复苏植物牛耳草Boea hygrometrica干旱诱导基因的筛选和功能分析

干旱对植物的影响和植物对干旱的反应是十分复杂的，涉及到植物的各种生理活动，由胁迫强度及时间、植物本身的遗传特性、发育阶段和生理状况以及其他环境因子共同决定。现代分子生物学和生物技术的发展深化了对植物逆境反应的研究，对植物抗旱分子反应的研究成为这个领域的热点，也引发了抗逆基因资源的争夺战。 以拟南芥等植物为实验材料的研究对深入了解植物对干旱胁迫感知和反应机制提供了重要信息, 但对植物抗旱机制的了解仍然十分匮乏。其中， 限制人们对抗旱机制深入了解的一个重要因素就是植物抗旱机制的复杂性和多样性，这种抗旱机制的复杂性决定了不是所有的机制都可通过拟南芥等植物来加以揭示。因此利用特殊生境植物来研究相关基因的表达对揭示植物对环境适应机制有着极为重要的价值。 我们实验室以复苏被子植物旋蒴苣苔（Boea hygrometrica (Bunge) R Br.，牛耳草）为实验材料，开展了多方面的工作，以期从复苏植物的角度加深人们对抗旱机制的了解。目前我们实验室已成功地建立了利用cDNA微阵列技术研究牛耳草基因表达谱的体系，并比较了4562个cDNA克隆在干旱前后的表达差异, 发现434个cDNA在干旱条件下表达水平增加一倍以上。 本工作是在上述工作的基础上，对这些表达差异的cDNA克隆并测序，利用Northern blot进一步验证这些基因。序列分析表明，这434个cDNA片段实际上代表着42个基因。根据序列同源性分析表明其中36个克隆与已知功能的基因具有同源性，它们分别是细胞壁相关基因、LEA基因和糖类、抗氧化酶类的编码基因等。另外，4个克隆未能找到同源序列，这可能意味着它们是一些新基因；2个克隆虽找到同源基因但功能未知。36个克隆中有3个编码的是细胞壁相关基因，它们在干旱早期就被诱导，而编码LEA蛋白的基因在干旱中期或后期大量诱导，这说明牛耳草耐旱反应的启动是程序化的，随干旱时间的延长和程度的加强，一步步地启动相应的基因来发挥作用，多方面地对植物细胞进行保护和修复。 本实验室的前期工作表明牛耳草脱水复水过程中细胞超微结构分发生了明显变化，其中细胞壁脱水时发生折叠复水时恢复原状。鉴于细胞壁如此显著的变化及其重要作用，我们以两个细胞壁相关的基因BhGRP1和BhGLP1为对象，对其表达的时间空间特点和对不同胁迫信号的应答、编码产物的理化性质、过量表达或抑制表达的转基因植物的表现型及转基因植物对不同逆境胁迫的抗/感性状等方面的进行研究，综合分析其在耐旱反应中可能参与的代谢途径或信号途径，以期为揭示牛耳草耐旱复苏机制提供有力的佐证。 我们利用Northern blot和半定量RT-PCR对两基因进行了表达模式分析，发现BhGRP1在干旱早期被诱导，干旱后期其转录本水平下降。而BhGLP1在早期诱导后一直保持高的表达。两者在不同胁迫、激素等处理下都有不同的响应。经PSORT分析两基因编码的蛋白都具有N-端信号肽，意味着两蛋白定位于胞外基质。构建BhGRP1-GFP和BhGLP1-GFP融合蛋白进行亚细胞定位分析，质壁分离后BhGRP1-GFP的信号仅保留在细胞壁，而BhGLP1-GFP则在胞壁胞膜上都存在。过量表达BhGRP1后发现它能赋予植物更强的耐旱复苏能力及机械强度，而抑制GLP表达的植株的抗旱性明显弱于野生型，表明BhGRP1和BhGLP1与牛耳草的耐旱复苏有密切的关系。

酵母拮抗菌和外源水杨酸对核果类果实抗病相关基因的诱导表达

在果实采后贮藏过程中，病原真菌的侵染会引起果实腐烂，造成巨大的经济损失。利用生物和非生物因子诱导果实抗病性，已经成为采后病害防治领域的一个研究热点。本文主要利用RT-PCR和RACE技术克隆果实抗病相关基因，通过分子杂交和蛋白羰基化免疫检测技术，研究了外源SA和酵母拮抗菌诱导果实抗病性机理，结果表明： 1. 通过优化RNA提取方法，能从含有多糖的冬枣、葡萄、甜樱桃、桃、番茄等果实中提取到质量较好的RNA，用于RT-PCR和Northern杂交。 2. 采用RT-PCR和RACE方法，从甜樱桃果实克隆了两个抗氧化相关基因CAT2（Genbank：EF165590）和GPX（Genbank：EF165591）和两个PR基因GLU-1（Genbank：EF177487）和GLU-3（Genbank：EF177488)。其中CAT2全长cDNA序列为1479 bp，编码492个氨基酸；GPX全长cDNA序列为513 bp，编码170个氨基酸；GLU-1全长cDNA序列为1050 bp，编码349个氨基酸；GLU-3部分cDNA序列为454 bp，编码141个氨基酸。 3. 酵母拮抗菌Pichia membranaefaciens处理不同成熟度的甜樱桃果实，能显著降低果实贮藏期间青霉病（Penicillium expansum）的发生，并且对低成熟度果实的病害防治效果更为明显。酵母拮抗菌的抑病机理与减轻了甜樱桃果实蛋白羰基化程度，诱导了果实抗氧化酶基因（CAT和GPX）和PR基因（GLU-1）的表达和提高了抗氧化酶（CAT和GPX）和β-1,3-葡聚糖酶的活性有关。 4. 四种酵母拮抗菌P. membranaefaciens, Cryptococcus laurentii, Candida guilliermondii和Rhodotorula glutinis处理桃果实，可显著降低贮藏期间的褐腐病（Monilinia fructicola）。这是由于酵母拮抗菌能抑制病原菌侵染造成的氧化胁迫和蛋白羰基化。此外，酵母拮抗菌处理还能显著诱导CAT、POD、几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶活性及相应基因的表达。 5. 水杨酸（SA，2 mM）处理采后不同成熟度的甜樱桃果实，能显著降低青霉病的危害。其抑病机理与SA处理能减轻P. expansum侵染引起的果实蛋白羰基化程度，显著提高CAT、GPX和β-1,3-葡聚糖酶基因的表达和相关的酶的活性有关。而2 mM的SA处理对P. expansum的生长没有直接抑制作用。 6. 水杨酸（SA，2 mM）与P. membranaefaciens（1×108 CFU/ml）配合处理能显著降低低温贮藏期间桃果实的褐腐病，并能提高几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶和POD的活性和相关基因的表达。另外，2 mM的SA对拮抗菌P. membranaefaciens的生长没有影响，但能够抑制病原菌M. fructicola的孢子萌发和菌丝扩展。

