蛇毒Ⅱ类磷脂酶A2 功能分化的分析研究

研究蛇毒Ⅱ类磷脂酶A2 (PLA2 ) 中D49 PLA2 和K49 PLA2 的功能分化及其功能分化决定位点的鉴定。方法: 运 用序列比较分析, 进化树构建和DIVERGE v1104 软件计算研究D49 PLA2 和K49 PLA2 的功能分化情况及其分化位点。结果: 序列比较分析, 进化树构建和DIVERGE v1104 软件计算结果表明蛇毒Ⅱ类PLA2 中D49 PLA2 和K49 PLA2 的确发生了功能分 化, 对于K49 PLA2 来说, 1S , 7K, 11Q , E12 , R34 , T56 , N88 , L92 , E108 , K116 , K128 可能为功能分化决定位点。对于 D49 PLA2 , L2 , G33 , G35 , F46 和Y118 可能为功能分化决定位点。结论: 我们首次通过序列比较分析, 进化树构建和DI2 VERGE v1104 软件计算鉴定出蛇毒Ⅱ类PLA2 中D49 PLA2 和K49 PLA2 可能的功能分化位点, 为今后通过基因重组和定点突 变方法研究蛇毒Ⅱ类PLA2 结构功能关系提供了线索。

眼镜蛇毒神经生长因子对成年猫坐骨神经损伤后的作用

目的　探讨从眼镜蛇毒分离纯化出的神经生长因子(nerve grow th facto r, N GF) 对成年猫坐骨神经 损伤后的影响。方法　制成成年猫坐骨神经损伤模型, 损伤局部注射蛇毒N GF 2 Lgö(kg·d) , 分别治疗10 d 和30 d, 并与对照组(损伤坐骨神经, 不给药物) 比较。结果　术后10 d, 对照组术侧远端神经纤维数量比治疗组明显减少 (P < 0. 01) , 治疗组术侧足底刺激出现早, 肢体活动恢复快。术后30 d, 治疗组术侧远端神经纤维大量再生, 再生神 经纤维数量已明显超过对照组和术后10 d 组水平(P < 0. 01) , 但结构紊乱, 轴突和郎氏结消失。术侧肢体在连续注 射N GF 16 d 左右出现足底刺激反应消失, 肢体瘫痪等改变。结论　眼镜蛇毒N GF 在神经损伤早期应用能减轻神 经纤维发生的溃变, 促进受损神经的再生与功能恢复; 而损伤局部长时间注射蛇毒N GF 则会导致神经纤维增生过 度, 丧失传导功能。

眼镜蛇毒神经生长因子对成年猫坐骨神经损伤治疗效果的实验室观察

目的:探讨从眼镜蛇毒分离纯化出的神经生长因子(nerve growth factor ,NGF) 对成年猫坐 骨经损伤后的影响。方法: 本实验制成成年猫坐骨神经损伤模型, 损伤局部注射蛇毒NGF(2μg/ kg/ d) ,分别治疗10d 和30d ,并与对照组(损伤坐骨神经,不给药物) 比较。结果:眼镜蛇毒NGF 在 神经损伤早期应用能减轻神经纤维发生的溃变,促进神经纤维再生。结论: 损伤局部长时间注射 NGF 会导致神经纤维增生过度,丧失传导功能。

金环蛇毒心脏毒对S180,EAC腹水癌细胞的细胞毒性作用

目的: 探讨金环蛇毒心脏毒对S180, EAC 腹水癌细胞的细胞毒作用。方法: 采用小白鼠腹腔和皮下接种S180, EAC 腹 水癌细胞造成小白鼠腹水模型后腹腔注射金环蛇毒心脏毒。结果: 腹腔注射金环蛇毒心脏毒, 能抑制肿瘤细胞的生长, 降低接 种率。但不能完全控制腹水和癌细胞的生长。体外试验表明有明显的细胞毒作用。台酚蓝染色镜检可见死细胞显著增加, 腹 水图片检查, 给药后细胞膜破裂, 纤维化坏死明显。结论: 能延长小白鼠存活时间。

