水稻G蛋白偶联受体OSGPCR1功能的研究

水稻是世界上最重要的粮食作物，也是单子叶植物的模式植物，它为全球近一半的人口提供食物，但是低温、高盐、干旱等非生物胁迫，每年都会在全世界范围内造成水稻大面积减产。G蛋白介导的信号途径是传递胞外信号比较保守的作用机制之一。动物细胞对于G蛋白及其受体(GPCRs)的研究已经取得了很大的进展。而植物细胞中对它们的研究刚刚起步。本文从越冬稻低温响应芯片上筛选到一个膜蛋白，它编码一个推测的G蛋白偶联受体(G protein-coupledreceptor, GPCR)，据此我们将其命名为OsGPCR1，并对其进行深入研究。 OsGPCR1的cDNA全长为1407bp，编码468个氨基酸，在蛋白水平上的同源性比较结果显示，该基因与动物中研究的比较多的异源三聚体G蛋白偶联受体(G Protein- Coupled Receptor)同源性达到44%。经过跨膜结构域预测表明OsGPCR1具有9TMs结构，以GFP为标签的亚细胞定位表明OsGPCR1定位在膜上。GTP酶活性测定试验表明，OsGPCR1蛋白能够激活水稻RGA的GTP酶活性，此外，以泛素裂解体系为基础的酵母双杂交实验表明，OsGPCR1能够与RGA相互作用。说明OsGPCR1编码的蛋白是水稻中的一个G蛋白偶联受体。 OsGPCR1的表达受低温、干旱、高盐的诱导，但不受ABA，GA，ACC，IAA的诱导。在『F常生长条件下，OsGPCR1在水稻各器官中均有表达，但强弱有所不同。 在拟南芥和水稻中超表达OsGPCR1都能显著增强转基因植物对干旱、高盐、低温的耐受性。而在水稻中抑制OsGPCR1的表达，转基因水稻呈现出干旱、高盐、低温的敏感性。对转基因拟南芥下游基因的分析表明，超表达OsGPCR1能够在非胁迫条件下激活CBF途径中相关基因的表达。结合OsGPCR1不受ABA诱导的表达模式，我们推测OsGPCR1可能是通过不依赖于ABA这条途径而传递信号的。借助超表达和转反义水稻材料，利用水稻全基因组芯片研究OsGPCR1靶基因的结果表明，不论OsGPCR1基因表达量的降低或上升，都导致大约30%的与转运相关的基因的表达量发生改变。这暗示OsGPCR1可能通过囊泡运输传递胞外信号。此外FM4-64对超表达和转反义水稻幼根细胞染色标记后，OsGPCR1反义抑制水稻细胞内囊泡在细胞两端呈聚集状，即形成“BFA区间”，而超表达OsGPCRI水稻细胞内囊泡呈密集状。这些结果都表明OsGPCR1可能通过调控囊泡运输而将胞外胁迫信号传递进胞内。

