迷迭香（Rosmarinus officinalis L.）精油和抗氧化剂的研究

本文应用植物引种驯化，栽培学及植物化学的理论方法对引入我国的迷迭香（Rosmarinus officinalisL．）精油和抗氧化剂进行了研究．主要结果如下; 1、昆明地区的生态气候条件最适宜迷迭香生长。南京地区局部良好环境也能满足迷迭香正常生长需要。北京地区在保护栽培的情况下,迷迭香才能够安全越冬。 2、用GC-MS和GC-IR鉴定了迷迭香精油的23种成分。不同采收期精油成分含量变化有3种类型，即似单峰曲线，似8曲线和w曲线。一年生与二年生苗在精油成分含量上略有差异。与主要栽培国相比，我国不同引种地精油成分化学类型各具特点，北京地区α—蒎稀（31.58%）含量很高，南京地区富含樟脑（14.86%）乙酸龙脑酯（7.97%）和龙脑（6.90%）含量也相对较高，昆明地区则是α—蒎稀（24.32%）和1.8—桉叶油素（24.43%）含量并重。 乙酸龙脑酯含量的高低对精油香气质量优劣起关键作用。北京地区雨季来临收获（7月初）精油香气质量最好。南京地区，11月初精油香气质量也属优质。本实验未能得到高质量的昆明地区精油。 3、从迷迭香蒸油残渣中分离得到三种抗氧化成分，迷迭香酚( Rosrmanol)、鼠尾草酚(Carnosol)和迷迭香双醛（R0smadial），并用质谱，核磁做了鉴定．硫氰铁酸法、TBA法、AOM法检测了三种成分的抗氧化效能．Rosmanol对多双键不饱和脂肪酸抗氧化效果显著,Carnosol和BHT在不同双键脂肪酸中抗氧化效果稳定，Rosmadial的抗氧化效果则随不饱和双键数目的增加而降低。在猪油中，抗氧化效能的强度顺序为Rosmanol >carnosol>BR>Rosmadial。 抗氧化物质在植株体内是不断积累的。不同引种地迷选香抗氧化效能的强弱差异表现为昆明>北京>南京。 迷迭香的正己烷，两酮提取物抗氧化效能都是随着添加量的增加而增强、丙酮提取物的抗氧化效能优于正己烷提取物。 对迷迭香抗氧化剂提取工艺做了探讨，得到R-1，R—2，R-3三种小试样品，R-2，R-3的抗氧化效果优于BHT．B—l接近于BET。

小麦肉桂酰辅酶A还原酶（CCR）基因的分离和功能分析

作为植物界广泛存在的一类酚类聚合物，木质素是陆生植物正常生长发育过程中非常重要的生物大分子，而且与人类的生活息息相关。利用分子生物学手段和基因工程方法，从小麦中分离木质素生物合成途径的关键酶-肉桂酰辅酶A还原酶基因（CCR），研究肉桂酰辅酶A还原酶基因在木质素代谢途径中的调控规律，从其催化的限速步骤入手，来调控木质素的合成，有效的改变木质素的组成、含量和结构，是改善木质素在植物生长发育中的作用乃至开发木质素资源的关键所在。本文就小麦肉桂酰辅酶A还原酶基因的分离、表达特征及其在木质素合成途径中的作用开展了研究工作。 首先用RACE方法从小麦中克隆了CCR的两个cDNA的部分序列，序列分析表明它们编码的蛋白具有CCR的典型特点，GC含量高于均60%，两者在核酸水平和蛋白水平的同源性为76%和 69%，证明在小麦中至少存在着两个CCR基因。通过 RT-PCR和Northern 杂交确定W-cr6和W-cr19在小麦的发育中具有不同的表达特征，W-cr6主要在茎中表达，而W-cr19的表达集中在根中。以W-cr6为探针，从cDNA文库中筛选到一个全长1317bp的cDNA，命名为TaCCR1。TaCCR1包括开放阅读框 (ORF) 1047bp、5′端侧翼 72bp和3′端侧翼198bp的非翻译序列。TaCCR1能够编码由349个氨基酸组成的蛋白质，预期的分子量为37.4kD。同源性比较显示TaCCR1基因在核酸水平和蛋白质水平与其他物种的CCR基因的同源性高于60%。 为了分析CCR在木质素合成中的作用，用TaCCR1构建了用于转化烟草的正义和反义表达载体pStCCR和pAtCCR、用于转化小麦的正义和反义表达载体pBSC1和pBAC1。通过农杆菌介导得到了30株反义转基因烟草和12株正义转基因烟草。由于外源基因的抑制作用，转基因烟草在形态、木质素组成和含量、木质部显微结构上都程度不同的发生了变化。正义和反义的转基因株系呈现出株型矮化、木质素含量下降、木质部导管细胞壁受到破坏等现象。同时利用花粉管通道法转化小麦种子5000多粒，部分处理经过初步的PCR和 Southern分子鉴定获得了1株转基因株系，需要对其遗传、生理和形态特征做进一步的研究。 本文还对木质素对小麦茎杆的机械强度的影响做了初步的探讨，得到的结果是小麦茎杆的木质素含量、维管束的数量、茎杆有效的横界面积与其最大弯曲应力存在着正相关，而维管束的结构、密度对茎杆的最大弯曲应力没有明显的影响，从而为通过CCR基因来改善小麦茎杆的抗倒特性建立了生理学基础。