中华眼镜蛇蛇毒神经生长因子生物活性和理化性质测定

目的：控制中华眼镜蛇蛇毒神经生长因子产品质量，研究其理化性质及生物学活性的定性和定量。方法：通过离子交换色谱、凝胶过滤及FPLC色谱分高纯化得到中华眼镜蛇蛇毒神经生长因子，按国家新药审批有关要求对其进行了SDS－PAGE电泳，N端蛋白质序列规定，HPLC色谱分析，UV光谱图谱扫描，并利用PC12细胞培养法和鸡胚背根神经节培养法检测其生物活性。结果：电泳为一条带，亚基分子量为13500，N端蛋白质序列测定后确证为神经生长因子（NGF），HPLC为单峰，相对百分含量为95％以上，279．6nm处呈现出蛋白质样特征吸收峰。生物活性测定为，PC12细胞培养法灵敏度可达1ng／ml，鸡胚背根神经节培养法需30ng／ml的浓度梯度才能在神经节上有所反应。结论：此实验样品为具有较高生物活性的高纯度NGF多肽。

金环蛇蛇毒对S180, EAC 腹水癌细胞的细胞毒性作用

　目的　探讨金环蛇毒对S180, EAC 腹水癌细胞的细胞毒性作用。　方法　采用小白鼠腹腔和皮下 接种S180, EAC 腹水癌细胞造成小白鼠腹水模型后腹腔注射金环蛇毒。　结果　腹腔注射金环蛇毒, 能 抑制肿瘤细胞的生长, 降低接种率。但不能完全控制腹水和癌细胞的生长。体外试验表明有明显的细胞毒 作用。台酚蓝染色镜检可见死细胞显著增加, 腹水图片检查给药后细胞膜破裂, 纤维化坏死明显。　结论 　能延长小白鼠存活时间。

尖吻蝮蛇毒出血毒素DaHT-3 的红外光谱测定

　目的　观察蛇毒出血毒素结构的变化对功能的影响。　方法　利用傅利叶变换红外光谱仪对尖吻 蝮蛇毒出血毒素(DaHT23) 在溶液中酰胺I 带吸收光谱的研究, 探测了此出血毒素在溶液中的自然构象 和加入EDTA 螯合剂除去金属离子后构象的变化。　结果　此出血毒素在水溶液中的自然构象分别是: A2 螺旋为3118%、B2折叠为5611%、转角为1211%; 而在去除金属离子情况下A2螺旋和B2折叠减少, 转角 和无规卷曲增加, 即加入螯合剂后其A2螺旋、B2折叠、转角和无规卷曲分别变为11%、2614%、4612% 和 1615%。由于结构的变化, 它的出血活性和蛋白水解酶活性均被丧失。　结论　金属离子, 特别是锌离子 在维系蛇毒出血蛋白酶分子中的二级结构中起着很重要的作用。

尖吻蝮蛇蛇毒出血毒素的纯化与部分性质

目的　被尖吻蝮蛇(D ienag k istrod on acu tus) 咬伤会引起严重的出血, 对蛇毒出血毒素的研究有利 于治疗蛇伤出血药物筛选。方法　采用Sephadex G275, DEA E2Sephadex A 250, Sephadex G2200 和两次 PBE 聚焦层析纯化。SDS2PA GE 电泳和等电聚焦电泳测定纯化样品的纯度和等电点。氨基酸组成用自动氨 基酸分析仪测定。以小鼠背部皮下注射部位出血斑的面积来确定最小出血剂量和常规的方法测定酶活性。 结果　从尖吻蝮蛇毒中纯化到一个相对分子量为56 000 的出血毒素(DaHT23) , 经氨基酸组成测定计算, 它由487 个氨基酸残基组成。此成分在SDS2PA GE 上显示出一条均一的蛋白染色带, 其p I 为5150。该出 血成分的最小出血剂量是216Lg, 具有蛋白水解酶活力, 其活力为3168, 但没有精氨酯酶和磷脂酶A 2 活 力。当加入EDTA 螯合剂去除金属离子后, 它们的出血活力和蛋白水解酶活力均丧失。结论　这是从大 陆尖吻蝮蛇毒中获得的一个新的出血金属蛋白酶(DaHT 23)。

Characterization of a new bradykinin-potentiating peptide (TmF) from Trimeresurus mucrosquamatus

