种子超干保存种质的研究

当今，生物资源——“物种”正在以地质史上前所未有的速度灭绝或走向濒危。保护生物多样性已是世界范围内环境保护和生物学研究的热点。基于种子具有完善的保护结构和内潜的隐蔽生命以适应逆境的微妙机制，种子库被认为是保护植物种质资源的主要措施。现阶段世界各国的种子库均为低温库或超低温库，可观的建库投资和运转费用的经济负担直接影响到贫困国家和地区植物种质资源及时有效的保护，寻求取代低温库的廉价贮藏种子的策略和技术已列为联合国FAO／IBPGR的全球战略措施。 此乃本文的工作背景和最终目标。早期的研究已查明，通过降低种子含水量可以在适当提高温度的条件下达到在较高含水量在低温下同样的贮藏效果，但是由于干燥技术以及5%为种子安全含水量下限这一经典概念的局限，种子贮藏的含水量一直没有突破5%下限。超干贮藏即以此为依据，摸索以适当的干燥技术将种子含水量降至这一经典下限以下，即采取超低含水量种子密封贮藏的方法，以达到部分或完全取代低温库的目的。 作为种子贮藏的方法首先要保证种子活力的保持。本文选用了不同化学组份以及不同粒度大小的种子为材料，涉及到40个不同的种和品种，针对不同类型的种子摸索了适宜的干燥方法及辅助措施，从种子生活力和活力、细胞形态结构、细胞器发育和功能以及若干生理活性指标等多元角度上确认种子含水量可以安全降至5%以下，除了个别敏感类型种子外，在常温条件下能大幅度增强种子的耐藏性。 本文对种子耐干性差异以及辅助干燥措施提高种子耐干性进行了水分热力学方面的分析，认为种子本身的特性决定了种子内部水分吸附位点对关键水分束缚力量的不同，导致在相同干燥过程中失去关键性水分程度的不同，从而造成种子在耐干程度上有所差异。干燥的辅助措施可以通过改变种子中的化学成份增强种子对关键性水分吸附的力量，继而使得关键性水分不会轻易丢失。超干延缓种子劣变的原因在于，MC不能真实反映种子水分水平，一定MC范围内的超干种子的关键性水分仍然存在，即使在极度干燥的种子中，虽然一部分束缚水已失去，但对导致和抑制脂质过氧化的正负效应折衷的结果使劣变反应从整体上还是受到抑制。内源抗氧剂的活性及含量以及劣变产物MDA的积累量表明种子在超干贮藏过程中脂质过氧化被部分抑制，酶类抗氧剂系统保存完好，非酶类抗氧剂被消耗的量减少，使得种子在结束贮藏进入萌发状态时仍具有较高水平的自由基清除系统的正常运转能力。无氧贮藏，和外源抗氧防护等预处理措施使种子在超干贮藏过程中能更好地清除活性氧的伤害，吸湿回干、PEG等处理使超于种子吸胀时膜系统功能及结构更具完整性。回水预处理诱导的生化修补效应可保留于种子内部，以便在种子再次吸水时及早发挥作用。本文已在干前及干后预处理辅助措施上找到了若干行之有效的方法，其中有些是首次应用于种子技术范畴。 本文在总结系列试验研究结果和纵观近年来国内外在此领域的动态后，认为一般常规型种子在适度超低水分状态下不仅自身不受脂质过氧化的危害，并能保持种子内外形态学和种质遗传性的完整性，而且可使种子内部代谢停顿，更有利于耐藏性的大幅度提高，加上超干技术上的不断完善，为今后建立节能种子库展示了希望。