高山松的二倍体杂种起源-来自三个基因组的证据

利用松科植物特殊的遗传体系（叶绿体基因组一父系遗传、线粒体基因组—母系遗传、核基因组一双亲遗传），我们对高山松及其两个亲本种进行了广泛的群体取样，通过线粒体基因nadl、叶绿体基因rbcL和trnL-F基因间区以及低拷贝核基因4CL的序列分析或PCR-RFLP分析，为高山松同倍体杂种起源假说提供了翔实的遗传学证据，同时在个体水平上探讨了高山松不同群体的遗传组成、群体遗传结构、基因交流方向、群体建立过程以及杂种基因组的进化。具体结果如下： 1．细胞质基因组分析 1)线粒体基因nudl分析 本研究对油松、高山松和云南松的19个群体、295个个体的线粒体基因nadl的一个内含子进行了序列分析或PCR-RFLP分析，共检测到3种线粒体DNA单倍型-A、B和C。油松所有的取样群体仅含单倍型A;除BX群体外，所有的云南松群体仅含单倍型B; 10个高山松群体中，5个群体固定单倍型A，4个群体固定单倍型B，1个群体(ZD)分布有A和B两种单倍型。2)叶绿体rbcL基因分析 对同一组群体的rbcL基因进行序列分析或PCR-RFLP分析，共检测到两个变异位点和三种叶绿体单倍型（TT、TC和GC）。TT和GC分别是油松和云南松种特异性叶绿体单倍型，而在高山松群体里则三种单倍型均有分布，而且TC单倍型广泛地分布在7个杂种群体中，该单倍型很可能来源于点突变或第三个已灭绝的亲本。rbcL基因检测到的高山松群体分化系数很高(Gst=0.533)。 3)叶绿体trn L-F区序列分析 叶绿体trnL-F分子标记检测到的不同单倍型的差异主要是由引物“e”下游120碱基处一个多聚T结构的长度变异所致（叶绿体SSR位点）。10个高山松群体中共检测到5种叶绿体单倍型，其中两种主要的单倍型(9T和11T)分别为油松和云南松的种特异性单倍型，其他单倍型均为非典型单倍型。群体遗传结构分析表明：杂种群体表现最高的遗传多样性，而且trnL-F分析得到的高山松群体的分化系数也很高( Gst=0.443)。 总之，对高山松、油松和云南松的同一组群体取样进行的细胞质基因组分析表明：高山松群体分布有油松和云南松种特异性的线粒体和叶绿体单倍型，该细胞质DNA单倍型的地理分布为假说“高山松为油松和云南松的的二倍体杂种”提供了翔实的遗传学证据。油松和云南松在不同的杂种群体中分别做父本和母本，即两亲本在杂交过程中发生了双向基因交流。群体遗传结构分析发现高山松群体表现最高的遗传多样性，而且群体间的分化系数很高。不同的杂种群体在遗传组成上的差异表明他们经历过不同的建立和进化历史。从线粒体和叶绿体单倍型的地理分布可以看出杂种群体的建立曾经历强烈的奠基者效应和回交。青藏高原的隆升对高山松的起源、杂种群体的适应辐射以及保持产生了重要的影响。川西南和滇西北作为青藏高原的东边边界，很可能是当初云南松和油松分布的重叠区及杂交地带，即高山松的起源地。 2．核基因4CL分析 对高山松、油松和云南松的19个群体、32个个体的低拷贝核基因4CL进行了克隆及序列分析，获得的78条序列可分为两种类型（类型A和类型B）。这两种类型明显的差别是类型A相对于类型B在内含子区有- 20bp的缺失。以华山松的3条序列为外类群，对得到的78条序列进行基因谱系分析，发现所有的序列分成明显的两支，分别对应于类型A和类型B，而且每一支均包含三个种的部分序列，表明4CL基因在这三个种分化之前就已发生重复。另一个明显的特点是某个种的一条序列与另一个种的序列比其与同种的其他序列关系更近，可能因基因交流（杂交和渐渗）、非共祖、致同进化和重组等进化事件所致。三种松树中共检测到4CL基因序列的两种类型和六个亚类型，高山松群体中没有发现杂种独特的类型或亚类型。高山松和云南松共享三种序列亚类型以及最多的序列多态性，表明这两个种之间曾存在广泛的基因交流。

松科nrDNA 的进化研究Evolution of nuclear ribosomal DNA in Pinaceae

核核糖体DNA（nrDNA）已被作为一个重要的标记，用于推断很多分类等级上的系统发育关系。相对于在被子植物中的快速致同进化，nrDNA在裸子植物中的致同进化速率低，且ITS和5S-NTS区有着较大的长度变异，这种现象在松科植物中尤为明显。在本研究中，我们克隆并测定了银杉属的5S rDNA以及冷杉属、银杉属、雪松属、油杉属、长苞铁杉属、金钱松属与铁杉属的ITS序列。基于获得的新数据，再结合前人报导的其它属的数据，我们探讨了如下四个问题： （1）松科 nrDNA ITS1 亚重复单位的组成、分布及进化;（2）ITS1区的长度变异与亚重复单位数目的关系以及它们的系统学意义;（3）松科ITS1的二级结构特征;（4）银杉5S rDNA编码区及非转录间隔区的结构特征。主要研究结果如下： 1. ITS区的序列分析ITS区的克隆及序列分析发现：（1） 松科ITS1的长度变异范围为 944-3271 bp, 这是目前已报导的真核生物中属间ITS变异最大的类群之一;（2） 所有松科植物的ITS区域都包含亚重复单位，亚重复单位的数目从2到9，并且这些亚重复单位可分为两种类型，即不含保守核心序列（5’-GGCCACCCTAGTC ） 的长亚重复单位（LSR）和含上述保守核心序列的短亚重复单位（SSR）;（3） ITS1区的巨大长度变异主要归因于亚重复单位的数量变异; （4） ITS1区的GC含量与 它的序列长度和亚重复单位的数目有一定关系，并能够提供一些系统发育信息，特别是支持云杉属、松属和银杉属三者具有很近的亲缘关系。 2. ITS1亚重复单位的系统发育分析为了研究亚重复单位的进化关系，我们用最大似然法和最大简约法构建了松科ITS1亚重复单位的系统发育树。结果表明：（1）在ML和MP树中可发现有共同的五个分支; （2） 银杉比松科其它属拥有更多的SSR，且该属的所有9个SSR在系统树中构成一个单系支，表明它们是在银杉属内发生重复的;（3）一些SSR在属间和种间具有同源性，可为nrDNA ITS 的进化历史以及松科的系统发育 研究提供重要信息;（4）亚重复单位的多次重复以及伴随的重组可能是导致LSR 和SSR在松科不同属中分布式样不同的原因。 3. 松科ITS1的二级结构 用 Mfold 3.2 软件对松科所有11个属的ITS1区进行了二级结构预测，共获得了563个最低自由能折叠。结合以前关于松科二级结构的报导，我们分析的结果表明：（1） 松科ITS1的二级结构主要由几个延展的发夹结构组成;（2） 构象的复杂性与亚重复的数目呈正相关;（3）配对的亚重复单位通常在保守核心区（5’-GGCCACCCTAGTC ） 处有部分重叠，并且构成一个长茎，而其它的亚重复单位通常会自身折叠，且保守核心区的部分出现在发夹结构的环中。 4. 银杉5S rDNA 序列分析 我们对来自银杉不同群体的3个个体的5S rDNA进行了克隆，共获得 45 条序列，分析结果表明：（1） 绝大多数银杉5S rDNA编码区长度为120 bp, 以GGG 开头，以CTC结尾，编码区出现的碱基替代主要为转换;（2） 银杉与其它裸子植物相比，5S rDNA基因编码区具很高的相似性（90-99%）; （3）间隔区含有一个poly-C和一个poly-T结构、两个TC丰富区以及五个GC丰富区。根据长度和序列特征，银杉的5S rDNA间隔区可分为三种类型：Type A 长751-764 bp，Type B 长770-807 bp （含一个32 bp的插入），Type C 长581-594 bp; （5）长间隔区（Type A，Type B ）中含有两个148-175 bp的串联亚重复单位，该亚重复单位与短间隔区（Type C ）中的一段143 bp的序列具有较高的相似性（56.0-66.8%）。 5. 银杉5S rRNA的二级结构 Mfold 3.2 预测结果表明：（1）银杉5S rRNA二级结构包括5个双螺旋区（干区）（Ⅰ-Ⅴ）、2个发夹结构环区（C和D）、3个中间环区（B1、B2 和 E）和1个铰链区（A）, 铰链区为三个双螺旋的结合处;（2） 二级结构中的环区通常比双螺旋区更加保守;（3）在5个双螺旋中，I 和 IV 区有较高的碱基替代率。