豌豆Lhcb2 基因的克隆、表达、功能分析及其克隆化蛋白与色素体外重组系统的建立

Lhcb2基因是LHCII基因家族中的一个重要成员。目前，对于其特性、结构和功能还不清楚。本文对豌豆Lhcb2基因的克隆、表达、功能及其在大肠杆菌中的表达产物与色素在体外的重组进行了比较系统的探讨，主要的结果如下： 1．采用RT-PCR技术，从豌豆幼叶中克隆了一个约800 bp的Lhcb2 cDNA。以特异探针进行Southern杂交的结果初步证明，Lhcb2基因以单拷贝形式存在于豌豆基因组中，这在文献中尚未见报道。 2．不同光照时间和温度对豌豆幼苗进行处理的RT-PCR，Northem blotting分析表明，Lhcb2基因转录水平上的表达受光照的控制，且明显地表现出对光照时间的依赖性。用400 μmolm-2.s-1的白光照射0～1.5小时Lhcb2基因未见表达，而在光照2小时以上则大量表达，推测该基因的表达可能要求某种(或某些)需光中间物的合成和积累。温度对Lhcb2基因的表达亦有显著的影响，相同的光照处理，4 ℃下Lhcb2基因的表达量比25℃下的表达量低一倍左右。 3．将豌豆Lhcb2基因反向插入植物表达载体pBIl21中，构建CaMV 35S启动子控制下反义Lhcb2基因的植物表达载体pBIantiLhcb2，通过农杆菌LBA4404介导，在Kan浓度为100 mg／L的筛选培养基上，获得120个抗Kan阳性植株。PCR检测表明至少有80个抗性植株为PCR阳性反应。Southern blotting分析表明，外源反义Lhcb2基因已整合到烟草基因组中。转基因植株在表型上主要表现为三大类型：叶色类似于未转基因的绿色植株、叶色发黄的植株、叶色发白甚至枯死的植株。这几类转基因植株光谱特性的分析表明，Lhcb2基因不仅影响光能的捕获，而且还可能参与激发能分配的调节作用。 4．将豌豆的Lhcb2基因亚克隆至原核表达载体pET-3d上，通过定点突变使其在大肠杆菌BL2l(DE3)中得到高效表达，其表达量约占大肠杆菌总蛋白的40％，并经纯化后获得了电泳纯的Lhcb2蛋白。应用改进的液氮／室温冻融重组方法将纯化的蛋白与色素进行体外重组，建立了高效的重组系统。实验结果表明重组后所获得的LHCB2单体与用生化方法从菠菜类囊体膜中分离纯化的天然LHC II单体相比较，其在部分变性胶的电泳行为，低温荧光发射光谱和激发光谱，以及室温吸收光谱和CD光谱的特征等方面都非常相似，说明大量表达的Lhcb2蛋白与色素已成功地重组，并具有与天然的LHCII单体相类似的组成和结构，这在国际上尚属首次。在此基础上又构建了N端和C端氨基酸残基缺失的突变体，并对这些缺失的氨基酸残基在LHCB2中的可能作用进行了初步的研究。结果表明，N端的前12个氨基酸残基、C端的前10个氨基酸残基和第11位的色氨基酸残基对LHCB2单体的形成不是必需的。 此外，从菠菜中纯化了LHCII，并对其多肽和色素组成及其光谱特性进行了比较系统的研究。同时对用不同浓度OGP和Mg2+处理所获得的不同聚集程度的LHCII的光谱特性进行了研究，并对Mg2+在其中的可能作用进行了初步的探讨。

高亲和力PO4(3-)转运子编码基因的cDNA克隆及特性分析

以简并引物，利用RT -PCR，克隆了普通小麦和黑麦根系的PO 43-转运子( Trans-porter)基因长约1.2kb的部分cDNA序列。对其与GenBank中的已知序列进行同源性比较，结果表明：(1)小麦与拟南芥、番茄等高等植物的氨基酸水平的同源性为60%～78%; (2)与酵母较低为40%左右，而与丝状真菌和细菌的同源性则<27%; (3)小麦与黑麦的同源性为75%。对其表达特性的研究表明：(1)该基因在根系和茎叶组织中均有表达，但在根系组织中转录产物的累积量显著高于茎叶;(2)磷饥饿条件下，茎叶和根系组织中该基因的表达均增强，但根系组织中增强幅度较大，由此认为该基因产物的功能不只是根系从生长环境中吸收PO 43-，而与PO 43-在植物体内的转运密切相关;(3)磷饥饿5天 后的植株重新供给充足的PO 43-，则该基因的表达在24小时内即显著减弱;(4)分根试验中同株的部分根系生长于磷饥饿(OuM)环境中，而另一部分根系生长于PO 43-充足(250uM)的环境中，这两部分根系中该基因转录产物的积累水平并无显著差异。因此认为植物感受磷饥饿胁迫的信号可能来自植物体内部POi-库的耗竭。此外，用磷讥饿条件下的普通小麦根系mRNA构建了cDNA文库，以克隆的部分序列为探针，从cDNA文库中分离了全长序列。