A novel bradykinin-potentiating peptide (BPP), designated as TmF, has been purified to homogeneity from the venom of Trimeresurus mucrosquamatus by 70% cold methanol extraction, Sephadex G-15 gel filtration and reverse-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC). The amino acid sequence of TmF was determined to be pGlu-Gly-Arg-Pro-Leu-Gly-Pro-Pro-Ile-Pro-Pro (pGlu denotes pyroglutamic acid), which shared high homology with other BPPs. The molecular mass of TmF was 1.1107 kD as determinated by electrospray ionization-mass spectrometry (ESI-MS), which was in accordance with the calculated value of 1.1106 kD. The potentiating "unit" of TmF to bradykinin-induced (BK-induced) contraction on the guinea-pig ileum in vitro was (1.13 +/- 0.3) unit (mg/L), and TmF (5.0 x 10(-4) mg/kg) increased the pressure-lowering-effect of bradykinin (5.0 x 10(-5) mg/kg) with approximate descent value of (14 +/- 2) mmHg. In addition, TmF inhibited the conversion of angiotensin I to angiotensin 11, 2 x 10(-3) mg of TmF caused 50% inhibition (IC50) of angiotensin-converting enzyme (ACE) hydrolyzing activity to bradykinin.

Improved suppression of circulating complement does not block acute vascular rejection of pig-to-rhesus monkey cardiac transplants

At present, acute vascular rejection (AVR) remains a primary obstacle inhibiting long-term graft survival in the pig-to-non-human primate transplant model. The present study was undertaken to determine whether repetitive injection of low dose Yunnan-cobra venom factor (Y-CVF), a potent complement inhibitor derived from the venom of Naja kaouthia can completely abrogate hemolytic complement activity and subsequently improve the results in a pig-to-rhesus monkey heterotopic heart transplant model. Nine adult rhesus monkeys received a heterotopic heart transplant from wild-type pigs and the recipients were allocated into two groups: group 1 (n = 4) received repetitive injection of low dose Y-CVF until the end of the study and group 2 (n = 5) did not receive Y-CVF. All recipients were treated with cyclosporine A (CsA), cyclophosphamide (CyP) and steroids. Repetitive Y-CVF treatment led to very dramatic fall in CH50 and serum C3 levels (CH50 < 3 units/C3 remained undetectable throughout the experiment) and successfully prevented hyperacute rejection (HAR), while three of five animals in group 2 underwent HAR. However, the continuous suppression of circulating complement did not prevent AVR and the grafts in group 1 survived from 8 to 13 days. Despite undetectable C3 in circulating blood, C3 deposition was present in these grafts. The venular thrombosis was the predominant histopathologic feature of AVR. We conclude that repetitive injection of low dose Y-CVF can be used to continuously suppress circulating complement in a very potent manner and successfully prevent HAR. However, this therapy did not inhibit complement deposition in the graft and failed to prevent AVR. These data suggest that using alternative pig donors [i.e. human decay accelerating factor (hDAF)-transgenic] in combination with the systemic use of complement inhibitors may be necessary to further control complement activation and improve survival in pig-to-non-human primate xenotransplant model.

TMVA, a novel GPIb-binding protein, significantly prevents platelet microthrombi formation and prolongs discordant cardiac xenograft survival

In xenotransplantation, donor endothelium is the first target of immunological attack. Activation of the endothelial cell by preformed natural antibodies leads to platelet binding via the interaction of the glycoprotein (GP) Ib and von Willebrand factor (vWF). TMVA is a novel GPIb-binding protein purified from the venom of Trimeresurus mucrosquamatus. In this study, the inhibitory effect of TMVA on platelet aggregation in rats and the effect on discordant guinea pig-to-rat cardiac xenograft survival were investigated. Three doses (8, 20 or 40 mug/kg) of TMVA were infused intravenously to 30 rats respectively. Platelet aggregation rate was assayed 0.5, 12, and 24 h after TMVA administration. Wister rats underwent guinea pig cardiac cervical heterotopic transplantation using single dosing of TMVA (20 mug/kg, i.v., 0.5 h before reperfusion). Additionally, levels of TXB2 and 6-keto-PGF(1alpha) within rejected graft tissues were determined by radioimmunoassay. Treatment with TMVA at a dose of 20 or 40 mug/kg resulted in complete inhibition of platelet aggregation 0.5 h after TMVA administration. Rats receiving guinea pig cardiac xenografts after TMVA therapy had significantly prolonged xenograft survival. Histologic and immunopathologic analysis of cardiac xenografts in TMVA treatment group showed no intragraft platelet microthrombi formation and fibrin deposition. Additionally, the ratio of 6-keto-PGF(1alpha) to TXB2 in TMVA treatment group was significantly higher than those in control group. We conclude that the use of this novel GPIb-binding protein was very effective in preventing platelet microthrombi formation and fibrin deposition in a guinea pig-to-rat model and resulted in prolongation of xenograft survival. The increased ratio of PGI(2)/TXA(2) in TMVA treatment group may protect xenografts from the endothelial cell activation and contribute to the prolongation of xenograft survival.