诱导风信子（Hyacinthus orientalis L.）同一花被外植体不同部位细胞分化花芽的研究--外源激素的作用及内源激素的变化

诱导风信子（Hyacnthus orientalis L．）同一花被外植体上不同部位细胞分化花芽，从外源激素的作用和内探激素的变化探讨细胞脱分化启动的原因，研究了不同外源激素的组合下同一花被不同部位花芽分化的诱导频率：测定了花被上、中，下三部位切块离体培养前后的内源IAA和Z+ZR的含量;在此之前研究了GC-MS．MIM内标法测定微量植物材料内源IAA含量的可行性． GC-MS．MIM内标法是测定微量（0.5-1g）植物材料内源IAA含量的一种比较理想的方法，所需材料量一般为0.58．这一方法的材料前处理采用粗提液用C18Sep-pak柱初步分离纯化．HPLC进一步纯化，能获得纯度高的样品，且操作简便，省时省力． 风信子同一花被不同部位细胞均能分化花芽．当培养基中附加2.0mg/l Zeatin或2.0mg/16-BAP时，随着外探IAA浓度从0升高到10.0mg/l．捆胞分化花芽的部位从花被下部向上部移动。 离体培养前后同一花被上、中、下三部位内源IAA和Z+ZR含量测定结果表明．风信子同一花被内源IAA含量是上部最高，下部次之，中部最低，而内源Z+ZR含量从上向下依次增加;在附加不同外源激素的MS培养基上培养3天后，同一花被上，中、下三部位内源IAA和Z+ZR含量部有一定的变化。

水稻花发育相关基因RA68和OsUBP1的分离与功能分析

　　　　　　　　　　　　　　　　　第一部分 利用减法杂交和RACEs从水稻中克隆了一个编码含有脯氨酸和苏氨酸丰富结构域多肽的cDNA,其相应的基因被命名为RA68。RA68由3个外显子和2个内含子组成，编码的蛋白由219个氨基酸残基组成。该蛋白由一个21个氨基酸残基组成的信号肽，一个亲水性的N－端结构域和一个疏水性的C－端结构域组成。 N端结构域是一段嵌合PTPTSYG motif的富含脯氨酸和苏氨酸的序列。 Southern杂交和序列分析结果表明RA68在水稻基因组中以单拷贝存在，定位于第2号染色体。Northern杂交结果表明RA68在幼芽和花中表达量较高，在根和叶中不表达。原位杂交分析结果表明：在幼苗期RA68 主要在幼芽胚芽鞘的内外层细胞和幼叶原基的表层细胞中表达;转入生殖生长期后，在花序分生组织、枝梗原基顶端、花器官原基、大孢子囊和花粉粒中表达。用GFP作报告基因，用洋葱表皮细胞进行的瞬间表达测试结果显示RA68蛋白定位于细胞核中。转反义RA68水稻植株抽穗期比对照野生型延迟30天左右。这些结果表明RA68可能是水稻花分生组织特征基因，在成花转变过程中起作用。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第二部分 通过RACE和RT-PCR方法分离了水稻OsUBP1基因，其推测编码蛋白含有UBP结构域（Cys Box和His Box）和TopⅥA结构域。RT-PCR分析结果表明OsUBP1在转录过程中通过可变剪接产生多个不同的转录本，这些转录本在叶、根、颖花和幼芽中存在着时空调节表达模式，每种组织中的转录本是不一样的。这些转录本内含子剪切位点除了经典的GT-AG外，还有GC-AG、CT-AC、TT-GA、GT-GA和CT-GA。由于发生了GC-AG的可变剪切产生了OsUBP1的重要功能结构域Cys Box。水稻OsUBP1基因和OsSPO11-1基因位于11号染色体的同一基因座位上。原位杂交分析表明，在花中OsUBP1 mRNA 主要在药壁绒毡层、花粉粒、大孢子囊和颖花底部维管束中表达。转反义OsUBP1植株大多不能正常结实，这说明OsUBP1可能参与水稻的育性调节。 关键词