谷子和甘蔗C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及其转基因水稻光合效率的提高

水稻是我国重要的粮食作物之一，它是一种典型的C3植物。与其它C3作物不一样的是，水稻的生长需要相对较高的温度和充足的阳光照射。然而高温和高光强的生长环境更加适合于C4植物的生长，更加有利于发挥C4植物高光合效率的特点。因此本论文希望将C4植物中固定CO2的酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因导入水稻，获得一种更加适合高温和高光强生活环境的“C4型”水稻，这对于提高水稻的产量，满足人口增长对粮食需求具有重大意义。 本论文从C4植物谷子和甘蔗中克隆了其C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶cDNA基因，获得了具有自主知识产权的基因克隆，并将它们导入粳稻品种中花8号，进而对转基因材料的光合生理特性进行了研究。结果如下： 首次从谷子中得到了ppc基因两个cDNA克隆，分别命名为Mppc1和Mppc2。前者是一个C3型的ppc基因，它可能属于在根中特异表达的C3-2型ppc基因;后者是在绿色叶片中大量表达的C4型ppc基因。它们所编码的蛋白的氨基酸残基数分别为961和964，序列同源性为82.5%。C4型PEPC多出的3个氨基酸位于N末端。利用RACE的方法我们得到了谷子C4型ppc基因完整的cDNA序列，包括63bp的5'非编码区，2895bp的编码区和256bp的3'非编码区。 首次获得了甘蔗C4型ppc基因完整的cDNA序列的克隆，命名为Sppc。它包括95bp的5'非编码区、2886bp的编码区，和224bp的3'非编码区。 利用所克隆的基因，分别连上强组成型启动子Ubiquitin启动子和强光调控启动子Rubisco小亚基启动子后，再插入两个标记基因不同的表达载体pCB和pPCB的多克隆位点中，构建了八个含有外源ppc基因的植物表达载体pCB-Pubi-Mppc、pCB-Pubi-Sppc、pCB-PrbcS-Mppc、pCB-PrbcS-Sppc、pPCB-Pubi-Mppc、pPCB-Pubi-Sppc、pPCB-PrbcS-Mppc和pPCB-PrbcS-Sppc。再加上含有玉米完整的C4型ppc 核基因的载体pCB-ZMppc，共有9个载体。利用农杆菌介导法进行了水稻的转化，各个载体都获得了大量的转基因植株。对标记基因潮霉素磷酸转移酶基因hpt和磷酸甘露糖异构酶基因pmi以及导入的目的ppc基因的PCR扩增检测，结果显示绝大多数转基因植株都能扩增出目的片段，而未转化的植株则没有扩增产物。对部分转基因水稻的Southern和Western杂交以及RT-PCR分析都表明，无论从DNA水平、mRNA水平，还是从蛋白质水平上都证明外源ppc基因都成功地导入了水稻，并获得了正确的表达。 对各载体转基因植株PEPC活性大规模的测定表明，转入玉米完整C4型PEPC核基因（有内含子）的水稻表现出极大的表达效率，大多数转基因材料的PEPC活性为对照的10-20倍，其活性最高可达到对照的44倍。转入谷子和甘蔗PEPC基因cDNA的水稻，表达的效率很低，多数材料活性增加仅为对照的2-5倍，但也有极少数材料活性增加了10倍以上。用Rubisco小亚基启动子控制的ppc基因在水稻的表达活性要略高于Ubiquitin启动子控制的ppc基因。以上结果说明ppc基因的内含子在其转录或mRNA的稳定上起着重要作用。 对部分转基因材料气体交换特征的研究发现，随着转基因水稻PEPC活性的增加，净光合速率也有逐渐增加的趋势。其中PEPC活性最大的ZM24株系的三个单株净光合速率比对照增加了39.8%、13.7%和28.6%，而它们的PEPC活性比对照分别增加了21.2、21.9和23.6倍。 转PEPC水稻的净光合速率与气孔导度具有显著的相关性。这说明表达的外源ppc 基因产物PEPC参与了转基因水稻的气孔运动，使气孔开放程度增加。更有意义的是过表达PEPC的水稻具有更高的水分利用效率，这就增加了其耐旱能力。在光抑制条件下转基因水稻也具有更高的光合能力。这些特征表明转ppc基因的水稻比对照更加适合于水稻高温高光强和干旱的原生环境。

抗氧化剂对大豆下胚轴GUS基因瞬时表达率的影响

大豆是我国最重要的油料作物之一，在我国的农业乃至幽民经济中占有重要地位。但是，由于我国人豆品质较差、产量较低，严重地影响着我国的大豆牛产及其在国际市场上的竞争力。农杆菌介导的转基因方法是大豆改良的最简便和最经济的方法之一，然而大豆基因转化效率低一直是大豆基因工程的主要限制因素。本研究以含有GUS报告基因和NPT II筛选基因的农杆菌1301侵染大豆子叶节和下胚轴，并用组织化学定位法测定GUS基因在叶节和下胚轴上瞬时表达，研究了抗氧化剂对提高大豆基因转化效率的影响，为建立大豆高效基因转化体系奠定基础。 以子叶节为外植体，用农杆菌侵染和共培养后进行GUS染色，观察其瞬时表达情况。在培养基中不含抗氧化剂的情况下，子叶节上未发现染色点，仅在下胚轴侧面有极少染色点。而在培养基巾含有抗氧化剂的情况下，外植体上产生了人量GUS染色点，其中大部分位于下胚轴处，子叶节部位几乎很少被染色。这说明下胚轴比f叶节更容易接受外源基因。本论文分别以子叶节和下胚轴为外植体进行研究。 以子叶节为外植体，在抗氧化剂作用下用农杆菌侵染，诱导丛生芽，在含有潮霉素的筛选培养基上培养，以筛选抗性苗。实验只得到一株抗性幼苗。 为了进一步研究抗氧化剂对GUS暴凶在下胚轴中瞬时表达的影响，我们特别以下胚轴为外植体，测定了多种条件下的瞬时表达率情况。 我们研究了共培养时间对大豆下胚轴基因瞬时表达率的影响，通过确定合适的共培养时间以获得最佳转化率。在共培养2天后，GUS基因的表达率是8%，但是在3天后，GUS基因瞬时表达率大幅度上升，达到23.4%。随后两天GUS基因瞬时表达率没有太大变化，因此，大豆下胚轴的GUS基因瞬时表达的最适共培养时间为3天。 农杆菌再悬浮液稀释浓度对大豆下胚轴GUS基因瞬时表达也有较大影响：再悬浮培养基与农杆菌菌液等体积时，GUS基因瞬时表达率最高，随稀释浓度提高，转化效率降低。这说明随农杆菌菌液浓度提高，侵染几率增加，从而提高了GUS基因的瞬时表达率。 很多研究表明大豆基因转化存在很大的品种问差异，我们选择了四种基因型差异较大的品种在上述最佳条件下分别测定了GUS基因瞬时表达率，但没有发现品种之间存在显著差异，说明抗氧化剂在大豆下胚轴基因转化中具有品种普遍适用性。 上述研究结果表明抗氧化剂能够大大促进GUS基因在下胚轴的瞬时表达，这对于今后开展大豆基因组研究和品质改良工作具有一定意义。