G蛋白在松类植物花粉管发育中的亚细胞定位及调控机制

G蛋白参与了哺乳动物内多种细胞信号途径，但其在植物花粉萌发和花粉管发育过程中的细胞学定位、生化特性及功能研究比较滞后，有关这方面的研究报道较少。在显花植物授粉受精过程中，具顶端极性生长特性的花粉管是雄性生殖单位的载体，也是研究细胞生长分子调控机理的理想体系。与被子植物相比，裸子植物具有生长周期长，花粉管生长缓慢、易分叉等特点，具有不同于被子植物花粉发育的独特发育模式。对于裸子植物花粉萌发和花粉管生长的调控机理，目前尚不十分清楚。本文以松类植物中比较有代表性的裸子植物青杆（Piceawillsonii）和白皮松(Pinus bungeana)花粉为试材，应用免疫分析和间接免疫荧光显微镜技术，结合药理学实验和FTIR手段，研究了异三聚体G蛋白和小G蛋白在花粉管细胞中的定位、生化特性及其在花粉管发育中的调控作用。结果如下： 应用Western Blotting技术和来自于抗哺乳动物中不同序列G蛋白O【亚基抗体，我们在白皮松花粉管中检测到一条分子量为40 kDa左右的蛋白。去污剂处理显示，该蛋白与质膜偶联。间接免疫荧光显微镜实验发现，在花粉管发育的整个时期，代表Ga蛋白的荧光均一的分布在整个质膜区域，尤其在尖端皮层区域荧光最亮，显示此处该蛋白浓度最高。无论是在正常发育的花粉管抑或是发生弯曲或扭曲生长的花粉管，均呈现同样的分布模式。随着花粉管发育，Ga蛋白表达量发生变化。在花粉管发育中期，Ga蛋白表达量比较高;随着花粉管离体培养时间的延长，Ga蛋白表达量下降。另外，在花粉刚刚萌发时，Ga蛋白表达量也比较低。 对白皮松花粉萌发进行的药理学实验显示，G蛋白调节剂 CTX和PTX对白皮松花粉管的影响呈现双阶段效应。当添加的药剂浓度小于400 ng mL-I时，无论CTX还是PTX均抑制了花粉萌发和花粉管生长，且花粉管容易破裂;而当二者浓度分别升至500 ng mL-I时，同对照相比，花粉管生长明显受到促进。这一结果不支持Ma等人在百合花粉中的研究结果。进一步应用FTIR技术分析发现，当用浓度为400 ng mL-I CTX或PTX处理花粉管时，花粉管细胞壁酚类物质增加，而纤维素、半纤维素、木聚糖等物质下降，这可能是导致此浓度处理下花粉管易破裂的原因。这些结果显示了G蛋白a亚基参与了白皮松花粉管生长，CTX和PTX可能通过下游对其敏感的功能蛋白而非Ga本身，影响着花粉管生长并调控着花粉管壁的建成。 利用来源于烟草的抗NtRacl抗体和拟南芥的抗ROPs抗体，应用WeternBlotting技术，我们在青杆花粉管中检测到分子量为23kDa的多肽。间接免疫荧光显微镜实验显示，在花粉萌发18和24小时后，Rac蛋白主要定位于花粉管尖端质膜区域，时而会延伸到顶端两侧区域，但从尖端到基部存在浓度梯度，这种分布模式多在花粉管发育的后期观察到。Rac蛋白在青杆花粉管不同发育时期的分布模式变化可能和花粉管的生长状态有关，在花粉管发育早期和中期，正是花粉管旺盛生长期，Rac蛋白的尖端定位保证了花粉管的极性生长。对Rac蛋白在花粉管的分布进行的连续切片扫描发现，Rac蛋白不但分布在质膜上，并与质膜偶联，而且在胞质中亦有分布。通过对一系列正常发育（即极性生长的花粉管）和畸形发育的花粉管进行观察发现，Rac蛋白主要分布在旺盛生长的花粉管尖端质膜或离顶端20 Vm处，在分叉的生长缓慢的分枝端分布较少。而在那些发生分叉生长的花粉管中，处于次要位置的基本停止生长的分枝端几乎没有Rac蛋白存在。在顶端发生膨大的花粉管中，Rac蛋白均匀分布在花粉管整个质膜上，丧失浓度梯度，失去极性生长。这些结果显示了Rac蛋白参与了青杆花粉管生长。 应用抗NtRacl抗体进行的间接免疫荧光显微镜定位实验，我们在正在生长的花粉管的管核中观察到明亮的荧光，显示了有Rac蛋白的存在。当精细胞在花粉粒中未移动到花粉管中时，几乎没有观察到荧光信号。随着花粉管发育，两个精细胞的位置发生变化，当其中一个较大的精细胞移动到花粉管中时，观察到明亮的荧光信号，这些结果显示了Rac蛋白可能参与了管核或精细胞在花粉管内的移动。