蛇毒血管内皮生长因子及丝氨酸蛋白酶类似物的研究

蝰科蛇毒中含有丰富的具有血管通透增强活性的蛋白组分，本论文结合生物化学与分子生物学手段对几种毒蛇的蛇毒血管内皮生长因子进行了研究。其中，从云南产菜花烙铁头（Trimeresurus jerdonii）蛇毒中分离得到一个血管内皮生长因子，TjsvVEGF，并研究了其活性与受体结合特性的关系。同时，对圆斑蝰蛇、蝮蛇、山烙铁头和竹叶青等几种蛇的svVEGFs进行了分子生物学研究。此外，我们还分离到了一个蛇毒丝氨酸蛋白酶类似物,TjsvSPH,还对该蛋白的理化性质进行了初步研究。 TjsvVEGF是一个表观分子量为29 kDa的二聚体蛋白，由两个相同大小的亚基组成。活性实验表明，它在10ng的剂量下即可明显提高血管通透性，活性强度与VEGF165相当。虽然TjsvVEGF的氨基酸序列与TfsvVEGF和Pm-VEGF具有较高的相似性，但是它们的受体结合特性却有很大差异。TjsvVEGF与VEGFR-1的结合能力很弱，而对VEGR-2有很高的亲和力。这说明，TjsvVEGF的活性主要是VEGFR-2介导的。最后，我们对导致TjsvVEGF对VEGFR-1低亲和力的原因进行了探讨。 利用PCR方法，我们从圆斑蝰蛇毒腺中得到了三种svVEGFs蛋白编码区长短不一的cDNA序列，其差异是由cDNA链中一段富含AG（3’拼接接受位点）的区段发生了核苷酸缺失产生的。蛋白编码区核苷酸的缺失导致其编码的三种svVEGF蛋白N末端的氨基酸序列和长短均产生较大差异。因此我们推测，蝰属svVEGFs蛋白N末端普遍较短可能是编码它们的mRNA前体对3’拼接点的不同选择产生的。同时，通过对cDNAs推导的氨基酸序列分析发现，蝮蛇svVEGF和山烙铁头svVEGF在与受体结合相关的多个重要位点上发生了氨基酸替换，提示它们是研究svVEGFs与VEGFR结合机制的良好材料。 通过分子筛、离子交换和亲和层析等方法，我们还从菜花烙铁头蛇毒中得到了一个不具有酶活性的丝氨酸蛋白酶类似物，命名为：TjsvSPH。内肽序列测定结果表明，TjsvSPH三联体结构中的组氨酸已突变为精氨酸，这很可能是导致其失去蛋白水解酶活性的主要原因。活性检测验表明，与许多已发现的蛇毒活性组分不同，TjsvSPH不具有蛋白水解酶活性，不能引起血小板聚集，也不抑制ADP和凝血酶诱导的血小板聚集。它对人血浆的复钙时间也没有影响。TjsvSPH的氨基酸序列与典型蛇毒丝氨酸蛋白酶Halystase和Calobin有约77％的一致性。它与同科属来源的蛇毒丝氨酸蛋白酶类似物氨基酸序列相似性高达92％以上，与不同科属的也有约74％以上的相似性。通过对Genbank中六种毒蛇所有丝氨酸蛋白酶及其类似物进化分析，我们推测，蛇毒丝氨酸蛋白酶类似物很可能是由蛇毒丝氨酸蛋白酶进化而来，并在进化过程中形成了一类独特的蛋白质。