二脂酰甘油酰基转移酶基因(DGAT1)的沉默对烟草油脂合成的影响

二脂酰甘油酰基转移酶 (DGAT; EC 2.3.1.20) 是催化三脂酰甘油（TAG）合成的最后也是最关键步骤的酶。TAG是真核细胞中最重要的能量存储形式。在植物中，TAG主要在种子、花粉和许多物种的果实中积累。然而，DGAT1基因的转录本也存在于植物的其它器官中，这些器官包括根、茎、叶、花瓣、花粉囊、未成熟的角果、幼苗以及正在发芽的种子等。迄今为止，许多针对DGAT1基因的研究都集中于DGAT1基因的表达在对种子油脂的积累以及对种子中TAG的脂肪酸组成所起的作用上。在本研究中，我们通过构建烟草DGAT1基因带有内含子的发卡RNA（hpRNA）结构，使之在转基因烟草植株中表达双链RNA（dsRNA），利用RNAi原理达到使烟草内源DGAT1基因沉默的目的。转基因沉默烟草植株的获得将会为更好地研究DGAT1基因的功能奠定基础。本实验不仅研究分析了DGAT1基因的抑制对烟草种子油脂积累的影响，还对表现出沉默性状的转基因植株Sil7的不同器官中TAG的含量以及DGAT1的转录水平等进行了研究分析。此外，通过对转基因烟草不同株系种子中的主要贮藏物质——油脂、蛋白质和糖的含量测定，初步揭示出在烟草种子中三者生物合成代谢之间存在的相关性。主要研究结果如下： 采用烟草DGAT1基因的第615～1293碱基之间679bp的片段构建了能表达发卡RNA（hpRNA）结构的表达载体，并转化烟草（Nicotiana tabacum）Wisconsin 38。Northern杂交分析发现,与野生型对照烟草（WT）相比，在沉默植株的花和发育状态种子中DGAT1基因的转录水平有很大降低，这表明该发卡结构能够高效率地引起烟草DGAT1基因的沉默。此外，在对Sil1至Sil12共12株转基因烟草进行油脂含量分析的结果表明，其中有8株表现出油脂降低的性状，转基因沉默效率达到67％。这表明：利用RNAi的方法可对目标基因进行特异降解来研究基因的功能，因此是一个在研究基因的表达功能上十分有效的方法，而且已成为植物基因工程的有力工具。 为了研究DGAT1基因的沉默对转基因植株不同器官的影响，本实验分析了转基因植株Sil7的不同器官中TAG的含量和脂肪酸组成，并采用RT-PCR方法对野生型对照和转基因植株中DGAT1基因的转录水平进行了比较分析。研究发现，转基因植株不同器官中DGAT1基因转录水平的降低与各器官中TAG含量的减少呈正相关。由此看来，植物中DGAT1的表达水平与植物的各个器官内TAG的含量之间存在着一定的对应关系。此外，在转基因植株Sil7不同器官中依然能够产生TAG，这说明或者DGAT1酶活性丧失而由其它的酶（如DGAT2和PDAT）参与TAG的合成，或者DGAT1酶活性只是部分地受到影响。本实验还对Sil7的根、茎、叶、花瓣和种子中TAG的脂肪酸组成进行了分析，结果发现，与烟草野生型对照相比，在Sil7的这些器官中，除种子中TAG的脂肪酸组成无明显变化外，其余器官中TAG的18:3/18:2脂肪酸比例均有明显升高。 对其中8株转基因烟草种子进行油脂含量分析发现，在转基因烟草中由于DGAT1基因的沉默引起种子中TAG含量的减少，从而引起了种子平均千粒重的下降。而在TAG含量和种子平均千粒重下降的同时，种子中其它贮藏物质－蛋白质和糖类的含量却增加了。该实验结果表明：在烟草种子中TAG的生物合成与蛋白质和糖类物质的合成之间存在着负的相关性。