青蒿素生物合成相关基因的功能分析及遗传转化研究

从中国传统药用植物青蒿（Artemisia annua L.）中提取的青蒿素及其半合成衍生物如蒿甲醚等是一类新型的抗疟特效药，特别是对抗氯喹的恶性疟疾和脑型疟疾有很好的疗效。由于青蒿素在植物中的含量极低，使得其价格很高，特别是对于亚非拉等第三世界国家来说。因此如何提高青蒿素的产量成为近年来研究的热点。各种传统的育种、生理生化手段和细胞培养技术均未取得较好的结果，因此，利用植物基因工程技术提高青蒿素产量已成为研究的重点之一。 本论文围绕青蒿素的生物合成途径开展了以下的工作： 一、中药青蒿紫穗槐二烯合酶的大肠杆菌表达、纯化与功能鉴定 利用RT-PCR方法，从中药青蒿高产株系001中克隆到的中药青蒿紫穗槐二烯合酶(ADS) cDNA, 其推测编码蛋白与前人报道的有两个位点的突变。将其开放阅读框插入到原核表达载体pET30a(+)的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，构建N端携带有HIS6表达标签的紫穗槐二烯合酶重组表达载体pETADS。将pETADS转入大肠杆菌BL21(DE3)， IPTG (Isopropyl-beta -D-thiogalactoside)诱导重组紫穗槐二烯合酶的表达。表达产物经镍琼脂糖柱纯化。纯化蛋白加入酶促反应体系（含FPP），GC-MS分析酶促反应体系的正己烷萃取物，结果显示重组紫穗槐二烯合酶可以催化FPP向紫穗槐二烯的转化。体外酶促动力学分析表明，两个位点的氨基酸突变，并没有影响到青蒿紫穗槐二烯合酶的催化活性。基因组DNA杂交表明，紫穗槐二烯合酶基因在001株系基因组中至少有4个拷贝。 二、中药青蒿鲨烯合酶的大肠杆菌表达、纯化与功能鉴定 将经RACE方法克隆到的中药青蒿鲨烯合酶cDNA(AF302464) 开放阅读框的3'末端截短99 bp，插入到原核表达载体pET30a(+)的NcoⅠ和BamHⅠ酶切位点之间，构建N端和C端均携带有HIS6表达标签的鲨烯合酶重组表达载体pETSSA。将pETSSA转入大肠杆菌BL21(DE3)， IPTG (Isopropyl-beta-D-thio galactoside)诱导重组鲨烯合酶的表达。表达产物经镍琼脂糖柱纯化。纯化蛋白加入酶促反应体系（含FPP和NADPH），GC-MS分析酶促反应体系的正己烷萃取物，结果显示重组鲨烯合酶可以催化FPP向鲨烯的转化。青蒿鲨烯合酶的功能鉴定，为进一步利用反义或RNAi技术限制甾类生物合成，从而提高青蒿中的青蒿素含量提供了基础。 三、中药青蒿法呢醇合酶原核表达、纯化与功能鉴定 将经RACE方法克隆到的中药青蒿倍半萜合酶cDNA ( AF304444) 开放阅读框插入到原核表达载体pET30a(+)的NcoⅠ和BamHⅠ酶切位点之间，构建N端和C端均携带有HIS6表达标签的重组表达载体pET30SESQ。将pET30SESQ转入大肠杆菌BL21(DE3)， IPTG (Isopropyl-beta-D-thioga lactoside)诱导蛋白表达，表达产物经镍琼脂糖柱纯化。纯化蛋白加入酶促反应体系（FPP），GC-MS分析酶促反应体系的正己烷萃取物，结果显示此重组酶可以催化FPP向法呢醇的转化。 四、中药青蒿FPS、ADS双功能酶基因的构建、表达与功能鉴定 将青蒿素生物合成途径中催化两步连续反应的酶：法呢基焦磷酸合酶和紫穗槐二烯合酶的基因进行融合，经大肠杆菌表达后鉴定融合蛋白的功能，结果表明融合蛋白具有了双功能酶活性。进一步将融合酶基因转入酿酒酵母中，发酵后检测紫穗槐二烯的含量，并与同时转入法呢基焦磷酸合酶和紫穗槐二烯合酶单个基因的酵母、单独转入紫穗槐二烯合酶基因的酵母进行了比较，结果表明，转入双功能酶的酵母发酵获得的紫穗槐二烯含量要比两个对照酵母高，这表明，获得的双功能酶的催化效率要比两个单独酶的催化效率高。 五、过量表达青蒿紫穗槐二烯合酶对青蒿中青蒿素及其前体物含量的影响 利用根癌农杆菌介导，将青蒿紫穗槐二烯合酶转入青蒿株系001，分子检测证明，紫穗槐二烯合酶整合到了青蒿基因组中并在mRNA水平得到了高效表达。部分转基因青蒿的青蒿素含量有明显增加，最多的比001株系提高了41%。青蒿酸和二氢青蒿酸含量测定表明，转基因青蒿株系的青蒿酸和二氢青蒿酸含量最多的比对照分别提高了47%和79%。这些结果表明，紫穗槐二烯合成在青蒿素生物合成途径中是一个限速步骤，同时，也显示青蒿酸或二氢青蒿酸的进一步转化也可能是青蒿素生物合成中下游的限速步骤。

