies on the hemolytic activity of tentacle extracts of jellyfish Rhopilema esculentum Kishinouye: Application of orthogonal test

The present work is first reporting the hemolytic activity of venom from jellyfish Rhopilema esculentum Kishinouye extracted by different phosphate buffer solutions and incubated at different temperature according to the orthogonal test L6(1) x 3(6). Of the seven controllable independent variables, incubated temperature and phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) had strongest effect on the hemolytic activity. (c) 2006 Elsevier B.V. All rights reserved.