根瘤菌在植物内的迁移运动及其与植物相互作用的蛋白质组学研究

根瘤菌不但可以在豆科植物的根部形成共生固氮的根瘤，而且还可以在自然条件下与重要的谷类作物的根形成内生的联合作用。尽管内生菌在植物中广泛存在，但是关于根瘤菌在植物根内的定殖方式还有许多未知。根瘤菌作为内生菌与水稻相互作用的分子机制目前还不清楚。本研究应用显微镜观察、分子生物学和蛋白质组学的研究技术，对内生根瘤菌与植物相互作用，并促进生长的机制进行了探索。 我们用带有gfp标记的根瘤菌分别接种非豆科植物水稻、烟草和豆科植物，应用激光共聚焦显微镜和平板分离，检测其在健康植物组织内的侵染、定殖和分布过程及其对植物生长生理的影响。结果表明： 1．根瘤菌对水稻的侵染是一个动态的过程，它开始于根际表面的定殖，然后从根的裂隙进入根内，向上迁移到叶鞘和叶部分，并且发展为较高的群体密度。水稻接种不同种类的根瘤菌，显著增加了根和地上部分的生物量，提高了光合速率、气孔导度、蒸腾速率、水分利用效率和旗叶的叶面积，并且在植物体内积累了更高浓度的植物激素（生长素和赤霉素）。 2．根瘤菌同样可以在烟草体内由根部向植物地上部分的茎、叶迁移，并从叶的气孔溢出到叶的表面，具有附生－内生－附生生活方式的转换。同时，根瘤菌还可以沿植物的表面从根到地上部分迁移。在植物的生殖生长阶段，内生根瘤菌仍然保持活动性，可以进入烟草子房的子房壁、胎座和胚珠内，暗示根瘤菌通过种子向子代垂直传播的可能性。 3．根瘤菌与豆科植物形成共生固氮根瘤的同时，还可以以内生菌的生态方式定殖于豆科植物中，同样有类似于水稻、烟草的方式在体内由根向地上部分迁移。这种定殖和迁移与根瘤菌胞外多糖和鞭毛的有和无没有关系。 内生根瘤菌促进植物生长的原因是人们一直关心的问题。将根瘤菌固氮正调控基因nifA的启动子与gfp基因构建成融合质粒，设计其他nif相关基因的引物，对有内生根瘤菌的水稻和豆科植物的RNA，进行RT-PCR，表明，虽然定殖于豆科植物体内的内生根瘤菌nifA基因有表达，但是其他的nif基因不表达，因而内生根瘤菌对植物的促生作用不是固氮作用的结果。 我们还用蛋白质组学的方法，分析了Sinorhizobium meliloti 1021和Azorhizobium caulinodans ORS 571接种水稻根部后的植物根、叶鞘和叶组织的蛋白质表达的差异变化。结果表明Sinorhizobium meliloti 1021接种水稻引起的差异蛋白在根内有21个，叶鞘内有19个，叶内有12个;Azorhizobium caulinodans ORS 571接种水稻引起的差异蛋白在根内有7个，叶鞘内有 8个，叶内有8个。蛋白功能的归类中有防卫反应、光合作用、植物生长素、碳和能量代谢及氮代谢相关蛋白的变化。特别是光合作用、植物生长素等相关蛋白的表达，与生理测定光合作用和生长素有提高是一致的，为内生根瘤菌促进水稻生长提供了一个方面的分子证据。 综上所述，表明内生根瘤菌和植物的联合作用比以前所认识的更为复杂，更具有侵染力和动态性。因此，本研究提高了人们对根瘤菌的新认识，不仅与豆科植物根部结瘤，进行共生固氮，而且以内生菌与水稻等植物联合，提高光合作用和生长素含量，促进生长，从另一个方面补充了根瘤菌对植物的有益作用，为根瘤菌作为广谱生物肥料的发展策略奠定分子基础，对可持续农业有重要意义。

高等植物光系统II大量捕光色素蛋白复合体的稳定性研究

光合作用是地球上最重要的化学反应，它主要发生在叶绿体的类囊体膜上。光能是整个光合作用反应的驱动力，因此光能的捕获和传递过程将会直接影响整个生物体的光合作用表现。在高等植物中，光系统II（PSII）的大量捕光色素蛋白复合体（LHCIIb）作为最主要的、含量最多的光能捕获和传递器官，在光合作用过程中发挥着极其重要的作用。经过数十年的研究，认为LHCIIb主要的功能有以下四个方面：捕获和传递光能、光保护和过剩能量耗散、调节光能在两个光系统中分配和维持类囊体膜的结构。同时对其空间结构也在2.72Å的水平上进行了解析，发现每个单体含有14个叶绿素分子（Chl），其中8个叶绿素 a（Chl a）和6个叶绿素 b（Chl b），2个黄体素（Lut），一个新黄质（Neo）和一个紫黄质（Vio），3个跨膜α-螺旋和2个双亲α-螺旋。尽管目前对其空间结构和基本功能有了初步的了解，但以往研究均是对LHCIIb的三个色素蛋白复合体（Lhcb1、Lhcb2和Lhcb3）的混合研究，而关于Lhcb1、Lhcb2和Lhcb3各自的氨基酸组成、色素组成、各种光谱性质和稳定性研究还处于起步阶段。对Lhcb1、Lhcb2和Lhcb3各自的特性研究可以使我们更加深刻地理解LHCIIb的结构和功能。 本论文首先利用RT-PCR技术从豌豆（Pisum sativum L.）中提取了编码大量捕光色素蛋白复合体的三个脱辅基蛋白基因，分析了它们编码蛋白的氨基酸序列，并系统地研究了三个蛋白与其他物种中的三个蛋白之间的亲缘关系;然后在体外进行了成功的表达和与色素重组，进而对重组LHCIIb的色素组成及光谱特征进行了系统地对比和研究。实验结果表明，Lhcb1和Lhcb3的保守性高于Lhcb2，且Lhcb3最高，Lhcb1和Lhcb2的蛋白序列相似程度高于Lhcb3;Lhcb1同质三聚体的Neo含量和α-螺旋含量高于Lhcb1单体，Lhcb2单体和Lhcb3单体的α-螺旋含量高于Lhcb1单体;与Lhcb1单体和Lhcb2单体相比，Lhcb1同质三聚体和Lhcb3单体的荧光发射光谱明显红移，与核心复合物的光谱特征更加接近，这一区别可能更加有利于能量向核心传递;吸收光谱中表明，Lhcb1和Lhcb2存在两个Chl a吸收峰，根据分析超快吸收得到的模型（Amerongen & Grondelle，2001），这两个吸收峰可能代表Chl a的两个吸收中心。 在对LHCIIb各种基本特性研究的基础之上，本论文使用三氟乙酸（TFA）、离液剂尿素、离子性去污剂SDS、非离子型去污剂Triton X-100对Lhcb1单体进行了处理，使用不同温度对Lhcb1单体和同质三聚体、Lhcb2单体和Lhcb3单体进行处理。研究了它们在不同条件下的稳定性，主要结果如下： 1) 低浓度的尿素不能使Lhcb1变性，但可以影响色素之间的能量传递效率和相互作用。尽管SDS可以使Lhcb1解体，但解体后的蛋白仍旧保留了部分α-螺旋结构。TFA和非离子型去污剂Triton X-100可以使Lhcb1完全解体，并且可以完全破坏蛋白α-螺旋结构，TFA主要是通过影响色素结构和增加蛋白内部的分子间排斥力来破坏Lhcb1，而Triton X-100主要是通过破坏疏水作用力来破坏Lhcb1。高温可以使LHCIIb解体，但不能使蛋白二级结构完全消失。 2) 尿素、温度和Triton X-100均不引起色素本身的破坏，SDS和三氟乙酸使氢置换叶绿素卟啉环所螯合的镁离子，产生去镁叶绿素，造成色素本身结构的严重破坏。 3) 随着温度的升高，色素蛋白复合体的结构和功能会遭到破坏。在Lhcb1和Lhcb2中首先被破坏的是长波长吸收的Chl a。 4) .就功能而言，Lhcb1同质三聚体最为稳定，其次为：Lhcb1单体 > Lhcb3单体 > Lhcb2单体;.就结构而言，Lhcb1单体和Lhcb1同质三聚体相似，稍微较Lhcb2和Lhcb3稳定。 5) 不同处理方式均发现色素蛋白复合体的变性过程依次为：以Chl a为主的相互作用消失，其后依次为以Chl b为主的相互作用消失，以类胡萝卜素为主的相互作用，最后消失的是蛋白的二级结构。在结构受到破坏的同时，能量传递最先受到影响。 6) 解体过程并不是折叠过程的逆过程。