硫代硫酸钠及葡萄糖对蓝细菌Synechocystis sP.PCC6803脂及光合器组成的影响

本文通过对蓝细菌Synechocystis sp. PCC 6803在添加葡萄糖、Na2S203的BG-11培养基中的生长特性、脂类及脂肪酸组成、细胞低温荧光、色素组成进行分析测定，总结出如下规律： 当蓝细菌Synechocystis sp. PCC 6803在添加有葡萄糖的BG-11培养基中培养时细胞出现了一种新的糖脂（记为糖脂-x），在添加果糖、麦芽糖、乳糖等其它碳源的培养基中生长的细胞中也检测到糖脂-x糖脂-x的出现经推测是与活性氧相作用的产物，当在含糖的培养基中加入活性氧猝灭剂Na2S203时能有效地抑制糖脂-x的出现。糖脂一x的出现伴随着其它脂、尤其是双半乳糖甘油二酯(DGDG)的含量下降，这可能与细胞营养代谢类型的转变相适应。糖脂-x的出现使细胞适应异养生长条件，这时藻胆体(PBS)，光系统II(PSII)，光系统I(PSD降解，叶绿素消失。 糖脂-x经1H-NMR波谱术检测证实为甘油糖脂，经气质联谱分析其脂肪酸组成中含大量的枝链脂肪酸，12-甲基十四碳酸、12-甲基十五碳酸、12-甲基十六碳酸以及两种稀有的含氮脂肪酸。这些脂肪酸在添加高浓度葡萄糖的培养基中生长的．Synechocystis sp. PCC 6803中的单半乳糖甘油二酯(MGDG)也能检测到。ESI-MS以及P-SI-MS测定结果表明糖脂．x含一分子的脂酰基侧链以及两分子的己糖，半乳糖与葡萄糖。 对．Synechocystis sp. PCC 6803生长在不同浓度的葡萄糖与Na2S203培养基中脂类组成与脂肪酸组成进行比较，发现Na2S203能有效地增加膜脂中硫代异鼠李糖二酰基甘油(SQDG)和磷脂酰甘油(PG)的百分含量，培养基中同时添加葡萄糖时能抵消Na2S203的这一效应。此外，Na2S203能显著增加单半乳糖甘油二酯(MGDG)、双半乳糖甘油二酯(DGDG)中十六碳酸(C16:0)的百分含量，这一效应也能为葡萄糖恢复。Na2S203不能显著地改变SQDG中C16:0的百分含量，加入葡萄糖时能降低C16:0的百分含量。这些结果说明Na2S203可能充当一种还原剂使膜脂处于一种低的不饱和状态，同时加入葡萄糖时能降低Na2S203的还原力。此外，Na2S203还可作为SQDG合成中的硫供体。 用HPLC测定．Synechocystis sp. PCC 6803在添加不同浓度的Na2S203，葡萄糖的BG-11培养基中生长时的叶绿素与类胡萝卜素浓度，结果表明葡萄糖表现出对叶绿素与类胡萝卜素水平的抑制效应，Na2S203在低浓度时表现出对叶绿素与类胡萝卜素水平的促进效应，但在高浓度时表现出抑制效应。因此适当浓度的Na2S203的加入有利于维持蓝细菌在培养基中添加葡萄糖的生长条件下的低水平自由基，能使葡萄糖表现出促进细胞生长的特性。 通过测定Synechocystis sp. PCC 6803生长曲线中葡萄糖、Na2S203的浓度效应，结果表明葡萄糖在低浓度（例如5 mmoI.L-l）时表现出促进细胞的生长，在相对高的浓度表现出抑制细胞生长的效应。在培养基中同时加入Na2S203时可恢复葡萄糖对细胞的生长的促进效应。单独加入Na2S203表现出对细胞生长的抑制效应。这说明葡萄糖、Na2S203对细胞的生长存在着正的协同效应。