转Rubisco 活化酶大型同工酶基因(rca)水稻的光合作用特性研究

Rubisco 是催化光合暗反应第一步反应的酶，是唯一能将CO2 转变成碳水化合物的酶，由它固定和最后转化成的碳水化合物提供了植物、动物和微生物的食物和能量。但是，Rubisco 催化该反应的效率十分低，使之成为光合作用的限速步骤。由于Rubisco 的合成和催化过程十分复杂，人们很难通过直接改造Rubisco 提高植物固定CO2 的能力。而Rubisco 活化酶能活化Rubisco，使植物在生理CO2 浓度下具有最大的CO2 同化速率，因此研究活化酶有重要意义。水稻活化酶有2 个同工酶，大型同工酶比小型同工酶C 端多37 个氨基酸，其中包括两个Cys 残基。这两个Cys 残基的存在使活化酶大型同工酶对ADP 的存在更加敏感，其活性在硫氧还蛋白的介导下能被基质中氧化还原状态的变化所调节。由于活化酶大型同工酶对调节Rubisco 的活性具有的这种特殊作用，在本研究中，将活化酶大型同工酶rca基因用正义和反义引入水稻基因组，获得了过量表达活化酶大型同工酶基因和反义抑制活化酶基因表达的转基因植株，对其光合作用进行了生理和生化分析。 本研究的主要结果如下： Rubisco 活化酶大型同工酶基因的克隆：从水稻镇恢249 中克隆了1525 bp 的活化酶大型同工酶cDNA 序列。经过测序，它与报道的粳稻品种活化酶大型同工酶cDNA 序列（rca）完全相同。 构建了4 个植物表达载体：3 个为过量表达rca的载体，分别是pCBUbirca，pCBSrca 和 pCBSUbirca ，其中rca分别在水稻中高效表达的玉米Ubiquitin 启动子、受光调控的Rubisco 小亚基基因启动子和由这两个启动子构成的双启动子控制下表达; 1 个在Ubiquitin 启动子控制的反义rca载体，即 pCBUbi-antirca。 获得了转化rca的水稻再生植株：用日本晴，台北309，武育梗7 号和籼稻品种培矮64S 水稻成熟种子诱导愈伤组织。用改良的农杆菌浸染法将rca基因转化这些愈伤组织，在潮霉素筛选压力下获得抗性愈伤组织，经过2 天的干燥处理后，转入到含山梨醇的高渗分化培养基上培养，能迅速获得大量的芽和转化体再生植株。 获得了转rca基因的水稻植株：抗性愈伤组织和再生水稻幼苗的叶片经GUS 染色呈蓝黑色。PCR 扩增转基因水稻基因组内的潮霉素基因和rca，大部分转基因水稻中含有841 bp 的潮霉素基因片段和1525 bp 长的rca cDNA 片段。251 粒T1 代转基因水稻种子中189粒呈现潮霉素抗性，抗性种子/非抗性种子的比率约为3：1，接近孟德尔分离规律。Southern杂交表明rca序列已整合到水稻基因组，一般含1－2个拷贝。Western 杂交显示Rubisco 活化酶含量在转pCBUbi －antirca 的水稻中和对照比，几乎看不出，被反义抑制;转pCBUbirca 的水稻与对照含量相差无几;转pCBSUbirca，pCBSrca 载体的水稻中活化酶的含量比对照有极显著的增加。 T1 代转rca水稻的光合作用发生显著变化：转pCBSrca 和pCBSUbirca 的水稻在饱和光强下的Rubisco 初始活性、羧化效率、光合速率都明显高于对照，但是表观量子效率、色素含量和Rubisco 总活性与对照相似。两者相比，前者比后者更高;转反义rca（pCBUbi-antirca）基因的水稻饱和光强下的光合速率、表观量子效率、羧化效率、Rubisco 初始活性明显降低，色素含量和Rubisco 总活性基本不变;转pCBUbirca 的水稻中，光合作用的各项参数与对照基本相似。 T1 代转rca水稻的叶绿素荧光明显改变：转pCBSrca 和pCBSUbirca 的水稻ΦPSII 的值明显高于对照，而且前者qP 的值明显高于对照。两者相比，前者的ΦPSII 和qP 的值比后者高;转反义rca的水稻ΦPSII，F′v/F′m，qP 值和对照比都明显降低，但qN 的值升高;转pCBUbirca 载体的水稻中，叶绿素荧光的各项参数与对照基本相似。 转rca基因的水稻生长发育的变化：转pCBUbirca 载体的水稻整个生长发育过程与对照相似;转化pCBSrca 和pCBSUbirca 载体的水稻和对照比，植株高大，生长发育速度加快，抽穗、开花和结籽的时间提前。两者本身相比，前者比后者明显;转反义rca（pCBUbi-antirca）基因的水稻生长发育延迟，植株矮小，种子败育。 由上可见，Rubisco 活化酶大型同工酶rca基因在Rubisco 小亚基基因启动子、Ubiquitin 基因启动子和Rubisco 小亚基基因启动子共同控制下正义转入水稻的转基因植物光合作用的参数最好，光合效率提高，植物表型最好，生长发育加快，提前开花结籽。这一研究可能为获得高光合效率和高产量的水稻奠定了基础。

Radical Scavenging and Antimicrobial Activities of Methanol Extracts of Two Kinds of Formicary