中药青蒿萜类代谢物谱分析及青蒿素生物合成的研究

青蒿素是从中药青蒿，学名黄花蒿（Artemisia annua L.）植物地上部分分离出的抗疟疾有效单体，为一种倍半萜内酯类化合物，其生物合成途径属于植物类异戊二烯代谢途径。青蒿素生物合成途径及其调控机制仍不完全清楚，本论文采用GC-MS 和GC×GC-TOFMS 方法对青蒿萜类代谢物谱进行检测，用多维统计学方法对检测结果进行整理和比较分析，研究青蒿素生物合成及其与青蒿中其他萜类代谢的关系，取得了以下结果： 一、通过GC×GC-TOFMS 方法对青蒿挥发油成分进行分析，共鉴定出303 种组分。其中挥发油中相对百分含量大于1%的10 种组分中有9 种为萜类化合物，含量接近总挥发油的50%。在相对百分含量大于0.1%的49 种成分中，有30 种萜类化合物。有27 种相对百分含量大于0.1%的成分首次在青蒿挥发油中报道，其中包括10 种萜类化合物。 二、利用GC-MS 方法分析了青蒿001 和SP18 两个青蒿素高产株系不同生长时期萜类代谢物谱，结果表明：青蒿中萜类化合物在不同时期合成和积累是动态变化的，萜类化合物的种类和数量在营养生长期随生长时间的延长而提高，在营养生长后期和现蕾前期达到最高水平，进入生殖生长后随生长时间的延长而迅速降低。通过多维统计PLS-DA（Partial Leasted Square Discriminant Analysis） 分析，确定001 中有17 个化合物的含量在不同生长时期有明显变化，其中15 个为萜类化合物。SP18 中有18 个化合物的含量在不同生长时期有明显变化，其中16 个为萜类化合物。青蒿素，青蒿酸，二氢青蒿酸，青蒿素B 都是含量变化明显的标记物。其中青蒿酸和二氢青蒿酸含量在营养生长后期达到最高水平，进入生殖生长后迅速下降，而青蒿素和青蒿素B 在整个检测时期含量变化相对较小，在营养生长时期含量已经较高，在现蕾前期含量稍有上升，进入现蕾期后有所下降，本研究确定现蕾前期为代谢物谱分析最佳取样时期，并为药材采收提供指导。 三、不同基因型青蒿代谢物谱研究表明，青蒿素高产株系SP18 和001 代谢物表现出一定的差异，通过多维统计PLS-DA 分析，共找出了22 种在两种基因型中差异明显的化合物，其中包括倍半萜化合物12 种，单萜化合物3 种，三萜化合物4 种。SP18 特征化合物为樟脑和两个未鉴定倍半萜化合物，而001 特征化合物是龙脑和β-法呢烯。另外两种基因型中青蒿素及相关前体化合物的积累模式差异明显，SP18 中二氢青蒿酸和青蒿素含量高，而青蒿酸和青蒿素B 含量极低；001 中二氢青蒿酸和青蒿素含量相对SP18 要低，但青蒿素B 和青蒿酸含量比SP18 要高。该结果表明在青蒿素高产株系中，青蒿素含量与二氢青蒿酸的含量呈正相关，结合Brown 等的活体标记研究结果分析，从二氢青蒿酸到青蒿素的转化可能是青蒿素合成的限速步骤。 四、利用GC×GC-TOFMS 方法对转基因青蒿萜类代谢物谱进行了分析，共对200 个左右化合物峰进行PLS-DA 和OSC-PLS (Orthogonal Signal Correction–Partial leasted Square)多维统计分析，结果表明：青蒿萜类代谢物谱在外源基因转入后发生显著变化，与对照株系相比均呈现显著差异。其中过量表达Amorpha-4,11-diene 合酶基因（ads）株系中青蒿素及相关化合物变化最明显，而过量表达FPP 合酶基因（fps）株系中青蒿素及相关化合物变化相对较小，在受到调控而成为差异标记物的化合物中，70%是倍半萜类化合物。 五、考察了外源茉莉酸甲酯对青蒿素生物合成的影响，结果表明：300 μM 外源茉莉酸甲酯能提高青蒿素含量，在处理后第8 天青蒿素含量提高38%。青蒿萜类代谢物谱研究表明，茉莉酸甲酯不仅可以诱导青蒿中青蒿素的合成，还能诱导很多化合物，特别是倍半萜和三萜类的合成。OSC-PLS 分析结果找出了9 个处理后含量明显提高的标记物，其中6 个倍半萜化合物，3 个三萜化合物。标记物鲨烯含量提高了67%，另一个未鉴定出结构的倍半萜提高了60%，这些化合物可能与青蒿素有着类似的调控机制，而外源喷洒茉莉酸甲酯可以作为提高青蒿素产量的有效途径之一。

水稻OsGSR1调控赤霉素和油菜素内酯信号互作的分子机理研究

赤霉素（gibberellins，GAs）和油菜甾醇（brassinosteroids，BRs）在细胞伸长和植株形态建成等方面发挥重要的生理作用，但它们在分子水平上的相互作用仍然未知。在本实验室前期的芯片工作中筛选到受GA诱导表达的GAST家族基因OsGSR1(GA-stimulated gene in rice) (GenBank AY604180)。该基因全长cDNA为588 bp，编码110个氨基酸，OsGSR1具有GAST家族成员的共同特点。OsGSR1基因的表达受GA3诱导，同时受PAC抑制。基因表达模式分析表明OsGSR1在水稻的根、茎、幼穗和小花等多种组织和器官中表达。前期工作已获得转基因水稻。 本论文研究表明，OsGSR1 RNAi转基因水稻表现为初生根缩短、叶片直立、节间缩短和结实率降低等与GA和BR相关的表型。OsGSR1 RNAi转基因水稻对外源GA3敏感性降低，Real-time PCR分析表明在OsGSR1 RNAi转基因水稻中OsGA20ox2和SLR1的转录水平增高，GC-MS分析显示内源GA4含量增高，这些结果说明转基因材料中GA信号削弱。因此，OsGSR1是GA信号途径的正调控因子。另一方面，实验证据表明，外源BL处理可以抑制OsGSR1基因的表达，OsGSR1 RNAi转基因水稻不但可以响应外源BL处理，并且在叶夹角实验中显现出对外源BL更加敏感的特性。在OsGSR1 RNAi转基因水稻中，BR受体基因OsBRI1与合成基因OsDWARF表达量上调。外源添加BL可以恢复OsGSR1 RNAi转基因水稻矮化表型，上述结果说明OsGSR1可能作用于BR生物合成途径。酵母双杂交筛选、体外Pull-down结果和体内BiFC实验都证实OsGSR1可以与DIM/DWF1互作。在BR生物合成途径中，DIM/DWF1催化从24-亚甲基固醇（24-methylenecholesterol）到油菜甾醇（campesterol）的转化。GC-MS测定内源BRs含量结果进一步证实，转基因水稻中DIM/DWF1催化反应产物积累量减少，说明该反应受到明显抑制。所以，OsGSR1是通过直接作用于BR合成酶来调控BR生物合成。 综上所述，OsGSR1是GA信号途径的正调控因子，并且OsGSR1通过调节SLR1的表达参与到GA信号转导途径。OsGSR1和DIM/DWF1的互作说明OsGSR1直接参与了BR的生物合成过程。因此，我们的实验证明OsGSR1介导了GA和BR这两条激素信号转导途径的相互作用，从而调节了水稻植株的生长发育。