RNAi沉默光合膜磷脂合成酶基因的研究

磷脂是动物和植物非光合组织细胞膜系统的主要组成成分，在细胞生命过程中扮演着重要角色。尽管绿色植物光合膜的的甘油脂主要是糖脂，但是它仍然含有大约10％的磷脂，说明磷脂在光合膜的结构和功能中起重要作用。构成生物膜的磷脂有多种，但是，光合膜只含有磷脂酰甘油（PG）一种磷脂。光合膜中的PG有其特殊性，即：在PG的sn-2位上总连着一个棕榈酸（16:0）或者反式十六碳烯酸（16:1trans），说明了这种具有特殊结构的甘油脂在维持类囊体膜的结构和功能方面具有重要的作用。 叶绿体中有两个重要酶参与了PG的生物合成，它们分别是胞嘧啶二脂酰甘油合成酶（CDS）和磷脂酰甘油合成酶（PGS）。本实验以烟草和马铃薯为材料，利用RNAi技术，对CDS和PGS基因的表达进行抑制，通过PG缺失突变体，研究其功能。 对转含有PGS片段的沉默结构的转基因烟草叶片膜脂进行了分析，结果表明，与野生型烟草相比较，其PG含量下降了约20%，同时，SQDG和PC的含量增加。PG含量的降低没有引起MGDG和DGDG含量的变化。另外，我们还对转基因植株目的基因片段的RNA表达水平进行了RT-PCR分析，发现其表达量大幅度降低。这些结果表明，在转基因株系中，PGS基因的表达受到了抑制，说明我们获得了PG部分缺失的烟草PGS突变体。 对烟草PG缺失体的PG脂肪酸组成进行分析，表明其特征性脂肪酸反式十六碳烯酸含量明显下降，比野生型降低了44%，C18:0、C18:1和C18:2的相对含量增加，整个变化与总脂脂肪酸变化基本一致。 为了研究PG缺失对光合作用的影响，我们分析了多种光合指标。对叶绿素含量的分析表明，PG含量的降低影响了光合色素的组成。PG部分缺失的转基因烟草中的叶绿素总的含量下降，其中叶绿素b含量下降更为明显，结果，叶绿素a与叶绿素b的比值较野生型高。转基因植株净光合速率下降，二氧化碳利用率降低;PSII的最大光化学效率（Fv/Fm）和实际光化学效率（фPSII）降低，光化学猝灭下降，非光化学猝灭增加，尤其老叶的变化更为明显。这些结果说明了PG的部分缺失影响了植株的光合能力，捕光色素蛋白复合体的结构受到了影响，PSII功能遭受损伤。 同时，我们根据已经报道的马铃薯CDS基因，克隆了一个片段，构建沉默结构，并对沉默结构进行了转化。通过抗性基因的筛选以及RT-PCR检测，证明了沉默结构转化成功，目的基因的表达受到抑制，获得了马铃薯CDS转基因植株。 对马铃薯野生型和CDS转基因植株进行膜脂和脂肪酸分析表明，转基因植株叶片的PE、PG和PC等磷脂含量降低，SQDG和DGDG含量增加;C16:1（3t）、C16:2、C16:3、C18:1和C18:2含量下降，C16:0和C18:3含量增加，而C16:1和C18:0变化不明显。马铃薯CDS转基因植株的叶绿素荧光分析表明，PSII最大光化学效率降低，从野生型的0.82下降到0.77。

蓝藻谷氨酰胺酶的酶学特征及生理功能研究

谷氨酰胺酶是催化谷氨酰胺分解为谷氨酸的氨基酸水解酶。它广泛存在于真核生物和原核生物中，在许多微生物和哺乳动物的氮代谢过程中起重要作用。但蓝藻中谷氨酰胺酶的酶学特征及生理功能尚不清楚，仅在一些蓝藻的基因组中发现有假定谷氨酰胺酶基因，这些基因编码的未知功能蛋白中有谷氨酰胺酶功能结构域，如集胞藻6803基因组中的slr2079基因。因此，本研究以模式蓝藻集胞藻6803 为研究对象，研究蓝藻谷氨酰胺酶的酶学特征及其生理功能。 为研究蓝藻谷氨酰胺酶的酶学特征，本研究克隆了集胞藻6803 slr2079基因，并在大肠杆菌中融合表达，经Ni-NTA亲合柱纯化后，通过对重组蛋白进行酶活测定及动力学分析，发现Slr2079蛋白是以谷氨酰胺为唯一催化底物的谷氨酰胺酶。 重组酶Slr2079的最适反应pH为9;最适反应温度为37C - 42C。该酶和绝大多数微生物源性的谷氨酰胺酶一样均为非磷酸依赖型。有趣的是该酶活性受Na+调节，而这种调节是通过提高对底物的亲和力来实现的。 为研究蓝藻谷氨酰胺酶在细胞内的生理功能，本研究通过基因插入失活，构建了缺失slr2079基因的集胞藻6803突变体，并对其进行生理、生化研究。在正常生长条件下，突变体和野生型蓝藻的生长未见差异，表明该基因不是集胞藻6803生长所必需的基因。但在700 mM NaCl胁迫条件下，突变体的生长速率比野生型快1.25倍。半定量RT-PCR结果显示，几个盐胁迫相关基因在突变体与野生型中的表达有所不同：与耐受盐胁迫的相关基因slr1608 (gdhB) 和slr1751 (prc)在突变体中表达提高，而盐敏感的基因sll0262 (desD) 和 slr0213 (guaA)在突变体中表达下降。由于重组的Slr2079具有谷氨酰胺酶活性，因此我们试图通过检测在蓝藻中参与氨同化作用的关键酶谷氨酸合成酶和谷氨酰胺合成酶在集胞藻6803中的表达情况来揭示Slr2079在集胞藻6803谷氨酰胺代谢中的生理功能。半定量RT-PCR结果显示，仅谷氨酸合成酶在突变体中表达提高，而谷氨酰胺合成酶表达未见明显变化。这些研究结果表明，在集胞藻6803中，Slr2079可能是通过调节与盐胁迫相关基因的表达来参与应对盐胁迫，而在氮代谢中起次要作用。