对两种不同的蚂蚁窝进行甲醇提取,并对提取物进行了急性毒性、抗自由基,酚含量、还原能力和抗菌活性的检测。二苯基三硝基肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基的清除能力的检测表明:两种蚂蚁窝甲醇提取物都具有显著的自由基清除能力,并呈现出剂量依赖性,而且,在高浓度时(5~10mg·mL-1),它们的自由基清除能力甚至显著地高于二丁基羟基甲苯(butylated hydroxyl toluene,BHT)。酚的含量和还原能力分别用福林酚试剂和铁氰化钾还原反应来测定,统计分析显示两种蚂蚁窝的抗氧化能力和其酚含量、还原能力都存在着正相关。两种蚂蚁窝甲醇提取物都具有抗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的活性,但它们却对真菌没有作用。

Frog albumin is expressed in skin and characterized as a novel potent trypsin inhibitor

A novel potent trypsin inhibitor was purified and characterized from frog Bombina maxima skin. A full-length cDNA encoding the protein was obtained from a cDNA library constructed from the skin. Sequence analysis established that the protein actually comprises three conserved albumin domains. B. maxima serum albumin was subsequently purified, and its coding cDNA was further obtained by PCR-based cloning from the frog liver. Only two amino acid variations were found in the albumin sequences from the skin and the serum. However, the skin protein is distinct from the serum protein by binding of a haem b (0.95 mol/mol protein). Different from bovine serum albumin, B. maxima albumin potently inhibited trypsin. It bound tightly with trypsin in a 1: 1 molar ratio. The equilibrium dissociation constants (K-D) obtained for the skin and the serum proteins were 1.92 x 10(-9) M and 1.55 x 10(-9) M, respectively. B. maxima albumin formed a noncovalent complex with trypsin through an exposed loop formed by a disulfide bond (Cys(53)-Cys(62)), which comprises the scissile bond Arg(58)(P-1)-His(59)(P-1'). No inhibitory effects on thrombin, chymotrypsin, elastase, and subtilisin were observed under the assay conditions. Immunohistochemical study showed that B. maxima albumin is widely distributed around the membranes of epithelial layer cells and within the stratum spongiosum of dermis in the skin, suggesting that it plays important roles in skin physiological functions, such as water economy, metabolite exchange, and osmoregulation.

Maximin 9, a novel free thiol containing antimicrobial peptide with antimycoplasma activity from frog Bombina maxima

Amphibian skin is a rich resource of antimicrobial peptides, like maximins and maximin Hs from frog Bombina maxima. Novel cDNA clones encoding a precursor protein, which comprises a novel maximin peptide (maximin 9) and reported maximin H3, were isolated from two constructed skin cDNA libraries of B. maxima. The predicted primary structure of maximin 9 is GIGRKFLGGVKTTFRCGVKDFASKHLY-NH2. A surprising substitution is at position 16, with a free cysteine in maximin 9 rather than usual conserved glycine in other reported maximins. Maximin 9, the homodimer form and its Cys(16) to Gly(16) mutant were synthesized and their antimicrobial activities were evaluated. Unlike previously reported maximin 3, the tested bacterial and fungal strains were resistant to maximin 9, its homodimer and the Cys(16) to Gly(16) mutant (with MICs > 100 mu M). On the other hand, interestingly, while eight clinical Mollicutes strains were generally resistant to maximin 9 homodimer and its Cys(16) to Gly(16) mutant, most of them are sensitive to maximin 9 at a peptide concentration of 30 mu M, especially in the presence of dithiothreitol. These results indicate that the presence of a reactive Cys residue in maximin 9 is important for its antimycoplasma activity. The diversity of antimicrobial peptide cDNA structures encountered in B. maxima skin cDNA libraries and the antimicrobial specificity differences of the peptides may reflect well the species' adaptation to the unique microbial environments. (c) 2005 Federation of European Biochemical Societies. Published by Elsevier B.V. All rights reserved.

饱食因子及其制备方法和其基因

本发明涉及一种饱食因子及其制备方法和其基因，属于生物医学领域。该饱食因子为从中国两栖类动物大蹼铃蟾(Bombina maxima)皮肤分泌物中分离得到的由28个氨基酸组成的一种单链多肽，分子量3229.57，等电点7.7，多肽氨基酸全序列一级结构为：Asp Met Tyr Glu Ile Lys Gln Tyr Lys The Ala HisGly Arg Pro Pro Ile Cys Ala Pro Gly Glu Gln Cys Pro Ile Trp Val-AMIDATION。制备方法是收集大蹼铃蟾皮肤分泌物，离心去除沉淀、冷冻干燥后，经凝胶过滤、离子交换柱层析、高压液相反相柱层析分离纯化后即得到。编码饱食因子的基因由1041个核苷酸组成，其中编码成熟饱食因子为第835-918位核苷酸。具有抑制进食，增强缓激肽生物效应的作用，作为制备肥胖症治疗药物，心血管系统疾病治疗药物的应用。