海洋小球藻Chlorella sp.甘油脂及脂肪酸、光合色素特征的研究

海洋微藻是海洋生态系统中最主要的初级生产者，也是海洋生物资源的重要来源。许多海洋微藻富含对人体具有重要的生理作用与保健功能的长链多不饱和脂肪酸，因此，筛选富含EPA、DHA等长链多不饱和脂肪酸的微藻和利用人工培养方法提高这些脂肪酸的产量是当前海洋生物学研究领域的热点之一。在本研究中，我们对被中科院海洋所定名为“Chlorella sp���（编号为1061）的一种海洋微藻的化学分类、甘油脂及其脂肪酸组成和外源葡萄糖和抗氧化剂（硫代硫酸钠）对这种微藻的脂肪酸含量的影响进行了研究，取得了以下主要结果。 海洋微藻是我固海水养殖中广泛使用的优良饵料藻。脂类物质是微藻最重要的营养指标之一，在本研究中，我们首先分析了被中科院海洋所定名为“Chlorellasp���的海洋微藻中的甘油脂及其脂肪酸种类和组成特点。结果表明，Chlorella sp.中的非极性脂主要为三脂酰甘油，极性甘油脂有10种。其中，一般培养条件下（温度23℃：光照，周期L/D14:10，强度60umolm-2-S-l）三脂酰甘油约占总脂的31 mol%，极性甘油脂约占总脂的69 rriol%。10种极性甘油脂是单半乳糖甘油二脂( monogalactosyldiacylglycerol． MGDG)、 双半乳糖甘油二脂( diagalactosyldiacylglycerol ， DGDG)、 硫代异鼠李糖甘油二脂( sulfoquinovosyldiacylglycerol，SQDG)、磷脂酰甘油(phosphatatidylglycerol，PG)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)、磷脂酰胆碱( phosphatidylcholine，PC)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)、磷脂酰丝氨醴(phosphatidylserine，Ps)、l，2-二酰基甘油-0-4，．（ⅣMⅣ-三甲基）高丝氨酸（diacylglyceryltrimethylhomoserine，DGTS）以及一种未能完全肯定，但可能是一中氯硫脂( chlorosulfolipid，CSL)。其中MGDG、DGDG、SQDG和PG是构成光合膜的主要成分，也是Chlorella sp���的主要极性脂。甜菜碱脂DGTS和磷脂PC是构成非光合膜的主要组分。Chlorella sp.中的主要脂肪酸为C16:0、C16:1耜C20：5（EPA)，后者主要存在于MGDG、DGDG和DGTS中，而三脂酰甘油也含有接近7%的EPA。 海洋微藻Chlorella sp.1061虽然被归属到绿藻纲绿藻目小球藻属，但是我们的研究表明，其色素、极性脂皮其脂肪酸组成与其它小球藻属藻类存在这很大差异Chl b是绿藻纲藻类中最主要的光合色素之一，1 6：4(n-3)和l 8：3(n-3)是绿藻微藻的主要脂肪酸，然而所有这些绿藻的特征化合物均未在Chlorella sp. 1061中检测到。DGTS和20:5(n-3)存在于很多的海洋微藻中，我们从Chlorella sp. 1061 中分离到占总极性甘油脂8 mo1%的DGTS，并从MGDG、DGDG和DGTS等极性甘油脂中检测到大量的20:5(n-3)。但是一般认为，小球藻属藻类中不舍这两种化合物。根据Chlorella sp. 1061的以上特点，这种藻不应该被归到小球藻属中。另外，由于Chlorella sp. 1061在色素、膜脂和脂肪酸组成特征方面大眼藻纲( Eustigmatophyceae)中的微绿球藻（Nannochloropsis）非常相似，因此，我们认为ChloreHa sp. 1061可能是Nannochloropsis中的一个种。但是未得到更进一步的证明和权威的认可之前，本文中我们仍然沿用ChloreHa sp,这一名称。 许多藻类中DGTS和PC -般不会同时存在，或者说一个存在时另外的一个的含量非常低。由此有人认为DGTS和PC之间存在着相互替代的关系。然而本研究中发现正常培养条件下Chlorella sp.中的DGTS和PC含量均较高（约10%）。磷处理实验结果表明，磷缺乏时Chlore Ha sp,中DGTS舍量大幅升高，而同时PC含量相应下降许多：但高浓度的磷并不能提高PC含量和降低DGTS含量，说明Chlorella sp,中DGTS仍可起替代PC的作用，然而PC可能并不能替代DGTS。Chlorella sp.中MGDG和DGTS脂肪酸组成及其位置分布结果显示，它们的组成和分布相似;在老化培养过程中MGDG和DGTS表现出周期性的相反的含量升高、降低的趋势，这进一步说明MGDG和DGTS之间存在着特殊的关系，MGDG可能合成自DGTS。 海洋微藻富含有利于人体健康的长链不饱和脂肪酸，如何提高微藻脂肪酸特别是多不饱和脂肪酸产量是目前研究的热点之一。本文首次报道了同时加入葡萄糖和硫代硫酸钠对Chlorelta sp,的生长、脂类组成和脂肪酸总产量的影响，结果显示葡萄糖和硫代硫酸钠存在明显而且强烈的互作，二者在培养液中的同时存在显著刺激了脂肪酸总产量的积累，在培养液中分别加入2.5 mM的葡萄糖和5mM的硫代硫酸钠，脂肪酸的产量可以比对照提高78%。而低浓度的葡萄糖和硫代硫酸钠对Chlorella sp.脂肪酸组成影响变化不明显，甚至在硫代硫酸钠存在下令人感兴趣的EPA含量还略有升高。显然，在Chlorella sp.培养中同时加入低浓度的葡萄糖和硫代硫酸钠是极具潜力的提高脂产量的方法，也可作为提高培养微藻其它活性物质产量借鉴的方法。在不久的将来，这种培养方法很可能发展成为生产实践中提高Chlore sp���乃至其它微藻脂肪酸、EPA和其它活性物质产量的经济有效的新途径。