烟草单半乳糖甘油二酯缺失对茉莉酸生物合成的影响

茉莉酸（JA）是由脂肪酸衍生而来的环戊酮化合物，广泛存在于自然界中，在植物逆境胁迫响应和生长发育调节过程中起重要作用。因此，JA被认为是一种新型植物激素。植物JA生物合成的最初底物是三烯脂肪酸（含有三个双键的十八碳和十六碳脂肪酸，18:3和16:3），这些脂肪酸经过脂氧合酶（LOX）、丙二烯氧化物合酶（AOS）和丙二烯氧化物环化酶（AOC）等一系列酶促反应，最终生成JA。JA生物合成所需要的三烯脂肪酸来自叶绿体膜脂。高等植物叶绿体类囊体膜含有四种极性甘油脂，它们是：单半乳糖甘油二酯(MGDG)、双半乳糖甘油二酯(DGDG)、硫代异鼠李糖甘油二酯(SQDG)和磷脂酰甘油(PG)。但是人们尚不清楚JA生物合成所需要的三烯脂肪酸主要来自哪一种膜脂。 最近，我们利用RNA干扰技术获得了烟草MGDG部分缺失的突变体。MGDG是质体中最重要的甘油脂，其含量高达50%，其中含有的三烯脂肪酸约占总脂中三烯脂肪酸含量的65%。本研究的目的是以烟草MGDG缺失的突变体（mgd1）为材料，通过研究MGDG缺失对茉莉酸生物合成的影响，阐明半乳糖脂与JA生物合成的关系。 首先我们对野生型烟草（WT）和mgd1的相关生物学特性进行了研究，包括甘油脂和脂肪酸组成。结果表明，mgd1烟草叶片中MGDG含量降低了57％，同时，其三烯脂肪酸相对含量也大幅度降低。其中十六碳三烯酸（16:3）降低了78%，亚麻酸（18:3）含量减少了28%。因此，由于MGDG缺失，类囊体中的三烯脂肪酸降低了27%。这一结果说明了JA生物合成的底物大幅度减少。 为了说明MGDG缺失导致的三烯脂肪酸含量的减少是否影响到JA的含量，我们利用GC-MS方法比较了WT和mgd1烟草中JA的含量。结果表明，mgd1叶片中的JA含量较WT降低了50%，说明了MGDG的缺失影响了JA的生物合成。 伤害可以诱导JA在短时间内大量合成。我们比较了机械损伤后JA在WT和mgd1叶片中积累的动态过程。伤害同时可以使WT和mgd1叶片中的JA含量增加，并且在1小时达到最大值。但是，JA在两种烟草叶片中增加的幅度不同，WT叶片受伤1小时后JA含量是未受伤时的5倍，而mgd1叶片受伤1小时后，其JA含量只增加了1倍。这些结果说明了MGDG缺失可以严重影响伤害诱导的 JA 的积累，MGDG是JA的生物合成底物的重要来源。 我们进一步研究了MGDG缺失对JA生物合成相关酶基因表达的影响。 LOX1和AOC编码JA生物合成途径中的关键酶LOX和AOC。RT-PCR分析表明mgd1叶片中这两个基因受伤害激活的程度比WT弱。进一步说明突变体中JA合成受到影响。 植物受到伤害时内源JA含量增加，并激活防御基因的表达。我们的结果显示，当植物受伤害后，mgd1叶片中与JA信号转导相关的防御基因HPL，PI-I和PI-II的表达量增加幅度明显低于WT。这说明突变体中JA信号转导途径受到了抑制。 JA在植物对昆虫侵害的防御反应中起重要作用，上述结果表明突变体对伤害响应受到削弱。昆虫饲喂实验显示，棉铃虫更趋向食用mgd1植株叶片，取食mgd1植株的棉铃虫的体重增加较多。这些结果与WT和mgd1在JA含量、防御相关基因表达方面的差异相一致。外源施加茉莉酸甲酯（MeJA）能够恢复mgd1的抗虫性和防御基因的表达，说明JA是恢复mgd1抗虫性所必须的。 上述结果表明MGDG缺失使JA生物合成受到影响，尤其是JA在植物受到伤害后的生物合成。对于这一现象的可能的解释是：MGDG是JA生物合成底物的主要来源，由于mgd1中缺少大量的MGDG，当植物受到伤害时，MGDG不能释放出足够三烯脂肪酸来合成JA，导致其含量降低，破坏了JA信号途径，最终使得植株表现出抗性降低等特性。我们的研究证明了MGDG可以作为JA生物合成的底物来源在JA信号途径中起重要作用。