竹叶青蛇毒金属蛋白酶结构与功能的研究

出血性的蝰科蛇毒中含有丰富的蛇毒金属蛋白酶，本论文就竹叶青（Trimeresurus stejnegeri）蛇毒中的蛇毒金属蛋白酶的结构与功能进行研究。我们用生物化学手段从竹叶青（T.stejnegeri）的粗毒中分离纯化得到一个二聚体的P-IIIb亚型蛇毒金属蛋白酶，命名为TSV-DM。同时，用分子生物学方法从竹叶青（T.stejnegeri）的毒腺cDNA文库中克隆得到3个P-III型的蛇毒金属蛋白酶的cDNAs序列， 其中一个编码TSV-DM蛋白前体，另两个编码P-IIIc亚型的出血性蛇毒金属蛋白酶前体，分别命名为stejnihagin-A 和 stejnihagin-B。 经过阴离子层析和肝素亲和层析两步层析方法，我们从竹叶青（T. stejnegeri）蛇毒中分离纯化得到TSV-DM蛋白质，非还原条件下SDS-PAGE电泳表观分子量约110 kDa，还原条件下约为55 kDa。活性检测表明，TSV-DM降解牛纤维蛋白原Aα链快于Bβ链，且呈剂量依赖关系。但不降解明胶，不诱导出血，不具有促凝或者抗凝活性，以及不诱导或者抑制血小板聚集。蛋白质N-末端测序表明TSV-DM的成熟蛋白N-末端封闭。利用肽指纹图谱确证了TSV-DM的编码cDNA。TSV-DM的cDNA序列编码622个氨基酸残基的蛋白前体，包括信号肽、前肽、金属蛋白酶区域、间隔区、去整合素样区域和富含半胱氨酸区域。TSV-DM与其他P-III型蛇毒金属蛋白酶的一级结构序列比对发现TSV-DM和诱导血管内皮细胞凋亡的P-IIIb亚型蛇毒金属蛋白酶具有高度的同源性。但是用人脐带静脉血管内皮细胞系ECV304细胞作为靶细胞检测TSV-DM的诱导血管内皮细胞凋亡活性发现，TSV-DM只能抑制ECV304细胞的增殖和诱导细胞形态从多角形的内皮细胞向成纤维细胞样的梭形状改变。电泳检测抽提的片断化DNA以及流式细胞仪检测TSV-DM处理的ECV304细胞的DNA含量变化均表明TSV-DM不能诱导ECV304细胞的凋亡。 Stejnihagin-A 和stejnihagin-B是用PCR方法从竹叶青（T.stejnegeri）毒腺cDNA文库中克隆得到的两个P-III型蛇毒金属蛋白酶前体的cDNAs。这两个cDNA序列均编码600个氨基酸残基的蛋白前体，包括信号肽、前肽、金属蛋白酶区域、间隔区、去整合素样区域和富含半胱氨酸区域。推导成熟肽的氨基酸序列分析结果表明，stejnihagin-A 和stejnihagin-B不仅在一级结构序列上和来源于黄绿烙铁头（Trimeresurus flavoviridis）的HR1b具有高度同源性，高达79%， 而且在他们的金属蛋白酶区域的第100个氨基酸残基位置上均有一保守的半胱氨酸残基。结合序列比对和进化树的分析，我们推测stejnihagin-A、stejnihagin-B和HR1b有可能组成一个新的P-III型蛇毒金属蛋白酶亚型，命名为P-IIIc亚型。

眼镜王蛇毒第X因子激活剂结构和功能研究

通过G-75（超细）凝胶过渡，快速蛋白液相色谱（FPLC）阴离子柱两步离子交换从眼镜王蛇毒中分离得到了一个特异的血液凝固第X因子激活剂。在碱性聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中均呈一条均一的带。纯化的眼镜王蛇毒第X因子激活剂不能作用于纤维蛋白原、凝血酶原、蛋白C、纤溶酶原，对6种人工合成小肽发色底物及BAEE的水解实验表明它不能水解大多数小肽底物，不具备水解BAEE的酯酶活性，表明了它对大分子及小分子底物作用专一性较高，同时表明了对FX的作用是较为专一的。抑制剂研究结果表明它对FX的激活活性被丝氨酸蛋白酶的抑制剂PMSF、TPCK等抑制，而金属离子螯合剂EDTA则无影响，表明眼镜王蛇毒血液凝固第X因子激活剂是一个丝氨酸蛋白酶。