血管收缩因子及其制备方法和在制药中的应用

本发明涉及一种血管收缩因子及其制备方法和在制药中的应用，属于生物医学领域。该血管收缩因子是从中国两栖类动物大蹼铃蟾皮肤中分离得到的分子量为65KDa由3条肽链组成的蛋白质，包括2条相同的轻链和1条重链，轻链的分子量为16KDa，重链的分子量为33KDa，等电点6.2，糖含量17-19％。血管收缩因子轻链的N-端20个氨基酸序列结构是：Phe Ser Asp Leu Gln IleGly Ser Leu Lys Cys Ala Val Ala Ala Tyr Asp Gln Gly Ala；重链的N-端封闭。其制备方法是收集大蹼铃蟾皮肤匀浆液或者皮肤分泌物，离心去除沉淀、收集上清液冷冻干燥，经离子交换，凝胶过滤纯化即可得到。该血管收缩因子具有强烈收缩血管，诱导血小板聚集的活性，可作为制备心血管疾病治疗药物和诊断试剂的应用。

无指盘臭蛙抗菌肽及其应用

本发明涉及一种无指盘臭蛙抗菌肽及其应用，属于生物医学领域。无指盘臭蛙抗菌肽是从两栖类无指盘臭蛙分泌液中分离得到的一种环状多肽，分子量为 1705.3道尔顿，等电点为9.39，多肽全序列一级结构为：Leu Lys Gly Cys Trp The Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe(LKGCWTKSIPPKPCF)，第四位和第十四位的的半胱氨酸形成分子内二硫键。其制备方法是：乙醚刺激无指盘臭蛙收集的分泌液离心去除沉淀，冷冻干燥后经凝胶过滤柱层析和反相高压液相色谱后分离纯化后得到。本发明的无指盘臭蛙抗菌肽具有对细菌、真菌、病毒有强烈活性抑制作用，及无溶血活性的优点，可作为制备治疗病原微生物感染疾病药物的应用。

一种新型环状小肽BA及其应用

本发明涉及一种新型环状小肽BA及其应用，属于生物医学技术领域。本发明的环状小肽BA，分子量1259.56道尔顿，等电点4.44，具有一定的丝氨酸蛋白酶抑制剂活性，无酶活性。其全序列为：Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys(CWTKSIPPKPC)，第1位半胱氨酸和第11位的半胱氨酸形成分子内二硫键。该环状小肽BA作为药物设计模版及作为制备治疗肿瘤药物的应用。以环状小肽BA作为模版，在其氨基端和羰基端分别进行不同氨基酸的增加，得到具有抗菌活性或丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的环状小肽BA1和环状小肽BA2，并作为制备治疗肿瘤、胃炎、胰腺炎药物的应用。本发明还具有序列简单、合成方便等优点。

无指盘臭蛙蛙皮肽及其基因和在制药中的应用

本发明涉及一种无指盘臭蛙蛙皮肽及其基因和在制药中的应用，属于生物医学领域。该活性多肽是中国两栖类动物无指盘臭蛙基因编码的一种单链多肽，分子量3355.95道尔顿，等电点10.14，多肽全序列一级结构为： Gly Leu Gly Gly Ala Lys Lys Asn Phe Ile Ile Ala Ala Asn Lys Thr Ala Pro Gln Ser Val Lys Lys Thr Phe Ser Cys Lys Leu Tyr Asn Gly。编码无指盘臭蛙蛙皮肽的基因由 731个核苷酸组成，其中编码成熟无指盘臭蛙蛙皮肽为第520-616位核苷酸。人工合成的无指盘臭蛙蛙皮肽具有显著的抑制细菌和真菌生长的作用，可以作为制备病原微生物感染疾病的治疗药物被应用。本发明的无指盘臭蛙蛙皮肽具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广的有益特点。