静态箱-气相色谱法研究人类活动对内蒙古草原主要温室气体交换通量的影响

本研究全面分析了陆地生态系统主要温室气体N2O、CO2和CH4通量研究的主要方法，系统阐述了改进后的静态箱-气相色谱法观测内蒙古半干旱原N2O、CO2和CH4交换通量的具体应用。就用此观测系统，于1998年5月至2000年2月长期定位观测研究了内蒙古锡林河流域主要人类活动（放牧、家垦）对N2O、CO2和CH4交换通量强度及季节变化的影响，同时对水分、地温等相关因素的影响作了初步探讨。 通过对主要温室气体N2O、CO2和CH4通量观测主要方法的比较分析认为：静态箱-气相色谱法是观测内蒙古半干旱草原N2O、CO2和CH4交换通量行之有效的方法，改进后的观测系统其准确性和再现性基本可以满足研究要求，但箱法的局限性也导致对CO2及不同牧压下草原N2O通量的观测很难得到客观准确的结果。 农垦对内蒙古草甸草原N2O、CO2和CH4通量有着重要的影响：农垦显著增大了草甸草原N2O排放通量，但对N2O排放通量的季节变化无显著影响;在植物生长旺期之前，农垦对草甸草原CO2排放通量无显著影响，在植物生长旺期及之后的小麦成熟期，农垦明显增大了CO2的排放。农垦还使得CO2排放通量的季节变化由单峰型变为双峰型;农垦对CH4通量的强度及季节变化均无显著影响。 连续两年的观测结果表明，研究放牧对内蒙古典型草原CO2和CH4通量的影响应结合水分条件来考虑。不同牧压下冷蒿-小禾草草原CO2排放能量受水分条件的显著影响，水分条件改变了CO2通量的季节变化。丰水年CO2排放强度随着放牧强度的增大而增大，正常年份放牧强度对CO2排放通量强度无显著影响。两年的观测均发现不同的放牧强度对CO2通量的季节变化没有影响;土壤-植被系统吸收CH4的能力在不同放牧强度处理之间没有显著差异，而同一放牧率下年际间CH4通量变化很大，正常年份比丰水年吸收通量大。同时分析了温度与不同放牧强度草原CH4通量的关系，认为影响放牧条件下冷蒿-不禾草草原CH4吸收通量的主要因子是地表以下10cm土壤温度。

锡林河流域温带草地植物VOC释放及其对草地生态系统碳循环的贡献

植物源挥发性有机碳化合物（Volitale organic compounds, VOC）是大气VOC的主要来源，与对流层大气质量、大气化学密切相关。鉴于温带草地的分布范围很广，草地植物VOC释放潜力某种程度上影响植物源VOC的总释放量。另外，植物源VOC也是光合作用固定碳素的损失方式之一，可能在特定区域或生态系统中具有重要意义。基于上述想法，本文设计了四个方面的实验作为研究内容：1） 温带草地物种水平VOC释放潜力、及其与植物功能群的关系？2) 沙地植物物种水平VOC释放潜力、及其与植物功能群的关系？3) 沙地植物-草地植物VOC释放潜力存在显著性差异吗？4) 温带典型草地和退化草地的VOC释放速率如何？在生态系统水平，植物源VOC对温带草地碳循环的贡献多大？ 在所测定的175种温带草地植物中，不同植物间异戊二烯和单萜释放潜力差异很大;除少数物种外，大多数植物的异戊二烯和单萜释放潜力都较低，尤其是典型草地的优势物种。在此基础上，作者探讨了分类学赋值方法对温带草地植被的可行性，并初步建立了锡林河流域温带草地植物的VOC释放目录（共277种植物）。另外，温带草地植物的异戊二烯和单萜释放潜力与植物功能群（植物生活型和水分功能群）具有一定的联系，尤其是植物生活型。总的来说，温带草原的优势生活型（物种），即多年生根茎禾草（或多年生丛生禾草），具有较低的异戊二烯和单萜释放潜力。各水分功能群间差异不显著，但中旱生植物、旱中生植物 (温带草原的优势功能群)，具有较低的异戊二烯、单萜释放潜力。因此，温带草原退化过程中，那些具有较高VOC释放潜力的植物，重要性将会增加。 沙地植物种类组成非常丰富，不同物种间的异戊二烯和单萜释放潜力变异也很大。另外，沙地植物的异戊二烯和单萜释放潜力与其功能群间关系较密切，不同植物生活型间差异显著;其中也以多年生根茎禾草、多年生从生禾草的释放潜力最低，而乔木的释放潜力相对最高;该结论基本与草地的研究结论一致。然而，沙地植物的异戊二烯和单萜释放潜力与其水分功能群的关系比较模糊，中生植物具有更高的释放潜力，湿生植物的释放潜力较小。 通过对比沙地植物和草地植物的释放潜力，发现沙地植物的异戊二烯和单萜释放潜力比草地植物高，且这种差异整体上显著。另外，这种显著性差异，在不同植物生活型、水分功能群间也同样存在。沙地植物比对应的草地植物具有更高的异戊二烯和单萜释放潜力，最可能的原因：沙地正午的温度明显比草地温度高，前者实测温度可超过 45 ℃,这种经常性、周期性高温，促使沙地植物采用与草地植物不同的适应策略，即沙地植物通过释放更多的异戊二烯或单萜来减少其可能遭的热胁迫或热伤害，这种长期适应策略，使沙地植物具有更高的萜类化合物释放潜力。 本文还调查了温带典型草地生态系统和退化草地生态系统的异戊二烯和单萜释放速率，结果表明典型草地的标准异戊二烯和单萜释放速率分别为0.50 μgC g-1 h-1和0.69 μgC g-1 h-1;退化草地的标准异戊二烯和单萜释放潜力分别为0.32 μgC g-1 h-1和1.59 μgC g-1 h-1。总的来说，温带草地的异戊二烯和单萜释放速率都比较低，尤其是典型草地。整个生长季，典型草地释放的异戊二烯和单萜分别为31.6 mgC•m-2　和 70.4 mgC•m-2;退化草地的异戊二烯和单萜释放量分别为20.8 mgC•m-2 和 168.8 mgC•m-2。退化草地萜类化合物总释放速率远高于典型草地，尤其是单萜释放能力。过度放牧引起的草地退化，通过改变植被种类组成，对温带草地的异戊二烯和单萜释放速率产生显著影响;总体而言，温带草地退化将会使草地释放更多萜类化合物。 在温带草地生态系统中，Clost as VOC相对其NPP而言很小，在环境PAR和温度高时,它的贡献率相对较大;Clost as VOC约占典型草地生态系统NEP的5.32 %，退化草地生态系统NEP的0.23 %。植物源VOC释放所损失的碳素相对草地生态系统NPP而言几乎可以忽略不计;但是，相对其NEP，Clost as VOC还是具有一定的相关性。虽然，草地生态系统Clost as VOC对NPP或NEP的贡献率较小，但考虑到全球尺度植物源VOC的巨大释放速率，它在碳循环中的贡献率仍然不容忽视;在某些特殊的生态系统中，仍可能扮演重要角色。