固氮蓝藻与非固氮蓝藻谷氨酰胺酶的基因克隆、表达及其特性分析

蓝藻是唯一可以进行有氧光合作用的原核生物，是水生食物链主要的初级生产者。氮素是蓝藻细胞必需的大量营养元素之一，揭示蓝藻如何应对环境中氮素的变化、维持自身碳氮平衡的分子机理，对深刻理解蓝藻与环境的相互作用、有效促进或控制蓝藻的生长与繁殖，有重要的理论和实践意义。已有的研究发现，蓝藻细胞的碳氮平衡主要是通过调控氨同化途径中的关键酶类实现。但先前的研究主要集中在固氮蓝藻谷氨酰胺合成酶（GS）-谷氨酸合成酶(GOGAT)循环的特性分析方面，而对催化谷氨酰胺水解生成谷氨酸和氨的主要酶之一谷氨酰胺酶的报道极少，其分子特性及生理学意义尚不明了。因此，本论文以模式固氮蓝藻鱼腥藻7120 和非固氮蓝藻集胞藻6803 为材料，采用分子生物学和生物化学方法，对蓝藻谷氨酰胺酶进行体外研究，并对其生物学功能进行了初步探讨，获得了如下主要结果：1）对体外重组蛋白的酶活性检测发现，两类蓝藻基因组编码的假定性谷氨酰胺酶，均具有谷氨酰胺酶催化活性，表明基因组注释是准确的；2）固氮蓝藻重组酶（All2934、All4774）与非固氮蓝藻重组酶（Slr2079）酶学特征差异显著，具有不同的最适pH、温度及底物亲和力；3）固氮蓝藻重组酶All2934 催化活性受磷酸盐的激活，而非固氮蓝藻重组酶Slr2079 在高Na+浓度下活性更高；4）RT-PCR 分析结果表明，在正常培养条件下，两类蓝藻的谷氨酰胺酶基因在细胞内均有表达；5）在缺氮培养条件下，固氮蓝藻谷氨酰胺酶基因all2934 的表达水平发生明显变化，而all4774 保持相对稳定，表明前者可能在这类细胞应对氮饥饿过程中起重要作用；6）在正常培养条件下，非固氮蓝藻谷氨酰胺酶基因的缺失突变体(Δslr2079)与野生型表型相似，但在盐胁迫条件下，突变体生长速率及光合放氧活性均高于野生型，表明该基因可能在提高非固氮蓝藻细胞高盐耐受力方面起负调控作用。上述重要发现，不仅初步揭示了光合自氧生物谷氨酰胺酶体外重组酶的分子特征，也为进一步研究谷氨酰胺酶在蓝藻细胞内的专一性功能奠定了重要基础。

大豆种子低温吸胀相关基因的分离与蛋白变化的研究

大豆 (Glycine max (L.) Meer.)是人们日常生活中不可缺少的食品，也是一种非常重要的油质、蛋白资源。目前根据大豆种子吸胀阶段对低温敏感性的不同，可将其划分成3种生态型：低温非敏感型、低温敏感型及中间型。对于低温非敏感型的种子来讲，4℃下吸胀24小时对其发芽率影响很小，而敏感型种子萌发率不超过5%。我国属于温带大陆性气候，大豆播种后由于温度波动而造成一部分种子不能萌发，最终导致减产甚至绝产的现象普遍存在。高产是育种工作的主要目标，提高逆境胁迫的适应能力是高产的前提和基础，所以从分子角度研究种子吸胀非常必要，一方面能够挖掘新的基因资源，另一方面为今后育种工作提供必要的理论依据。 本试验以此为立足点，低温吸胀非敏感型大豆品种 (Z22)为材料，利用cDNA-AFLP方法及蛋白质技术分离与低温吸胀相关的基因及蛋白，得到结果如下： 第一，本试验成功的分离出4个受低温诱导的基因，半定量RT-PCR方法进一步验证了这4个基因在种子吸胀24小时内受低温诱导。 第二，利用RACE方法成功的得到2个完整的全长基因，在NCBI数据库中查找后发现其中1个基因为新基因，命名为SCHI基因 (SCHI：Soybean chilling-induced gene)。SCHI全长为390bp，编码分子量大约为14.2KD的蛋白；另外一个基因是已知基因，其同源序列已经在其他的物种中得到分离。由于此基因与核糖体蛋白L34高度同源，所以把把这个基因命名为SOL34 (Soybean L34)。 第三，利用半定量RT-PCR方法对基因表达模型进行分析，结果表明：SCHI在种子低温吸胀18～24小时期间诱导表达量最高，而当种子低温吸胀24小时后转入常温下，其表达量在常温下18小时左右迅速下降；ABA (100μM)、PEG (30%，10000)及NaCl (250mM)能够诱导SCHI的表达，在诱导表达量上，ABA和PEG诱导效果最明显，而NaCl能够微弱的诱导此基因表达；对不同生态型的大豆品种而言，低温吸胀过程中，SCHI在非敏感型种子中的表达量高于敏感型种子，但非敏感型和中间型之间没有差别；另外，SCHI在大豆胚轴中是诱导型表达，在叶片和根尖中则是组成型表达。SOL34的表达在萌发前24小时内被低温诱导，但在不同生态型之间没有差别。SOL34在胚轴和根尖中受低温诱导，在叶片中是组成型表达。 第四，SCHI能够在原核生物中表达出相应蛋白，诱导表达蛋白的分子量在26-29KD，大约为理论值的2倍，说明在大肠杆菌中被表达的蛋白以2聚体形式存在。另外低温试验结果表明SCHI能够提高菌落忍耐短时间-20℃低温的能力。 第五，利用双元表达载体把SCHI转入拟南芥植株，经过低温、干旱和盐胁迫后，转基因植株的成活率均高于野生型植株。超表达SOL34的拟南芥植株降低了对低温的耐性；而抑制拟南芥中L34的表达反而提高了植株对低温的抗性。 第六，本试验利用蛋白质等有关试验检测了大豆种子低温吸胀时蛋白质发生的变化。从吸胀 (4℃和22℃下24h)后的大豆胚轴中成功鉴定出上调蛋白点25个，下调蛋白点15个。其中有参与能量代谢反应 (占10%，例如柠檬酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶等)、细胞生长与分裂相关反应 (20%，例如LEA蛋白和种子成熟蛋白PM26)、胁迫反应 (10%，如乙醇脱氢酶)、种子宿命和贮藏蛋白 (20%，大豆球蛋白)等蛋白在此过程中发生了变化，暗示种子萌发前期低温吸胀过程中多种代谢发生变化。细胞生长变缓、能量代谢增强、胁迫代谢蛋白的高表达以及贮藏蛋白降解速度减慢等变化都有利于种子在吸胀过程中度过低温环境，为以后的生长作好准备。