无指盘臭蛙皮肤活性肽及其基因和在制药中的应用

本发明涉及一种无指盘臭蛙皮肤活性肽及及其基因和在制药中的应用，属于生物医学领域。无指盘臭蛙皮肤活性肽是无指盘臭蛙皮肤活性肽基因编码的一种单链多肽，分子量3015.63道尔顿，等电点10.3，多肽全序列一级结构为： Ala Thr Ala Leu Gly Leu Ser Ser Arg Gly Leu Leu Pro Ile Gly Phe Met Phe Lys Asp Thr Ile Arg Cys Arg Lys Tyr(ATALGLSSRGLLPIGFMFKDTIRCRKY)。编码无指盘臭蛙皮肤活性肽的基因由312个核苷酸组成，其中编码成熟无指盘臭蛙皮肤活性肽为第141-222位核苷酸。人工合成的无指盘臭蛙皮肤活性肽具有很强的抑制细菌和真菌生长的作用，可以作为制备病原微生物感染疾病的治疗药物被应用。无指盘臭蛙皮肤活性肽具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广、抗菌活性强的特点。

无指盘臭蛙免疫调节肽、其基因和变异体及其在制药中的应用

本发明涉及无指盘臭蛙免疫调节肽、基因和变异体及其在制药中的应用，属生物医学技术领域。无指盘臭蛙免疫调节肽是一种环状多肽，分子量1791.12道尔顿，等电点 9.84，无指盘臭蛙免疫调节肽的全序列为：Thr Ser Arg Cys Tyr Ile Gly Tyr Arg Arg Lys Val Val Cys Ser(TSRCYIGYRRKVVCS)，其第4位的半胱氨酸和第14位的半胱氨酸形成分子内二硫键。编码的基因由307个核苷酸组成，其中编码成熟部分的为第 141-186位核苷酸。无指盘臭蛙免疫调节肽原始序列中第4个氨基酸发生替代所产生的变异体，人工合成的无指盘臭蛙免疫调节肽及其变异体具有强烈的免疫调节活性和肿瘤抑制活性，作为制备免疫调节、肿瘤治疗和化疗药物的应用。本发明还具有序列简单、合成方便等优点。

无指盘臭蛙分泌肽及其基因和在制药中的应用

本发明涉及一种无指盘臭蛙分泌肽及其基因和在制药中的应用，属于生物医学领域。该活性多肽是从中国两栖类动物无指盘臭蛙基因编码的一种环状多肽，分子量1587.98道尔顿，等电点9.7，多肽全序列一级结构为： Phe Met Pro Ile Leu Ser Cys Ser Arg Phe Lys Arg Cys，其第七位半胱氨酸和第十三位半胱氨酸相成分子内二硫键。编码无指盘臭蛙分泌肽的基因由300个核苷酸组成，其中编码成熟无指盘臭蛙分泌肽为第138-177位核苷酸。人工合成的无指盘臭蛙分泌肽具有显著的抑制细菌和真菌生长的作用，可以作为制备病原微生物感染疾病的治疗药物被应用。本发明的无指盘臭蛙分泌肽具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广的有益特点。

无指盘臭蛙臭蛙肽及其基因和在制药中的应用

本发明涉及一种无指盘臭蛙臭蛙肽及其基因和在制药中的应用，属于生物医学领域。无指盘臭蛙臭蛙肽是无指盘臭蛙臭蛙肽基因编码的一种单链多肽，分子量1814.11道尔顿，等电点8.08，多肽全序列一级结构为： Gly Cys Ser Arg Trp Ile Ile Gly Ile His Gly Gln Ile Cys Arg Asp。(GCSRWIIGIHGQICRD)。编码无指盘臭蛙臭蛙肽的基因由312个核苷酸组成，其中编码成熟无指盘臭蛙臭蛙肽为第141-189位核苷酸。人工合成的无指盘臭蛙臭蛙肽具有很强的抑制细菌和真菌生长的作用，可以作为制备病原微生物感染疾病的治疗药物被应用。本发明的无指盘臭蛙臭蛙肽具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广、抗菌活性强的特点。

四个烙铁头蛇毒凝集素样蛋白基因的克隆与序列分析

从烙铁头蛇（Trimeresurus mucrosquamatus）的毒腺中提取mRNA，利用RT-PCR进行体外扩增，获得凝集素样蛋白基因，克隆至PMD18-T载体中，筛选出4种凝集素样蛋白基因（命名为TML-1、TML-2、TML-3和TML-4）。由基因序列推导出的氨基酸序列表明：TML-1，2，3，4序列中均有CRD结构。序列同源性比较和Cys位点分析推测：TML-1和TML-2可能分别是类似于flavocetin-A的蛇毒凝集素样蛋白的#alpha#亚基和#beta#亚基；TML-3可能类似于GPIb-bp的蛇毒凝集素样蛋白的#alpha#亚基，TML-4则可能是类似于IX/X-bp的蛇毒凝集素样蛋白的β亚基。