沿水分梯度草原群落NPP动态及对气候变化响应的模拟分析

水分条件不仅影响半干旱区群落的组成，而且在一定程度上决定了群落的功能。处于不同水分条件生境下群落的优势物种在水分利用和同化物利用效率方面的功能特征会存在差异，这些差异将导致群落对于气候变化产生不同的响应，进而影响到景观和区域尺度上对于全球变化下碳动态和格局的分析。本研究选取了锡林河流域典型草原区沿水分梯度的四个代表群落，在野外实验测定并结合长期定位研究成果基础上，利用BIOME-BGC模型对代表群落的长期净初级生产力(NPP)动态进行了模拟和模型验证。通过分析该地区1953~2005年气候变化趋势，推测了未来可能的气候变化情景，进而模拟了气候变化下四个群落长期NPP动态的响应。 野外实验分析表明，在四个群落中，净光合速率与光合有效辐射呈单峰曲线关系，与温度和蒸气压亏损(VPD)成反比，叶片氮含量和比叶面积也会影响到光合能力。四个群落由于水分与土壤条件的差别，净光合速率随VPD与温度的变化表现出不同的增减幅度。将日变化分为四个阶段，分别为大致在6:00~8:00左右的低温高湿阶段，10:00~16:00的高温低湿阶段，16:00以后的低温低湿阶段和低温高湿阶段变为高温低湿阶段过程中的适温适湿阶段。在每个阶段中，影响羊草光合速率的主导因子是不同的。在不同的水分与土壤状况下，羊草的光合特性表现出明显差异，但总体说来水分仍是光合作用的主导因子。 模型模拟结果表明，当前气候条件下，羊草群落NPP平均值为197.76 gC m-2 (SE=7.11)，大针茅群落NPP平均值为198.95 gC m-2 (SE=6.41)，贝加尔针茅群落NPP平均值为210.41 gC m-2 (SE=7.87)，克氏针茅群落NPP平均值为144.92 gC m-2 (SE=4.64)，四个群落NPP平均值为188.01 gC m-2 (SE=3.72)。 日最高温度与最低温度在1953~2005年间都明显增加，而降水变化很大。温度增加下(P0T1)NPP平均下降14.2%，降水增加下(P1T0)NPP平均增加13.2%，温度与降水都增加情景下(P1T1)NPP平均下降2.7%。在半干旱区，降水是NPP变化的主要限制因子，而温度通过影响了植物的呼吸与蒸散作用对NPP产生影响。 由于生境水分条件差别和优势物种功能特征差异，四个群落在气候变化中表现出对温度与降水不同的敏感程度，这与水分胁迫系数WSI、碳胁迫系数CSI变化密切相关。克氏针茅群落由于所处生境水分条件差，水分胁迫系数高，对降水的依赖程度最大;贝加尔针茅群落一方面处于较好的水分生境，具有相对较小的水分胁迫系数，另一方面，由于具有高碳氮比，维持呼吸消耗的光合产物比例低，碳胁迫系数远低于其它三个群落，未来气候变化下NPP较其它三个群落仍较高。

烟草单半乳糖甘油二酯缺失对茉莉酸生物合成的影响

茉莉酸（JA）是由脂肪酸衍生而来的环戊酮化合物，广泛存在于自然界中，在植物逆境胁迫响应和生长发育调节过程中起重要作用。因此，JA被认为是一种新型植物激素。植物JA生物合成的最初底物是三烯脂肪酸（含有三个双键的十八碳和十六碳脂肪酸，18:3和16:3），这些脂肪酸经过脂氧合酶（LOX）、丙二烯氧化物合酶（AOS）和丙二烯氧化物环化酶（AOC）等一系列酶促反应，最终生成JA。JA生物合成所需要的三烯脂肪酸来自叶绿体膜脂。高等植物叶绿体类囊体膜含有四种极性甘油脂，它们是：单半乳糖甘油二酯(MGDG)、双半乳糖甘油二酯(DGDG)、硫代异鼠李糖甘油二酯(SQDG)和磷脂酰甘油(PG)。但是人们尚不清楚JA生物合成所需要的三烯脂肪酸主要来自哪一种膜脂。 最近，我们利用RNA干扰技术获得了烟草MGDG部分缺失的突变体。MGDG是质体中最重要的甘油脂，其含量高达50%，其中含有的三烯脂肪酸约占总脂中三烯脂肪酸含量的65%。本研究的目的是以烟草MGDG缺失的突变体（mgd1）为材料，通过研究MGDG缺失对茉莉酸生物合成的影响，阐明半乳糖脂与JA生物合成的关系。 首先我们对野生型烟草（WT）和mgd1的相关生物学特性进行了研究，包括甘油脂和脂肪酸组成。结果表明，mgd1烟草叶片中MGDG含量降低了57％，同时，其三烯脂肪酸相对含量也大幅度降低。其中十六碳三烯酸（16:3）降低了78%，亚麻酸（18:3）含量减少了28%。因此，由于MGDG缺失，类囊体中的三烯脂肪酸降低了27%。这一结果说明了JA生物合成的底物大幅度减少。 为了说明MGDG缺失导致的三烯脂肪酸含量的减少是否影响到JA的含量，我们利用GC-MS方法比较了WT和mgd1烟草中JA的含量。结果表明，mgd1叶片中的JA含量较WT降低了50%，说明了MGDG的缺失影响了JA的生物合成。 伤害可以诱导JA在短时间内大量合成。我们比较了机械损伤后JA在WT和mgd1叶片中积累的动态过程。伤害同时可以使WT和mgd1叶片中的JA含量增加，并且在1小时达到最大值。但是，JA在两种烟草叶片中增加的幅度不同，WT叶片受伤1小时后JA含量是未受伤时的5倍，而mgd1叶片受伤1小时后，其JA含量只增加了1倍。这些结果说明了MGDG缺失可以严重影响伤害诱导的 JA 的积累，MGDG是JA的生物合成底物的重要来源。 我们进一步研究了MGDG缺失对JA生物合成相关酶基因表达的影响。 LOX1和AOC编码JA生物合成途径中的关键酶LOX和AOC。RT-PCR分析表明mgd1叶片中这两个基因受伤害激活的程度比WT弱。进一步说明突变体中JA合成受到影响。 植物受到伤害时内源JA含量增加，并激活防御基因的表达。我们的结果显示，当植物受伤害后，mgd1叶片中与JA信号转导相关的防御基因HPL，PI-I和PI-II的表达量增加幅度明显低于WT。这说明突变体中JA信号转导途径受到了抑制。 JA在植物对昆虫侵害的防御反应中起重要作用，上述结果表明突变体对伤害响应受到削弱。昆虫饲喂实验显示，棉铃虫更趋向食用mgd1植株叶片，取食mgd1植株的棉铃虫的体重增加较多。这些结果与WT和mgd1在JA含量、防御相关基因表达方面的差异相一致。外源施加茉莉酸甲酯（MeJA）能够恢复mgd1的抗虫性和防御基因的表达，说明JA是恢复mgd1抗虫性所必须的。 上述结果表明MGDG缺失使JA生物合成受到影响，尤其是JA在植物受到伤害后的生物合成。对于这一现象的可能的解释是：MGDG是JA生物合成底物的主要来源，由于mgd1中缺少大量的MGDG，当植物受到伤害时，MGDG不能释放出足够三烯脂肪酸来合成JA，导致其含量降低，破坏了JA信号途径，最终使得植株表现出抗性降低等特性。我们的研究证明了MGDG可以作为JA生物合成的底物来源在JA信号途径中起重要作用。

中国古牡丹资源调查及衰老相关研究

牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）是芍药科芍药属牡丹组植物，花大、色艳、型美、香郁、药用范围广、文化内涵丰富，被尊为“国色天香”、“花中之王”。我国植牡丹、赏牡丹有1600多年的历史，培育了许多价值高的品种，遗憾的是个别黄色、鲜红色、绿色等珍贵品种不断消失，而且现有的一些文化价值与观赏价值极高的古牡丹、著名的牡丹园的老牡丹均出现了衰弱现象，有的已奄奄一息。为了探索传统牡丹品种消失及牡丹衰老的原因，本研究在充分调查、整理国内品种资源的基础上，总结了牡丹品种的传承和消失情况，掌握了古牡丹的资源状况。通过连作土壤栽培试验证明了牡丹连作障碍的存在，并选定了生长在同一区域的5、10、15、20、25、30年生6个株龄的‘洛阳红（Luo Yang Hong）’为研究对象，从形态指标的调查、生理指标的测定、根际土壤及根系浸提液的化感成分分析三个方面着手，确定了牡丹开始衰老的时期;揭示了牡丹衰老机理;总结了古牡丹保留、复壮、养护办法;为牡丹专类园的管理及可持续性发展提供了理论和技术指导。本研究主要结果如下： 1、牡丹品种和古牡丹资源 通过对中国牡丹品种资源的文献查阅和实地考察，系统整理了我国不同时代的品种状况，调查结果表明：宋、元、明、清共有品种1109种，目前仅存143种，品种资源消失十分严重。收集整理了49处古牡丹资料，并据此绘制了我国目前古牡丹分布图;实地调查了17处24株古牡丹，详细介绍了部分品种的来历传说、生长状况和衰亡原因。5个优良传统品种在中国科学院植物研究所牡丹种质资源圃内得以保存，其中潞城古牡丹，植株最大（高2.3 m，冠径5.6 m），且生长旺盛;西溪牡丹属丰花品种，40年植株可开花811朵。 2、牡丹连作障碍 利用牡丹连作根际土壤及其浸出液栽培牡丹，结果表明，播种苗及分株苗的生长均受到了抑制;连作年限越久的处理抑制作用越强;根际土壤浸出液对牡丹生长的影响较大，对前期地下部和后期地上部都有很强的抑制作用，而且还抑制了上胚轴休眠的解除;根际土壤对后期株高和展叶幅的影响较大，对播种苗前期生根影响不大。牡丹存在连作障碍现象，连作障碍是牡丹衰弱的重要原因。 3、牡丹衰老时间及机理 通过对6 个株龄‘洛阳红’的形态、生理指标及根际土壤化感成分的比较得出，牡丹在同一地方大约栽植15 年后开始衰弱，20 年以内应该采取复壮措施。利用气相色谱—质谱联用技术（Gas Chromatograph-Mass Spectrometer, GC-MS）检测到根际土壤及根系浸提液中主要存在：烷烃、烯烃、芳香烃、醇、醚、酚醌、有机酸、醛、酮、酯、苯、胺等12 类有机物。对比分析得出有12 种物质可能是根系分泌物，根际土壤中可能具毒害作用的物质有40 种，栽植牡丹使土壤中增加的物质有24 种。 4、古牡丹复壮技术及应用 栽培基质中添加活性炭、沙子、麦饭石等均能有效的促进牡丹的生长，以活性炭的效果最好。对“汉牡丹”实施了综合复壮措施，效果明显。